Name: dissecting mechanoenzymatic properties of processive myosins with ultrafast force-clamp spectroscopy
Uploaded: 2021-07-01T13:30:00
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Diese Arbeit wurde durch das Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Finanzhilfevereinbarung Nr. 871124 Laserlab-Europe, durch das italienische Ministerium für Universität und Forschung (FIRB "Futuro in Ricerca" 2013 Grant No. RBFR13V4M2) und durch die Ente Cassa di Risparmio di Firenze unterstützt. A.V. Kashchuk wurde vom Human Frontier Science Program Cross-Disciplinary Fellowship LT008/2020-C unterstützt.

1. Optischer Aufbau
HINWEIS: Der Versuchsaufbau besteht aus einer doppelten optischen Pinzette mit Nanometer-Ausrichtungsstabilität und < 1% Laserintensitätsschwankungen. Unter diesen Bedingungen ist die Stabilität der Hantel auf Nanometerebene unter typischer Fallensteifigkeit (0,1 pN/nm) und Spannung (1 pN - einige zehn pN) gewährleistet. Abbildung 2 zeigt ein detailliertes Schema des optischen Aufbaus.
<ol><li>Design und Konstrukt...

<ol>
	<li>Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+a+single-beam+gradient+force+optical+trap+for+dielectric+particles.">Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles.</a> Optical Angular Momentum. 11 (5), 196-198 (2016).</li><li>Capitanio, M., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+biology+with+force:+Single+molecule+high-resolution+measurements+with+optical+tweezers.">Interrogating biology with force: Single molecule high-resolution measurements with optical tweezers.</a> Biophysical Journal. 105 (6), 1293-1303 (2013).</li><li>Capitanio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+force-clamp+spectroscopy+of+single+molecules+reveals+load+dependence+of+myosin+working+stroke.">Ultrafast force-clamp spectroscopy of single molecules reveals load dependence of myosin working stroke.</a> Nature Methods. 9 (10), 1013-1019 (2012).</li><li>Gardini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+myosin-5B+mechanosensitivity+and+calcium+regulation+at+the+single+molecule+level.">Dissecting myosin-5B mechanosensitivity and calcium regulation at the single molecule level.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li><li>Woody, M. S., Winkelmann, D. A., Capitanio, M., Ostap, E. M., Goldman, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+mechanics+resolves+the+earliest+events+in+force+generation+by+cardiac+myosin.">Single molecule mechanics resolves the earliest events in force generation by cardiac myosin.</a> eLife. 8, 49266 (2019).</li><li>Clemen, A. E. -. M., Vilfan, M., Jaud, J., Zhang, J., B&#228;, M., Rief, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-dependent+stepping+kinetics+of+myosin-V.">Force-dependent stepping kinetics of myosin-V.</a> Biophysical Journal. 88, 4402-4410 (2005).</li><li>Howard, J., Hancock, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+beads+are+better+than+one.">Three beads are better than one.</a> Biophysical Journal. 118 (1), 1-3 (2020).</li><li>Pyrpassopoulos, S., Shuman, H., Ostap, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+kinesin's+load-bearing+capacity+by+force+geometry+and+the+microtubule+track.">Modulation of kinesin's load-bearing capacity by force geometry and the microtubule track.</a> Biophysical Journal. 118 (1), 243-253 (2020).</li><li>Capitanio, M., Maggi, D., Vanzi, F., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FIONA+in+the+trap:+The+advantages+of+combining+optical+tweezers+and+fluorescence.">FIONA in the trap: The advantages of combining optical tweezers and fluorescence.</a> Journal of Optics A: Pure and Applied Optics. 9 (8), 157 (2007).</li><li>Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Position+control+and+optical+manipulation+for+nanotechnology+applications.">Position control and optical manipulation for nanotechnology applications.</a> European Physical Journal B. 46 (1), 1-8 (2005).</li><li>Capitanio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Optical Tweezers. An introduction to Single Molecule Biophysics. , (2017).</li><li>Capitanio, M., Cicchi, R., Saverio Pavone, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+and+time-shared+multiple+optical+tweezers+for+the+study+of+single+motor+proteins.">Continuous and time-shared multiple optical tweezers for the study of single motor proteins.</a> Optics and Lasers in Engineering. 45 (4), 450-457 (2007).</li><li>Gardini, L., Tempestini, A., Pavone, F. S., Capitanio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+optical+tweezers+for+the+study+of+single+molecular+motors.">High-speed optical tweezers for the study of single molecular motors.</a> Methods in Molecular Biology. 1805, (2018).</li><li>Capitanio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calibration+of+optical+tweezers+with+differential+interference+contrast+signals.">Calibration of optical tweezers with differential interference contrast signals.</a> Review of Scientific Instruments. 73 (4), 1687 (2002).</li><li>Monico, C., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S., Capitanio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+single-molecule+manipulation+and+imaging+for+the+study+of+protein-DNA+interactions.">Combining single-molecule manipulation and imaging for the study of protein-DNA interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. (90), e51446 (2014).</li><li>Greenberg, M. J., Lin, T., Goldman, Y. E., Shuman, H., Ostap, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+IC+generates+power+over+a+range+of+loads+via+a+new+tension-sensing+mechanism.">Myosin IC generates power over a range of loads via a new tension-sensing mechanism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), 2433-2440 (2012).</li><li>Gardini, L., Arbore, C., Capitanio, M., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+single+molecule+imaging+and+tracking+of+processive+myosin+motors.">A protocol for single molecule imaging and tracking of processive myosin motors.</a> MethodsX. 6, 1854-1862 (2019).</li><li>Ramaiya, A., Roy, B., Bugiel, M., Sch&#228;ffer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+rotates+unidirectionally+and+generates+torque+while+walking+on+microtubules.">Kinesin rotates unidirectionally and generates torque while walking on microtubules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (41), 10894-10899 (2017).</li></ol>

Obwohl Einzelmolekültechniken, wie der Drei-Perlen-Assay, technisch anspruchsvoll sind und einen geringen Durchsatz haben, verbessert UFFCS die Detektion molekularer Wechselwirkungen dank des hohen Signal-Rausch-Verhältnisses der Daten. UFFCS ermöglicht die Untersuchung der Lastabhängigkeit von Motorproteinen mit den Hauptvorteilen, dass die Kraft bei der Bindung des Motors an das Filament sehr schnell angewendet wird, um frühe und sehr schnelle Ereignisse in der Krafterzeugung und schwache Bindungszustände unter k...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62388">Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy</a>. The title was updated.
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Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy
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Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy

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Erratum: Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy

In den letzten Jahrzehnten waren optische Pinzetten ein wertvolles Werkzeug, um die Mechanochemie von Proteininteraktionen auf Einzelmolekülebene aufzuklären, da sie die Möglichkeit der gleichzeitigen Manipulation und Messung von Konformationsänderungen und enzymatischer Kinetik auffallen lassen 1,2. Insbesondere die Fähigkeit, Kräfte im Bereich molekularer Motoren in der Zelle aufzubringen und zu messen, sowie die Fähigkeit, Konformationsänderungen im Sub-Nanometer-Bereich zu messen, machten optische Pinzetten zu einem einzigartigen Einzelmolekülwerkzeug, um die chemomechanischen Eigenschaften von Motorproteinen und deren mechanische Regulation zu entschlüsseln.
Die Ultrakurzzeit-Kraftklemmenspektroskopie (UFFCS) ist eine Einzelmolekül-Kraftspektroskopie-Technik, die auf optischen Pinzetten basiert und entwickelt wurde, um die schnelle Kinetik molekularer Motoren unter Last in einer Drei-Perlen-Geometrie zu untersuchen (Abbildung 1a)3,4. UFFCS reduziert die Zeitverzögerung für die Krafteinleitung auf das Motorprotein auf die physikalische Grenze einer optischen Pinzette, d.h. die mechanische Relaxationszeit des Systems, und ermöglicht so die schnelle Anwendung der Kraft nach Beginn eines Myosinlaufs (einige zehn Mikrosekunden)3. Diese Fähigkeit wurde genutzt, um die frühen mechanischen Ereignisse im schnellen Skelett-3- und Herz-5-Muskelmyosin zu untersuchen, um die Lastabhängigkeit des Powerstrokes, die schwachen und starken Bindungszustände sowie die Reihenfolge der biochemischen (Pi) und mechanischen (Powerstroke) Ereignisse aufzudecken.
Die Drei-Perlen-Geometrie wird normalerweise verwendet, um nicht-prozessive Motoren zu untersuchen, eine einzelne Perlengeometrie mit einer Kraftklemme wurde häufig verwendet, um prozessive nicht-konventionelle Myosine wie Myosin Va6 zu untersuchen. Es gibt jedoch mehrere Gründe, einen Drei-Perlen-UFFCS-Assay auch für prozessive Myosine zu bevorzugen. Erstens ermöglicht das schnelle Anlegen von Lasten direkt nach der Aktin-Myosin-Bindung die Messung der frühen Ereignisse in der Kraftentwicklung wie bei nicht-prozessiven Motoren. Darüber hinaus ermöglicht es bei prozessiven Motoren auch eine genaue Messung der Lauflängen und der Laufdauer des Motors bei konstanter Kraft während des gesamten Verlaufs (Abbildung 1b). Darüber hinaus kann das System aufgrund der hohen Rate der Kraftrückkopplung die Kraft bei schnellen Positionsänderungen, wie z. B. dem Myosin-Arbeitshub, konstant halten und so eine konstante Belastung während des Motorschritts gewährleisten. Die hohe zeitliche Auflösung des Systems ermöglicht die Detektion von Sub-ms-Wechselwirkungen und eröffnet die Möglichkeit, die schwache Bindung von Myosin an Aktin zu untersuchen. Schließlich garantiert die Assay-Geometrie, dass die Kraft entlang des Aktinfilaments aufgebracht wird, mit vernachlässigbaren transversalen und vertikalen Komponenten der Kraft. Dieser Punkt ist von besonderer Relevanz, da gezeigt wurde, dass die vertikale Kraftkomponente die Lastabhängigkeit der Motorkinetiksignifikant beeinflusst 7,8. Mit dieser Technik konnten wir eine Reihe von assistiven und resistiven Lasten auf prozessives Myosin-5B anwenden und die Lastabhängigkeit seiner Prozessivität für einen weiten Bereich von Kräftendirekt messen 4.
Wie in Abbildung 1a gezeigt, ist in diesem System ein einzelnes Aktinfilament zwischen zwei Polystyrolkügelchen aufgehängt, die im Fokus einer doppelten optischen Pinzette (der "Hantel") gefangen sind. Eine unausgeglichene Nettokraft F = F1-F 2 wird durch ein schnelles Rückkopplungssystem auf das Filament ausgeübt, wodurch sich das Filament mit konstanter Geschwindigkeit in eine Richtung bewegt, bis es einen benutzerdefinierten Inversionspunkt erreicht, an dem die Nettokraft in die entgegengesetzte Richtung umgekehrt wird. Wenn das Motorprotein nicht mit dem Filament interagiert, kann sich die Hantel in einer dreieckigen Wellenform hin und her bewegen (Abbildung 1b, unteres Bild), die die Sockelperle überspannt, auf der ein einzelnes Motorprotein befestigt ist. Sobald die Wechselwirkung hergestellt ist, wird die von der Hantel getragene Kraft sehr schnell auf das Motorprotein übertragen und der Motor beginnt, das Filament zu verdrängen, indem er unter die Kraftintensität und -richtung tritt, die vom Rückkopplungssystem zum Zeitpunkt der Interaktion angewendet wurde, bis sich Myosin vom Aktin löst. Da die Verschiebung, die durch das Stepping des Motors erzeugt wird, von der Polarität des eingeschlossenen Aktinfilaments abhängt, kann die Last entsprechend der Richtung der aufgebrachten Kraft entweder unterstützend sein, d. h. in die gleiche Richtung der Motorverdrängung drücken (Push in Abbildung 1b obere Platte), oder resistiv, d. h. in die entgegengesetzte Richtung in Bezug auf die Motorverschiebung ziehen (Pull in Abbildung 1b B. obere Tafel), die es ermöglicht, die chemomechanische Regulation der motorischen Prozessivität sowohl durch die Intensität als auch durch die Richtungsabhängigkeit der aufgebrachten Last zu untersuchen.
In den nächsten Abschnitten werden alle Schritte zur Messung von Aktin-Myosin-5B-Wechselwirkungen unter verschiedenen Belastungen mit einem ultraschnellen Kraft-Klemm-Spektroskopie-Aufbau vollständig beschrieben, einschließlich 1) der Einrichtung des optischen Aufbaus, der Ausrichtung optischer Fallen und der Kalibrierungsverfahren, 2) der Vorbereitung aller Komponenten und ihrer Montage in der Probenkammer, 3) des Messverfahrens, 4) repräsentative Daten und Datenanalyse zur Extraktion wichtiger physikalischer Parameter, wie z.B. der Lauflänge, der Schrittweite und der Geschwindigkeit des Motorproteins.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;Aliphatic Amine Latex Beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A37362</td>
			<td>1.0-&#956;m diameter, 2% (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin polymerization buffer</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>BSA02</td>
			<td>10X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AODs (acousto-optic deflectors)</td>
			<td>AA Opto Electronic</td>
			<td>DTS-XY 250</td>
			<td>Laser beam deflectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated-BSA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>29130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calmodulin from porcine brain (CaM)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>208783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase from bovine liver</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Condenser</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>OlympusU-AAC, Aplanat, Achromat</td>
			<td>NA 1.4, oil immersion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine phosphate disodium salt tetrahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>27920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine Phosphokinase from rabbit muscle</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDs</td>
			<td>AA Opto Electronic</td>
			<td>AA.DDS.XX</td>
			<td>Two-channel digital synthesizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DTT)/td&#62;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-actin protein</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>AKL99</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase from Aspergillus niger</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;G7141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaloTag succinimidyl ester O2 ligand</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High vacuum silicone grease heavy</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>107921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4/K2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5379/ P8281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labview</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>version 8.1</td>
			<td>Data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labview FPGA module</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>version 8.1</td>
			<td>Fast Force-Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>2016</td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>63020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Plan-Apo 60X</td>
			<td>NA 1.2, WD 0.2 mm, water imm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N8267</td>
			<td>0.45 pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentyl acetate solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>46022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pure Ethanol</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>2860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QPDs</td>
			<td>UDT</td>
			<td>DLS-20</td>
			<td>D Position Detecto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine BSA</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A23016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine Phalloidin</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>P1951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica beads</td>
			<td>Bangslabs</td>
			<td>SS04N</td>
			<td>1.21 mm, 10% solids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin protein</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>189730</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissecting mechanoenzymatic properties of processive myosins with ultrafast force-clamp spectroscopy

Die Ultrakurzzeit-Kraftklemmenspektroskopie (UFFCS) ist eine auf einer Laserpinzette basierende Einzelmolekültechnik, die es ermöglicht, die Chemomechanik sowohl konventioneller als auch unkonventioneller Myosine unter Last mit bisher unerreichter Zeitauflösung zu untersuchen. Insbesondere die Möglichkeit, Myosinmotoren direkt nach der Aktin-Myosin-Bindungsbildung unter konstanter Kraft zu untersuchen, hat zusammen mit der hohen Rate der Kraftrückkopplung (200 kHz) gezeigt, dass UFFCS ein wertvolles Werkzeug ist, um die Lastabhängigkeit schneller Dynamiken wie des Myosin-Arbeitsschlags zu untersuchen. Darüber hinaus ermöglicht UFFCS die Untersuchung, wie prozessive und nicht-prozessive Myosin-Aktin-Wechselwirkungen durch die Intensität und Richtung der angewendeten Kraft beeinflusst werden.
Durch die Befolgung dieses Protokolls wird es möglich sein, ultraschnelle Kraftklemmexperimente an prozessiven Myosin-5-Motoren und an einer Vielzahl von unkonventionellen Myosinen durchzuführen. Durch einige Anpassungen konnte das Protokoll auch leicht auf die Untersuchung anderer Klassen von Prozessmotoren wie Kinesine und Dyneine ausgedehnt werden. Das Protokoll umfasst alle notwendigen Schritte, vom Aufbau der Versuchsapparatur über die Probenvorbereitung bis hin zu Kalibrierverfahren, Datenerfassung und Analyse.

Repräsentative Daten bestehen aus Positionsdatensätzen im Zeitverlauf, wie in Abbildung 4 dargestellt. In der Positionsaufzeichnung sind zwei Arten von Verschiebungen sichtbar. Erstens, wenn der Myosinmotor nicht mit dem Aktinfilament wechselwirkt, bewegen sich die gefangenen Kügelchen mit konstanter Geschwindigkeit gegen die viskose Widerstandskraft der Lösung und zeigen eine lineare Verschiebung, die innerhalb des vom Bediener in einer Dreieckswelle3 eingestellt...

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Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy

Hier wird ein umfassendes Protokoll zur Durchführung von ultraschnellen Kraftklemmexperimenten an prozessiven Myosin-5-Motoren vorgestellt, das leicht auf die Untersuchung anderer Klassen von prozessiven Motoren ausgeweitet werden könnte. Das Protokoll beschreibt alle notwendigen Schritte, von der Einrichtung der Versuchsapparatur über die Probenvorbereitung bis hin zur Datenerfassung und Analyse.

Analyse der mechanoenzymatischen Eigenschaften prozessiver Myosine mit ultraschneller Kraftklemmenspektroskopie

Ultrafast force-clamp spectroscopy (UFFCS) is a single molecule technique based on laser tweezers that allows the investigation of the chemomechanics of ...

Die Ultrakurzzeit-Kraftklemmenspektroskopie ist eine auf einer Laserpinzette basierende Einzelmolekültechnik, die es ermöglicht, die Chemomechanik von Myosinmotoren unter Last mit höchster zeitlicher Auflösung zu untersuchen. Diese Technik ermöglicht es, sehr schnelle Ereignisse in der Krafterzeugung zu untersuchen, indem die Kraft in jeder Phase der Motorinteraktion konstant gehalten wird, wobei die Kraftrichtung vollständig kontrolliert wird. Durch entsprechende Anpassungen könnte dieses Protokoll leicht auf andere Arten von Prozessmotoren, einschließlich Kinesine und Dynine, angewendet werden, um die Regulierung durch Gewalt aufzudecken.Nachdem Sie einen Satz akusto-optischer Deflektoren an einem linearen Übersetzer montiert haben, nehmen Sie eine Blende und passen Sie ihre Blende an die Größe der Objektivrückblende an. Ersetzen Sie das Objektiv durch die Blende, die auf dem Objektivgehäuse mit Gewinde zentriert ist. Bewegen Sie den Übersetzer in Richtung des Laserstrahls, bis der vom Piezokristall blockierte Teil des Strahls nach der Blende sichtbar ist, und drehen Sie den Übersetzer leicht nach hinten, bis der Strahl die Blendenöffnung vollständig ausfüllt.Um Kieselsäurekügelchen in Pentylacetat herzustellen, verdünnen Sie zunächst 20 Mikroliter 1,2 μm 10% feste Kieselsäurekügelchen in 1-1,5 Milliliter Aceton mit Vortexing und 30 Sekunden Beschallung. Nach der Beschallung werden die Kügelchen durch Zentrifugation gesammelt und das Perlenpellet für eine zweite Wäsche in 1 Milliliter frischem Aceton resuspendiert. Nach der zweiten Acetonwäsche werden die Perlen dreimal in 1 Milliliter frischem Pentylacetat pro Waschgang unter den gleichen Zentrifugationsbedingungen gewaschen und das Pellet in 100 Mikrolitern 1% Nitrocellulose und 900 Mikroliter Pentylacetat resuspendiert.Als nächstes wischen Sie mit einem reinen Ethanol-getränkten Stück Laborgewebe ein 24 x 24 Millimeter großes Glasdeckglas vorsichtig ab, bevor Sie mit einer sauberen Pinzette das Glas direkt im Ethanol spülen und das Deckglas unter sanftem Stickstofffluss trocknen lassen. Wirbeln und beschallen Sie das vorbereitete Silica-Kügelchenmaterial für 30 Sekunden und verwenden Sie ein mit Ethanol gereinigtes 24 x 60 Millimeter Deckglas, um 2 Mikroliter Silica-Kügelchenlösung auf die Oberfläche des kleineren Deckglases zu schmieren. Während die Perlen trocknen, reinigen Sie einen 26 x 76 Millimeter großen Objektträger wie gezeigt und legen Sie zwei 60-100 Mikrometer dicke Linien von 3 Millimetern doppelseitig auf die langen Kanten des Objektträgers.Legen Sie das perlenbeschichtete Deckglas mit einer sauberen Pinzette auf das Klebeband mit den Perlen auf der Innenseite der Objektträgerkammer und füllen Sie die Kammer mit 15 Millimolarphosphatpuffer und schwimmender Polystyrolperlenlösung. Dann verschließen Sie die Kammer mit Silikonfett. Um das Pixel-zu-Nanometer-Verhältnis der Hellfeldkamera zu kalibrieren, nehmen Sie ein erstes Bild einer Siliziumdioxidperle auf der Deckglasoberfläche etwa 5 Mikrometer von der Mitte des Sichtfeldes entfernt auf.Bewegen Sie die Bühne, um die Perle um 10 Mikrometer in Richtung der Mitte des Sichtfeldes zu verschieben, und nehmen Sie ein zweites Bild auf. Berechnen Sie die Kamerakalibrierungskonstante, indem Sie den Pixelabstand zwischen zwei Positionen der Perle messen. Um die Position der Falle zu kalibrieren, fangen Sie ein einzelnes schwimmendes Partikel in einer Falle ein und bewegen Sie die akusto-optischen Deflektoren in Schritten von 0,2 Megahertz, wobei Sie ein Bild des Partikels und die entsprechende Frequenz der Deflektoren für jeden Schritt aufnehmen.Wiederholen Sie dann die Kalibrierung für die zweite Falle auf die gleiche Weise. Um die Leistung und Steifigkeit der Falle zu kalibrieren, fangen Sie ein einzelnes Partikel in jeder Falle ein und verschieben Sie beide Fallen mit den akusto-optischen Deflektoren in 0,2-Megahertz-Schritten, wobei eine Brownsche Bewegung des Partikels in beiden Fallen mit Quadrant-Photodiodendetektoren und die entsprechende Frequenz der akusto-optischen Deflektoren aufgezeichnet wird. Kalibrierungskonstanten erhalten, indem man eine Lorentzsche Funktion an ein Leistungsspektrum der aufgezeichneten Brownschen Bewegung anpasst.Um eine Probe für die Messung zusammenzustellen, geben Sie 1 Milligramm pro Milliliter biotinyliertes BSA in eine neue Kammer mit Kieselsäurekügelchen auf der Deckglasoberfläche. Nach 5 Minuten waschen Sie die Kammer mit AB-Puffer und geben Sie 1 Milligramm pro Milliliter Streptavidin in die Kammer. Nach 5 Minuten waschen Sie die Kammer wie gezeigt und fügen Sie 3 nanomolare biotinylierte Myosin-5B schweres Meromyosin in M5B-Puffer hinzu, der mit 2 mikromolaren Calmodulin ergänzt ist.Nach 5 Minuten waschen Sie die Kammer dreimal mit 1 Milligramm pro Milliliter biotinyliertem BSA, ergänzt mit 2 mikromolaren Calmodulin in AB-Puffer, und warten Sie 3 Minuten nach der letzten Wäsche. Das Reaktionsgemisch wird fließen lassen und die Kammer mit Silikonfett versiegelt. Um die Probe zu messen, legen Sie die Kammer auf den Mikroskoptisch und bewegen Sie das Objektiv, bis die schwebenden Alpha-Aktinin-Kügelchen scharf sind.Schalten Sie eine Falle ein und fangen Sie eine Perle ein. Sobald die erste Überfüllung besetzt ist, bewegen Sie den Übersetzer, um die gefangene Perle in der Nähe der Deckglasoberfläche zu positionieren, um zu vermeiden, dass mehrere Perlen eingefangen werden, und fangen Sie eine Perle in der zweiten Überfüllung ab. Verschieben Sie die Probe durch die Langstrecken-Übersetzer, um Aktinfilamente von mindestens 5 Mikrometern Länge in der Lösung zu lokalisieren.Wenn ein Filament entdeckt wurde, bewegen Sie die Probe so, dass sich eine gefangene Perle einem Ende des Filaments nähert. Sobald das Filament angebracht ist, passen Sie den Abstand der Perle an die ungefähre Filamentlänge an und bewegen Sie den Tisch, um einen Fluss in der ungebundenen Raupenrichtung zu erzeugen. Das Filament wird durch die Strömung gedehnt und bindet sich schließlich an die zweite Perle.Der resultierende Komplex wird als Hantel bezeichnet"Um einen Aktin-Myosin-Kontakt herzustellen, trennen Sie die beiden Fallen vorsichtig und stellen Sie das Filament auf Vorspannungen von bis zu etwa 3 Pikonewton ein. Um die Steifigkeit der Hantel zu untersuchen, lassen Sie eine Falle in einer dreieckigen Welle oszillieren, indem Sie die Frequenz eines akusto-optischen Deflektors ändern und die daraus resultierende Übertragung der Bewegung auf die nachfolgende Perle durch ihr Positionssignal überprüfen. Bewegen Sie die Bühne, um die Hantel in der Nähe einer Sockelkieselsäureperle zu positionieren, und stellen Sie die Höhe der Hantel so ein, dass das Aktinfilament mit der Kieselsäureperlenoberfläche in Kontakt kommt.Wie in dieser repräsentativen Positionsaufzeichnung beobachtet, bewegen sich die gefangenen Kügelchen mit einer konstanten Geschwindigkeit gegen die viskose Widerstandskraft der Lösung, wenn der Myosinmotor nicht mit dem Aktinfilament interagiert. Sobald der Myosinmotor mit dem Filament zu interagieren beginnt, wird die Kraft, die von dem sich bewegenden Filament getragen wird, sehr schnell auf das Protein übertragen, und die Systemgeschwindigkeit sinkt auf Null, wobei die Schrittereignisse bis zum Ende des Laufs unter konstanter Kraft auftreten. Die Kraft wird von der positiven in die negative Richtung durch das Feedback-System umgeschaltet, das die Kraftrichtung umschaltet, wenn die Perle den Rand des vom Benutzer eingestellten Schwingungsbereichs erreicht.Wenn das Myosin das Filament in die positive Richtung bindet und verdrängt, drückt es die Perle in Richtung des oberen Randes des Schwingungsbereichs. Wenn dies unter Hilfskraft geschieht, wird der Lauf des Myosins durch die Kraftrichtungsumkehr an der Schwingungskante unterbrochen, wodurch die Länge des Laufs auf die Amplitude der Hantelschwingung begrenzt wird. Eine präzise Ausrichtung des optischen Systems ist notwendig, um die optimale räumliche und zeitliche Auflösung zu erreichen, während eine genaue Kalibrierung notwendig ist, um die Werte der einwirkenden Kräfte genau zu bestimmen.Diese Technik wurde angepasst, um die gleitende und gezielte Suche nach Transkriptionsfaktoren in DNA sowie dynamische Wechselwirkungen zwischen Mechanotransduktionsproteinen, die über Mikrotubulifilamente induzieren, zu untersuchen.

Research

JoVE Journal

Biology

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Forschung

Biologie

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