Name: dissecting mechanoenzymatic properties of processive myosins with ultrafast force-clamp spectroscopy
Uploaded: 2021-07-01T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door het Horizon 2020-onderzoeks- en innovatieprogramma van de Europese Unie in het kader van subsidieovereenkomst nr. 871124 Laserlab-Europe, door het Italiaanse ministerie van Universiteit en Onderzoek (FIRB "Futuro in Ricerca" 2013 Grant No. RBFR13V4M2) en door Ente Cassa di Risparmio di Firenze. A.V. Kashchuk werd ondersteund door Human Frontier Science Program Cross-Disciplinary Fellowship LT008/2020-C.

1. Optische installatie
OPMERKING: De experimentele opstelling bestaat uit een dubbel optisch pincet met nanometer richtstabiliteit en < 1% laserintensiteitsfluctuaties. Onder deze omstandigheden wordt de stabiliteit van de halter op nanometerniveau gegarandeerd onder typische valstijfheid (0,1 pN / nm) en spanning (1 pN - enkele tientallen pN). Figuur 2 toont een gedetailleerd schema van de optische opstelling.
<ol><li>Ontwerp en constructie van een optisch pin...

<ol>
	<li>Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+a+single-beam+gradient+force+optical+trap+for+dielectric+particles.">Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles.</a> Optical Angular Momentum. 11 (5), 196-198 (2016).</li><li>Capitanio, M., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+biology+with+force:+Single+molecule+high-resolution+measurements+with+optical+tweezers.">Interrogating biology with force: Single molecule high-resolution measurements with optical tweezers.</a> Biophysical Journal. 105 (6), 1293-1303 (2013).</li><li>Capitanio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+force-clamp+spectroscopy+of+single+molecules+reveals+load+dependence+of+myosin+working+stroke.">Ultrafast force-clamp spectroscopy of single molecules reveals load dependence of myosin working stroke.</a> Nature Methods. 9 (10), 1013-1019 (2012).</li><li>Gardini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+myosin-5B+mechanosensitivity+and+calcium+regulation+at+the+single+molecule+level.">Dissecting myosin-5B mechanosensitivity and calcium regulation at the single molecule level.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li><li>Woody, M. S., Winkelmann, D. A., Capitanio, M., Ostap, E. M., Goldman, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+mechanics+resolves+the+earliest+events+in+force+generation+by+cardiac+myosin.">Single molecule mechanics resolves the earliest events in force generation by cardiac myosin.</a> eLife. 8, 49266 (2019).</li><li>Clemen, A. E. -. M., Vilfan, M., Jaud, J., Zhang, J., B&#228;, M., Rief, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-dependent+stepping+kinetics+of+myosin-V.">Force-dependent stepping kinetics of myosin-V.</a> Biophysical Journal. 88, 4402-4410 (2005).</li><li>Howard, J., Hancock, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+beads+are+better+than+one.">Three beads are better than one.</a> Biophysical Journal. 118 (1), 1-3 (2020).</li><li>Pyrpassopoulos, S., Shuman, H., Ostap, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+kinesin's+load-bearing+capacity+by+force+geometry+and+the+microtubule+track.">Modulation of kinesin's load-bearing capacity by force geometry and the microtubule track.</a> Biophysical Journal. 118 (1), 243-253 (2020).</li><li>Capitanio, M., Maggi, D., Vanzi, F., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FIONA+in+the+trap:+The+advantages+of+combining+optical+tweezers+and+fluorescence.">FIONA in the trap: The advantages of combining optical tweezers and fluorescence.</a> Journal of Optics A: Pure and Applied Optics. 9 (8), 157 (2007).</li><li>Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Position+control+and+optical+manipulation+for+nanotechnology+applications.">Position control and optical manipulation for nanotechnology applications.</a> European Physical Journal B. 46 (1), 1-8 (2005).</li><li>Capitanio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Optical Tweezers. An introduction to Single Molecule Biophysics. , (2017).</li><li>Capitanio, M., Cicchi, R., Saverio Pavone, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+and+time-shared+multiple+optical+tweezers+for+the+study+of+single+motor+proteins.">Continuous and time-shared multiple optical tweezers for the study of single motor proteins.</a> Optics and Lasers in Engineering. 45 (4), 450-457 (2007).</li><li>Gardini, L., Tempestini, A., Pavone, F. S., Capitanio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+optical+tweezers+for+the+study+of+single+molecular+motors.">High-speed optical tweezers for the study of single molecular motors.</a> Methods in Molecular Biology. 1805, (2018).</li><li>Capitanio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calibration+of+optical+tweezers+with+differential+interference+contrast+signals.">Calibration of optical tweezers with differential interference contrast signals.</a> Review of Scientific Instruments. 73 (4), 1687 (2002).</li><li>Monico, C., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S., Capitanio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+single-molecule+manipulation+and+imaging+for+the+study+of+protein-DNA+interactions.">Combining single-molecule manipulation and imaging for the study of protein-DNA interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. (90), e51446 (2014).</li><li>Greenberg, M. J., Lin, T., Goldman, Y. E., Shuman, H., Ostap, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+IC+generates+power+over+a+range+of+loads+via+a+new+tension-sensing+mechanism.">Myosin IC generates power over a range of loads via a new tension-sensing mechanism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), 2433-2440 (2012).</li><li>Gardini, L., Arbore, C., Capitanio, M., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+single+molecule+imaging+and+tracking+of+processive+myosin+motors.">A protocol for single molecule imaging and tracking of processive myosin motors.</a> MethodsX. 6, 1854-1862 (2019).</li><li>Ramaiya, A., Roy, B., Bugiel, M., Sch&#228;ffer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+rotates+unidirectionally+and+generates+torque+while+walking+on+microtubules.">Kinesin rotates unidirectionally and generates torque while walking on microtubules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (41), 10894-10899 (2017).</li></ol>

Hoewel technieken met één molecuul, zoals de drie-kralentest, technisch uitdagend en een lage doorvoersnelheid hebben, verbetert UFFCS de detectie van moleculaire interacties dankzij de hoge signaal-ruisverhouding van de gegevens. UFFCS maakt de studie van de belastingsafhankelijkheid van motoreiwitten mogelijk, met als belangrijkste voordelen dat de kracht zeer snel wordt uitgeoefend bij binding van de motor aan het filament om vroege en zeer snelle gebeurtenissen in krachtproductie en zwakke bindingstoestanden onder ...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62388">Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy</a>. The title was updated.
The title was updated from:
Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy
to:
Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62388">Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy</a>. The title was updated.

Erratum: Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy

In de afgelopen decennia zijn optische pincetten een waardevol hulpmiddel geweest om de mechanochemie van eiwitinteracties op het niveau van één molecuul op te helderen, vanwege de opvallende mogelijkheid van gelijktijdige manipulatie en meting van conformatieveranderingen en enzymatische kinetiek 1,2. In het bijzonder het vermogen om krachten toe te passen en te meten in het bereik van die uitgeoefend door moleculaire motoren in de cel, samen met de capaciteit om conformatieveranderingen van subnanometer te meten, maakte optische pincetten een uniek hulpmiddel met één molecuul voor het ontrafelen van de chemomechanische eigenschappen van motoreiwitten en hun mechanische regulatie.
Ultrasnelle krachtklemspectroscopie (UFFCS) is een krachtspectroscopietechniek met één molecuul op basis van een optisch pincet, ontwikkeld om de snelle kinetiek van moleculaire motoren onder belasting te bestuderen in een geometrie met drie kralen (figuur 1a)3,4. UFFCS vermindert de tijdsvertraging voor krachttoediening op het motoreiwit tot de fysieke limiet van een optisch pincet, d.w.z. de mechanische ontspanningstijd van het systeem, waardoor de kracht snel na het begin van een myosinerun kan worden uitgeoefend (enkele tientallen microseconden)3. Dit vermogen is gebruikt om de vroege mechanische gebeurtenissen in snelle skelet 3 en cardiale5 spiermyosine te onderzoeken om de belastingsafhankelijkheid van de powerstroke, de zwakke en sterk bindende toestanden, evenals de volgorde van biochemische (Pi) en mechanische (powerstroke) gebeurtenissen te onthullen.
De drie-kralengeometrie wordt meestal gebruikt om niet-processieve motoren te bestuderen, een enkele kraalgeometrie met een krachtklem is vaak gebruikt om processieve niet-conventionele myosines zoals myosine Va6 te onderzoeken. Er zijn echter verschillende redenen om de voorkeur te geven aan een UFFCS-test met drie kralen, ook voor processieve myosines. Ten eerste maakt de snelle toepassing van belasting direct na actine-myosinebinding de meting mogelijk van de vroege gebeurtenissen in krachtontwikkeling zoals in niet-processieve motoren. Bovendien maakt het in het geval van processieve motoren ook een nauwkeurige meting van de looplengtes en looptijden van de motor onder constante kracht gedurende hun hele progressie mogelijk (figuur 1b). Bovendien kan het systeem door de hoge snelheid van de force feedback de kracht constant houden tijdens snelle positiewisselingen, zoals de myosine werkslag, waardoor een constante belasting tijdens het stappen van de motor wordt gegarandeerd. De hoge temporele resolutie van het systeem maakt de detectie van sub-ms-interacties mogelijk, waardoor de mogelijkheid ontstaat om zwakke binding van myosine aan actine te onderzoeken. Ten slotte garandeert de testgeometrie dat de kracht wordt uitgeoefend langs de actinefilament, met verwaarloosbare dwarse en verticale componenten van de kracht. Dit punt is van bijzonder belang omdat is aangetoond dat de verticale krachtcomponent de belastingsafhankelijkheid van de motorkinetiek aanzienlijk beïnvloedt 7,8. Door deze techniek te gebruiken, konden we een reeks ondersteunende en resistieve belastingen toepassen op processieve myosine-5B en direct de belastingsafhankelijkheid van zijn processiviteit meten voor een breed scala aan krachten4.
Zoals te zien is in figuur 1a, wordt in dit systeem een enkel actinefilament opgehangen tussen twee polystyreenparels die vastzitten in de focus van een dubbel optisch pincet (de "dumbbell"). Een onevenwichtige nettokracht F = F1-F 2 wordt opgelegd aan de gloeidraad, door middel van een snel feedbacksysteem, waardoor het filament met constante snelheid in één richting beweegt totdat het een door de gebruiker gedefinieerd inversiepunt bereikt waar de nettokracht in de tegenovergestelde richting wordt omgekeerd. Wanneer het motoreiwit geen interactie heeft met het filament, is de halter vrij om heen en weer te bewegen in een driehoekige golfvorm (figuur 1b, onderste paneel) over de voetstukkraal waarop een enkel motoreiwit is bevestigd. Zodra de interactie is vastgesteld, wordt de kracht die door de halter wordt gedragen zeer snel overgebracht naar het motoreiwit en begint de motor het filament te verdringen door onder de krachtintensiteit en richting te stappen die door het feedbacksysteem werd toegepast op het moment van de interactie, totdat myosine loskomt van actine. Omdat de verplaatsing die wordt geproduceerd door het stappen van de motor afhankelijk is van de polariteit van de ingesloten actinefilament, kan de belasting volgens de richting van de uitgeoefende kracht ofwel ondersteunend zijn, d.w.z. duwen in dezelfde richting van de motorverplaatsing (duw in figuur 1b bovenpaneel), of resistief, d.w.z. trekken in de tegenovergestelde richting ten opzichte van de motorverplaatsing (trek in figuur 1b bovenste paneel) waardoor het mogelijk is om de chemomechanische regulatie van de motorische processiviteit te bestuderen door zowel de intensiteit als de directionaliteit van de uitgeoefende belasting.
In de volgende secties worden alle stappen voor het meten van actine-myosine-5B-interacties onder verschillende belastingen met een ultrasnelle krachtklemspectroscopie-opstelling volledig beschreven, inclusief 1) het instellen van de optische opstelling, optische vallenuitlijning en kalibratieprocedures, 2) de preparaten van alle componenten en hun assemblage in de monsterkamer, 3) de meetprocedure, 4) representatieve gegevens en gegevensanalyse om belangrijke fysische parameters te extraheren, zoals de looplengte, de stapgrootte en de snelheid van het motoreiwit.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;Aliphatic Amine Latex Beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A37362</td>
			<td>1.0-&#956;m diameter, 2% (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin polymerization buffer</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>BSA02</td>
			<td>10X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AODs (acousto-optic deflectors)</td>
			<td>AA Opto Electronic</td>
			<td>DTS-XY 250</td>
			<td>Laser beam deflectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated-BSA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>29130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calmodulin from porcine brain (CaM)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>208783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase from bovine liver</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Condenser</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>OlympusU-AAC, Aplanat, Achromat</td>
			<td>NA 1.4, oil immersion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine phosphate disodium salt tetrahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>27920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine Phosphokinase from rabbit muscle</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDs</td>
			<td>AA Opto Electronic</td>
			<td>AA.DDS.XX</td>
			<td>Two-channel digital synthesizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DTT)/td&#62;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-actin protein</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>AKL99</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase from Aspergillus niger</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;G7141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaloTag succinimidyl ester O2 ligand</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High vacuum silicone grease heavy</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>107921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4/K2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5379/ P8281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labview</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>version 8.1</td>
			<td>Data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labview FPGA module</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>version 8.1</td>
			<td>Fast Force-Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>2016</td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>63020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Plan-Apo 60X</td>
			<td>NA 1.2, WD 0.2 mm, water imm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N8267</td>
			<td>0.45 pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentyl acetate solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>46022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pure Ethanol</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>2860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QPDs</td>
			<td>UDT</td>
			<td>DLS-20</td>
			<td>D Position Detecto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine BSA</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A23016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine Phalloidin</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>P1951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica beads</td>
			<td>Bangslabs</td>
			<td>SS04N</td>
			<td>1.21 mm, 10% solids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin protein</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>189730</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissecting mechanoenzymatic properties of processive myosins with ultrafast force-clamp spectroscopy

Ultrasnelle force-clamp spectroscopie (UFFCS) is een techniek met één molecuul op basis van een laserpincet die het onderzoek mogelijk maakt naar de chemomechanica van zowel conventionele als onconventionele myosinen onder belasting met een ongekende tijdresolutie. Met name de mogelijkheid om myosinemotoren onder constante kracht te onderzoeken direct na de vorming van de actine-myosinebinding, samen met de hoge snelheid van de force feedback (200 kHz), heeft aangetoond dat UFFCS een waardevol hulpmiddel is om de belastingsafhankelijkheid van snelle dynamiek zoals de myosine-werkslag te bestuderen. Bovendien maakt UFFCS de studie mogelijk van hoe processieve en niet-processieve myosine-actine interacties worden beïnvloed door de intensiteit en richting van de toegepaste kracht.
Door dit protocol te volgen, zal het mogelijk zijn om ultrasnelle krachtklemexperimenten uit te voeren op processieve myosine-5-motoren en op een verscheidenheid aan onconventionele myosines. Door enkele aanpassingen zou het protocol ook gemakkelijk kunnen worden uitgebreid naar de studie van andere klassen van processieve motoren zoals kinesines en dyneinen. Het protocol omvat alle noodzakelijke stappen, van de opstelling van het experimentele apparaat tot monstervoorbereiding, kalibratieprocedures, gegevensverzameling en analyse.

Representatieve gegevens bestaan uit positierecords in de loop van de tijd, zoals weergegeven in figuur 4. In het positierecord zijn twee soorten verplaatsing zichtbaar. Ten eerste, wanneer de myosinemotor geen interactie heeft met het actinefilament, bewegen de gevangen kralen met constante snelheid tegen de viskeuze weerstandskracht van de oplossing met een lineaire verplaatsing die oscilleert binnen het oscillatiebereik dat door de operator is ingesteld in een driehoekige golf<sup class="...

Watch this Scientific Journal Video about Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy at JoVE.com

Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy

Hier wordt een uitgebreid protocol gepresenteerd om ultrasnelle krachtklemexperimenten uit te voeren op processieve myosine-5-motoren, die gemakkelijk kunnen worden uitgebreid naar de studie van andere klassen processieve motoren. Het protocol beschrijft alle noodzakelijke stappen, van de opstelling van het experimentele apparaat tot monstervoorbereiding, gegevensverzameling en analyse.

Het ontleden van mechano-enzymatische eigenschappen van processieve myosinen met ultrasnelle krachtklemspectroscopie

Ultrafast force-clamp spectroscopy (UFFCS) is a single molecule technique based on laser tweezers that allows the investigation of the chemomechanics of ...

Ultrasnelle krachtklemspectroscopie is een techniek met één molecuul op basis van een laserpincet die het mogelijk maakt om de chemomechanica van myosinenmotoren onder belasting met de hoogste tijdresolutie te onderzoeken. Deze techniek maakt het mogelijk om zeer snelle gebeurtenissen in de krachtproductie te onderzoeken door de kracht constant te houden tijdens elke fase van de motorische interactie met volledige controle over de richting van de kracht. Door de juiste aanpassingen aan te brengen, kan dit protocol gemakkelijk worden toegepast op andere soorten processieve motoren, waaronder kinesines en dyneinen, om de regulatie met geweld bloot te leggen.Nadat u een set acousto-optische deflectoren op een lineaire vertaler hebt gemonteerd, neemt u een iris en past u het diafragma aan de grootte van het diafragma terug van het objectief aan. Vervang het objectief door de iris gecentreerd op de behuizing van het schroefdraadobject. Verplaats de vertaler naar de laserstraal totdat het deel van de straal dat door het piëzokristal wordt geblokkeerd zichtbaar is na de iris, en draai de vertaler iets naar achteren totdat de straal de irisopening volledig vult.Om silicaparels in pentylacetaat te bereiden, verdunt u eerst 20 microliter 1,2 micron 10% vaste silicakorrels in 1-1,5 milliliter aceton met vortexing en 30 seconden ultrasoonapparaat. Na het ultrasoonapparaat verzamel je de kralen door centrifugeren en resuspenseer je de kraalkorrel in 1 milliliter verse aceton voor een tweede wasbeurt. Was na de tweede acetonwassing de kralen drie keer in 1 milliliter vers pentylacetaat per wasbeurt onder dezelfde centrifugatieomstandigheden en resuspenseer de pellet in 100 microliter van 1% nitrocellulose en 900 microliter pentylacetaat.Gebruik vervolgens een zuiver met ethanol doordrenkt stuk laboratoriumweefsel om voorzichtig een glazen afdeksel van 24 x 24 millimeter af te vegen voordat u een schoon pincet gebruikt om het glas direct in de ethanol te spoelen en de coverslip te laten drogen onder een zachte stikstofstroom. Vortex en soniceer de voorbereide silicaparelvoorraad gedurende 30 seconden en gebruik een ethanol-gereinigde 24 x 60 millimeter coverslip om 2 microliter silicakraaloplossing op het oppervlak van de kleinere coverslip te smeren. Terwijl de kralen drogen, reinigt u een dia van 26 x 76 millimeter zoals gedemonstreerd en plaatst u twee 60-100 micron dikke lijnen van 3 millimeter dubbelzijdig geplakt op de lange randen van de dia.Plaats met een schoon pincet de met kralen gecoate afdeksel op de tape met de kralen naar de binnenkant van de schuifkamer en vul de kamer met 15 millimolar fosfaatbuffer en zwevende polystyreenkraaloplossing. Sluit vervolgens de kamer af met siliciumvet. Om de pixel-nanometerverhouding van de brightfield-camera te kalibreren, verwerft u een eerste afbeelding van een silicakraal op het coverslipoppervlak op ongeveer 5 micron van het midden van het gezichtsveld.Verplaats het werkgebied om de kraal 10 micron naar het midden van het gezichtsveld te verplaatsen en maak een tweede afbeelding. Bereken de kalibratieconstante van de camera door de pixelafstand tussen twee posities van de kraal te meten. Om de valpositie te kalibreren, vangt u een enkel zwevend deeltje in één val en verplaatst u de acousto-optische deflectoren in stappen van 0,2 megahertz, waardoor een beeld van het deeltje en de bijbehorende frequentie van de deflectoren voor elke stap wordt verkregen.Herhaal vervolgens de kalibratie voor de tweede val op dezelfde manier. Om het valvermogen en de stijfheid te kalibreren, vangt u een enkel deeltje in elke val en verdringt u beide vallen met behulp van de acousto-optische deflectoren in stappen van 0,2 megahertz, waarbij een Brownse beweging van het deeltje in beide vallen wordt geregistreerd met Quadrant Photodiode Detectors en de overeenkomstige frequentie van de acousto-optische deflectoren. Verkrijg kalibratieconstanten door een Lorentziaanse functie aan te passen aan een vermogensspectrum van de geregistreerde Brownse beweging.Om een monster voor meting samen te stellen, voegt u 1 milligram per milliliter gebiotinyleerd BSA toe aan een nieuwe kamer met silicaparels op het oppervlak van de coverslip. Was na 5 minuten de kamer met AB-buffer en voeg 1 milligram per milliliter streptavidin toe aan de kamer. Was na 5 minuten de kamer zoals gedemonstreerd en voeg 3 nanomolaire gebiotinyleerde Myosine-5B zware meromyosine toe in M5B buffer aangevuld met 2 micromolaire Calmodulin.Was de kamer na 5 minuten drie keer met 1 milligram per milliliter gebiotinyleerd BSA aangevuld met 2 micromolaire Calmodulin in AB-buffer en wacht 3 minuten na de laatste wasbeurt. Laat het reactiemengsel stromen en sluit de kamer af met siliciumvet. Om het monster te meten, plaatst u de kamer op het microscoopstadium en verplaatst u het objectief totdat de zwevende alfa-actininekorrels in focus zijn.Schakel één val in en vang één kraal. Zodra de eerste val bezet is, verplaatst u de vertaler om de gevangen kraal dicht bij het oppervlak van de coverslip te plaatsen om te voorkomen dat meerdere kralen worden gevangen en een kraal in de tweede val vangen. Verplaats het monster door de langeafstandsvertalers om actinefilamenten van ten minste 5 micron lang in de oplossing te lokaliseren.Wanneer een gloeidraad is gespot, verplaatst u het monster om een gevangen kraal het ene uiteinde van het filament te laten naderen. Zodra het filament is bevestigd, past u de afstand van de kraal aan de geschatte filamentlengte aan en verplaatst u het podium om een stroom in de ongebonden kraalrichting te creëren. Het filament wordt uitgerekt door de stroom en bindt uiteindelijk aan de tweede kraal.Het resulterende complex wordt een halter genoemd"Om actine-myosinecontact tot stand te brengen, scheidt u de twee vallen voorzichtig en stelt u het filament in op pretentieniveaus tot ongeveer 3 piconewton. Om de stijfheid van de halter te onderzoeken, laat u één val oscilleren in een driehoeksgolf door de frequentie van één acousto-optische deflector te veranderen en de daaruit voortvloeiende overdracht van de beweging naar de achtergebleven kraal via zijn positiesignaal te verifiëren. Verplaats het podium om de halter in de nabijheid van een silicakraal op voetstuk te plaatsen en pas de hoogte van de dumbbell aan zodat het actinefilament in contact komt met het silicakraaloppervlak.Zoals waargenomen in dit representatieve positierecord, wanneer de myosinemotor geen interactie heeft met het actinefilament, bewegen de gevangen kralen met een constante snelheid tegen de viskeuze weerstandskracht van de oplossing. Zodra de myosinemotor begint te interageren met het filament, wordt de kracht die door het bewegende filament wordt gedragen zeer snel overgebracht naar het eiwit en daalt de systeemsnelheid tot nul, waarbij de stapgebeurtenissen onder constante kracht plaatsvinden tot het einde van de run. De kracht wordt overgeschakeld van de positieve naar de negatieve richting door het feedbacksysteem, dat de krachtrichting verandert wanneer de kraal de rand van het oscillatiebereik bereikt dat door de gebruiker is ingesteld.Wanneer de myosine bindt en het filament in de positieve richting verplaatst, duwt het de kraal naar de bovenrand van het oscillatiebereik. Als dit onder ondersteunende kracht gebeurt, wordt de run van de myosine onderbroken door de krachtrichtinginversie aan de oscillatierand, waardoor de lengte van de run wordt beperkt tot de amplitude van de halteroscillatie. Nauwkeurige uitlijning van het optische systeem is noodzakelijk om de optimale ruimtelijke en temporele resolutie te bereiken, terwijl een nauwkeurige kalibratie noodzakelijk is om de waarden van de uitgeoefende krachten nauwkeurig te bepalen.Deze techniek is aangepast om het glijden en gericht zoeken naar transcriptiefactoren in DNA te bestuderen, evenals dynamische interacties tussen mechanotransductie-eiwitten die over microtubule-filamenten worden getransporteerd.

Research

JoVE Journal

Biology

Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

Ontleden en opnemen van The C. Elegans neuromusculaire junctie

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale.   This ...

Dissecting the Non-human Primate Brain in Stereotaxic Space

Het ontleden van de niet-humane primaten Brain in stereotaxische Space

The use of non-human primates provides an excellent translational model for our understanding of developmental and aging processes in humans1-6. In ...

The Gateway to the Brain: Dissecting the Primate Eye

De poort naar de hersenen: Ontrafeling van de Primate Eye

The visual system in humans is considered the  gateway  to the world and plays a principal role in the plethora of sensory, perceptual and cognitive ...

Exploring Cognitive Functions in Babies, Children &amp; Adults with Near Infrared Spectroscopy

Exploring Cognitive Functions in Babies, Children & Adults with Near Infrared Spectroscopy

Het verkennen van cognitieve functies bij baby&#39;s, Kinderen &amp; Volwassenen met Near Infrared Spectroscopy

An explosion of functional Near Infrared Spectroscopy (fNIRS) studies investigating cortical activation in relation to higher cognitive processes, such as ...

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

Het beoordelen van Signalering Eigenschappen van ectodermale epitheel Tijdens craniofaciale ontwikkeling

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue ...

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procedures voor Rat<em&gt; In situ</em&gt; Skeletspier contractiele eigenschappen

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

De combinatie van Single-molecule Manipulatie en Imaging voor de Studie van eiwit-DNA interacties

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase (ERK) Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase ERK Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Photostimulatie door Femtosecond Laser activeert extracellulaire-Signal-gereguleerde kinase (ERK) signalering of mitochondriale gebeurtenissen in doelcellen

Direct control of cellular defined molecular events is important to life science. Recently, studies have demonstrated that femtosecond laser stimulation ...

Quantification of Cellular Densities and Antigenic Properties using Magnetic Levitation

Kwantificering van cellulaire dichtheden en antigene eigenschappen met behulp van magnetische levitatie

The described method was developed based on the principles of magnetic levitation, which separates cells and particles based on their density and magnetic ...

Detection of Protein Aggregation using Fluorescence Correlation Spectroscopy

Detectie van eiwitaggregatie met behulp van fluorescentiecorrelatiespectroscopie

Protein aggregation is a hallmark of neurodegenerative disorders such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Alzheimer's disease (AD), Parkinson's ...