Name: dissecting mechanoenzymatic properties of processive myosins with ultrafast force-clamp spectroscopy
Uploaded: 2021-07-01T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי במסגרת הסכם מענק מס '871124 Laserlab-Europe, על ידי משרד האוניברסיטה והמחקר האיטלקי (FIRB "Futuro in Ricerca" 2013 Grant No. RBFR13V4M2), ועל ידי Ente Cassa di Risparmio di Firenze. A.V. Kashchuk נתמך על ידי תוכנית מדעי החזית האנושית מלגת LT008/2020-C.

1. הגדרה אופטית
הערה: מערך הניסוי מורכב מפינצטה אופטית כפולה עם יציבות הצבעה ננומטרית ותנודות < של 1% בעוצמת הלייזר. בתנאים אלה, יציבות המשקולת ברמה הננומטרית מובטחת תחת קשיחות מלכודת אופיינית (0.1 pN/nm) ומתח (1 pN - כמה עשרות pN). איור 2 מראה סכימה מפורטת של המבנה האופט?...

<ol>
	<li>Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+a+single-beam+gradient+force+optical+trap+for+dielectric+particles.">Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles.</a> Optical Angular Momentum. 11 (5), 196-198 (2016).</li><li>Capitanio, M., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+biology+with+force:+Single+molecule+high-resolution+measurements+with+optical+tweezers.">Interrogating biology with force: Single molecule high-resolution measurements with optical tweezers.</a> Biophysical Journal. 105 (6), 1293-1303 (2013).</li><li>Capitanio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+force-clamp+spectroscopy+of+single+molecules+reveals+load+dependence+of+myosin+working+stroke.">Ultrafast force-clamp spectroscopy of single molecules reveals load dependence of myosin working stroke.</a> Nature Methods. 9 (10), 1013-1019 (2012).</li><li>Gardini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+myosin-5B+mechanosensitivity+and+calcium+regulation+at+the+single+molecule+level.">Dissecting myosin-5B mechanosensitivity and calcium regulation at the single molecule level.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li><li>Woody, M. S., Winkelmann, D. A., Capitanio, M., Ostap, E. M., Goldman, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+mechanics+resolves+the+earliest+events+in+force+generation+by+cardiac+myosin.">Single molecule mechanics resolves the earliest events in force generation by cardiac myosin.</a> eLife. 8, 49266 (2019).</li><li>Clemen, A. E. -. M., Vilfan, M., Jaud, J., Zhang, J., B&#228;, M., Rief, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-dependent+stepping+kinetics+of+myosin-V.">Force-dependent stepping kinetics of myosin-V.</a> Biophysical Journal. 88, 4402-4410 (2005).</li><li>Howard, J., Hancock, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+beads+are+better+than+one.">Three beads are better than one.</a> Biophysical Journal. 118 (1), 1-3 (2020).</li><li>Pyrpassopoulos, S., Shuman, H., Ostap, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+kinesin's+load-bearing+capacity+by+force+geometry+and+the+microtubule+track.">Modulation of kinesin's load-bearing capacity by force geometry and the microtubule track.</a> Biophysical Journal. 118 (1), 243-253 (2020).</li><li>Capitanio, M., Maggi, D., Vanzi, F., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FIONA+in+the+trap:+The+advantages+of+combining+optical+tweezers+and+fluorescence.">FIONA in the trap: The advantages of combining optical tweezers and fluorescence.</a> Journal of Optics A: Pure and Applied Optics. 9 (8), 157 (2007).</li><li>Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Position+control+and+optical+manipulation+for+nanotechnology+applications.">Position control and optical manipulation for nanotechnology applications.</a> European Physical Journal B. 46 (1), 1-8 (2005).</li><li>Capitanio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Optical Tweezers. An introduction to Single Molecule Biophysics. , (2017).</li><li>Capitanio, M., Cicchi, R., Saverio Pavone, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+and+time-shared+multiple+optical+tweezers+for+the+study+of+single+motor+proteins.">Continuous and time-shared multiple optical tweezers for the study of single motor proteins.</a> Optics and Lasers in Engineering. 45 (4), 450-457 (2007).</li><li>Gardini, L., Tempestini, A., Pavone, F. S., Capitanio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+optical+tweezers+for+the+study+of+single+molecular+motors.">High-speed optical tweezers for the study of single molecular motors.</a> Methods in Molecular Biology. 1805, (2018).</li><li>Capitanio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calibration+of+optical+tweezers+with+differential+interference+contrast+signals.">Calibration of optical tweezers with differential interference contrast signals.</a> Review of Scientific Instruments. 73 (4), 1687 (2002).</li><li>Monico, C., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S., Capitanio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+single-molecule+manipulation+and+imaging+for+the+study+of+protein-DNA+interactions.">Combining single-molecule manipulation and imaging for the study of protein-DNA interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. (90), e51446 (2014).</li><li>Greenberg, M. J., Lin, T., Goldman, Y. E., Shuman, H., Ostap, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+IC+generates+power+over+a+range+of+loads+via+a+new+tension-sensing+mechanism.">Myosin IC generates power over a range of loads via a new tension-sensing mechanism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), 2433-2440 (2012).</li><li>Gardini, L., Arbore, C., Capitanio, M., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+single+molecule+imaging+and+tracking+of+processive+myosin+motors.">A protocol for single molecule imaging and tracking of processive myosin motors.</a> MethodsX. 6, 1854-1862 (2019).</li><li>Ramaiya, A., Roy, B., Bugiel, M., Sch&#228;ffer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+rotates+unidirectionally+and+generates+torque+while+walking+on+microtubules.">Kinesin rotates unidirectionally and generates torque while walking on microtubules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (41), 10894-10899 (2017).</li></ol>

למרות שטכניקות של מולקולות בודדות, כגון מבחן שלושת החרוזים, הן מאתגרות מבחינה טכנית ובעלות תפוקה נמוכה, UFFCS משפר את זיהוי האינטראקציות המולקולריות הודות ליחס האות לרעש הגבוה של הנתונים. UFFCS מאפשר לחקור את התלות בעומס של חלבונים מוטוריים, עם היתרונות העיקריים של הפעלת הכוח במהירות רבה עם קש...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62388">Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy</a>. The title was updated.
The title was updated from:
Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy
to:
Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62388">Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy</a>. The title was updated.

Erratum: Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy

בעשורים האחרונים פינצטה אופטית הייתה כלי רב ערך להבהרת המכנוכימיה של אינטראקציות חלבונים ברמת המולקולה הבודדת, בשל האפשרות הבולטת של מניפולציה ומדידה בו זמנית של שינויי קונפורמציה וקינטיקה אנזימטית 1,2. בפרט, היכולת להפעיל ולמדוד כוחות בטווח של אלה המופעלים על ידי מנועים מולקולריים בתא, יחד עם היכולת למדוד שינויים קונפורמטיביים תת-ננומטריים, הפכו את הפינצטה האופטית לכלי ייחודי של מולקולה בודדת לפענוח התכונות הכימומכניות של חלבונים מוטוריים והוויסות המכני שלהם.
ספקטרוסקופיית מהדק כוח אולטרה-מהירה (UFFCS) היא טכניקת ספקטרוסקופיית כוח של מולקולה יחידה המבוססת על פינצטה אופטית, שפותחה כדי לחקור את הקינטיקה המהירה של מנועים מולקולריים תחת עומס בגאומטריה של שלושה חרוזים (איור 1a)3,4. UFFCS מפחית את השהיית הזמן להפעלת הכוח על חלבון המנוע עד לגבול הפיזיקלי של פינצטה אופטית, כלומר זמן ההרפיה המכנית של המערכת, ובכך מאפשר הפעלת הכוח במהירות לאחר תחילת ריצת מיוזין (כמה עשרות מיקרו-שניות)3. יכולת זו נוצלה כדי לחקור את האירועים המכניים המוקדמים בשריר השלד המהיר 3 ושריר הלב5 כדי לחשוף את התלות בעומס של מכת הכוח, מצבי הקישור החלשים והחזקים, כמו גם את סדר האירועים הביוכימיים (Pi) והמכניים (powerstroke).
גיאומטריית שלושת החרוזים משמשת בדרך כלל לחקר מנועים לא תהליכיים, גיאומטריית חרוז יחיד עם מהדק כוח שימשה בדרך כלל לחקר מיוזין לא קונבנציונלי תהליכי, כגון מיוזין Va6. עם זאת, ישנן מספר סיבות להעדיף בדיקת UFFCS בעלת שלושה חרוזים גם עבור מיוזין תהליכי. ראשית, היישום המהיר של עומס מיד לאחר קשירת אקטין מיוזין מאפשר מדידה של האירועים המוקדמים בהתפתחות הכוח כמו במנועים שאינם תהליכים. בנוסף, במקרה של מנועים תהליכיים זה גם מאפשר מדידה מדויקת של אורכי הריצה של המנוע ומשכי הריצה שלו תחת כוח קבוע לאורך כל ההתקדמות שלהם (איור 1b). יתר על כן, בגלל הקצב הגבוה של משוב הכוח, המערכת יכולה לשמור על כוח קבוע במהלך שינויים מהירים במיקום, כגון מכת עבודה מיוזין, ובכך להבטיח עומס קבוע במהלך דריכה מוטורית. הרזולוציה הטמפורלית הגבוהה של המערכת מאפשרת זיהוי אינטראקציות תת-אלפיות שנייה, ופותחת את האפשרות לחקור קשירה חלשה של מיוזין לאקטין. לבסוף, גיאומטריית הבדיקה מבטיחה שהכוח יופעל לאורך חוט האקטין עם רכיבים רוחביים ואנכיים זניחים של הכוח. נקודה זו רלוונטית במיוחד מכיוון שרכיב הכוח האנכי הוכח כמשפיע באופן משמעותי על התלות בעומס של קינטיקה מוטורית 7,8. על ידי שימוש בטכניקה זו, אנו יכולים ליישם מגוון של עומסים מסייעים והתנגדותיים על מיוזין-5B תהליכיים ולמדוד ישירות את תלות העומס של התהליכות שלו עבור מגוון רחב של כוחות4.
כפי שניתן לראות באיור 1a, במערכת זו חוט להט אקטין יחיד תלוי בין שני חרוזי פוליסטירן הכלואים במוקד של פינצטה אופטית כפולה ("משקולת"). כוח נטו לא מאוזן F = F1-F 2 מוטל על חוט הלהט, באמצעות מערכת משוב מהירה, אשר גורמת לחוט הלהט לנוע במהירות קבועה בכיוון אחד עד שהוא מגיע לנקודת היפוך מוגדרת על ידי המשתמש שבה הכוח נטו מתהפך בכיוון ההפוך. כאשר החלבון המוטורי אינו מתקשר עם חוט הלהט, המשקולת חופשייה לנוע קדימה ואחורה בצורת גל משולש (איור 1b, לוח תחתון) המשתרע על חרוז הכן שעליו מחובר חלבון מוטורי יחיד. ברגע שהאינטראקציה נוצרת, הכוח שנישא על ידי המשקולת מועבר במהירות רבה לחלבון המוטורי והמנוע מתחיל להזיז את חוט הלהט על ידי דריכה מתחת לעוצמת הכוח והכיוון שהופעלו על ידי מערכת המשוב בזמן האינטראקציה, עד שהמיוזין מתנתק מאקטין. בהיותו התזוזה הנוצרת על ידי דריכת המנוע התלויה בקוטביות של חוט האקטין הלכוד, על פי כיוון הכוח המופעל העומס יכול להיות מסייע, כלומר דוחף באותו כיוון של תזוזת המנוע (דחיפה בלוח העליון של איור 1b), או התנגדותי, כלומר משיכה בכיוון ההפוך ביחס לתזוזה המוטורית (משיכה באיור 1b פאנל עליון) המאפשר ללמוד את הרגולציה הכימומכנית של התהליכות המוטורית הן על ידי העוצמה והן על ידי הכיווניות של העומס המופעל.
בסעיפים הבאים מתוארים במלואם כל השלבים למדידת אינטראקציות אקטין מיוזין-5B תחת עומסים שונים עם מערך ספקטרוסקופיית מהדק כוח מהיר במיוחד, כולל 1) הגדרת ההתקנה האופטית, הליכי יישור וכיול מלכודות אופטיות, 2) הכנת כל הרכיבים והרכבתם בתא הדגימה, 3) הליך המדידה, 4) נתונים מייצגים וניתוח נתונים כדי לחלץ פרמטרים פיזיקליים חשובים, כגון אורך הריצה, גודל הצעד ומהירות החלבון המוטורי.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;Aliphatic Amine Latex Beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A37362</td>
			<td>1.0-&#956;m diameter, 2% (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin polymerization buffer</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>BSA02</td>
			<td>10X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AODs (acousto-optic deflectors)</td>
			<td>AA Opto Electronic</td>
			<td>DTS-XY 250</td>
			<td>Laser beam deflectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated-BSA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>29130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calmodulin from porcine brain (CaM)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>208783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase from bovine liver</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Condenser</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>OlympusU-AAC, Aplanat, Achromat</td>
			<td>NA 1.4, oil immersion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine phosphate disodium salt tetrahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>27920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine Phosphokinase from rabbit muscle</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDs</td>
			<td>AA Opto Electronic</td>
			<td>AA.DDS.XX</td>
			<td>Two-channel digital synthesizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DTT)/td&#62;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-actin protein</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>AKL99</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase from Aspergillus niger</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;G7141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaloTag succinimidyl ester O2 ligand</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High vacuum silicone grease heavy</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>107921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4/K2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5379/ P8281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labview</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>version 8.1</td>
			<td>Data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labview FPGA module</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>version 8.1</td>
			<td>Fast Force-Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>2016</td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>63020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Plan-Apo 60X</td>
			<td>NA 1.2, WD 0.2 mm, water imm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N8267</td>
			<td>0.45 pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentyl acetate solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>46022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pure Ethanol</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>2860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QPDs</td>
			<td>UDT</td>
			<td>DLS-20</td>
			<td>D Position Detecto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine BSA</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A23016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine Phalloidin</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>P1951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica beads</td>
			<td>Bangslabs</td>
			<td>SS04N</td>
			<td>1.21 mm, 10% solids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin protein</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>189730</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissecting mechanoenzymatic properties of processive myosins with ultrafast force-clamp spectroscopy

ספקטרוסקופיית מהדק כוח אולטרה-מהירה (UFFCS) היא טכניקה של מולקולה בודדת המבוססת על פינצטה לייזר המאפשרת לחקור את הכימומכניקה של מיוזין קונבנציונלי ולא קונבנציונלי תחת עומס ברזולוציית זמן חסרת תקדים. בפרט, האפשרות לחקור מנועי מיוזין תחת כוח קבוע מיד לאחר היווצרות הקשר אקטין מיוזין, יחד עם השיעור הגבוה של משוב הכוח (200 קילוהרץ), הראתה UFFCS ככלי רב ערך לחקר התלות בעומס של דינמיקה מהירה כגון שבץ עבודה מיוזין. יתר על כן, UFFCS מאפשר לחקור כיצד אינטראקציות מיוזין-אקטין תהליכיות ולא תהליכיות מושפעות מהעוצמה והכיוון של הכוח המופעל.
על ידי ביצוע פרוטוקול זה, ניתן יהיה לבצע ניסויים מהירים במיוחד במהדק כוח על מנועי מיוזין-5 תהליכיים ועל מגוון מיוזין לא קונבנציונלי. על ידי התאמות מסוימות, ניתן להרחיב את הפרוטוקול בקלות גם לחקר סוגים אחרים של מנועים תהליכיים כגון קינזין ודינינים. הפרוטוקול כולל את כל השלבים הדרושים, החל מהקמת מנגנון הניסוי ועד להכנת הדגימה, הליכי כיול, איסוף נתונים וניתוחם.

הנתונים המייצגים מורכבים מרשומות מיקום לאורך זמן, כפי שמוצג באיור 4. ברשומת המיקום נראים שני סוגים של עקירה. ראשית, כאשר מנוע המיוזין אינו מתקשר עם חוט האקטין החרוזים הלכודים נעים במהירות קבועה כנגד כוח הגרר הצמיגי של התמיסה ומראים תזוזה ליניארית המתנדנדת בטווח התנודות שנ?...

Watch this Scientific Journal Video about Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy at JoVE.com

Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy

מוצג כאן פרוטוקול מקיף לביצוע ניסויים מהירים במיוחד במהדק כוח על מנועי מיוזין-5 תהליכיים, שניתן להרחיב בקלות לחקר סוגים אחרים של מנועים תהליכיים. הפרוטוקול מפרט את כל השלבים הדרושים, החל מהקמת מנגנון הניסוי ועד להכנת הדגימה, רכישת הנתונים וניתוחם.

ניתוח תכונות מכנואנזימטיות של מיוסינים תהליכיים באמצעות ספקטרוסקופיית מהדק כוח מהירה במיוחד

Ultrafast force-clamp spectroscopy (UFFCS) is a single molecule technique based on laser tweezers that allows the investigation of the chemomechanics of ...

ספקטרוסקופיית מהדק כוח אולטרה-מהירה היא טכניקה של מולקולה בודדת המבוססת על פינצטה לייזר המאפשרת לחקור את הכימומכניקה של מנועי מיוזין תחת עומס ברזולוציית הזמן הגבוהה ביותר. טכניקה זו מאפשרת לחקור אירועים מהירים מאוד בייצור הכוח על ידי שמירה על קבוע הכוח בכל שלב של האינטראקציה המוטורית עם שליטה מלאה על כיווניות הכוח. על ידי ביצוע התאמות מתאימות, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם בקלות על סוגים אחרים של מנועים תהליכיים, כולל קינזין ודינינים, כדי לחשוף את הרגולציה בכוח.לאחר הרכבת סט אחד של מסיט אקוסטי-אופטי על מתרגם ליניארי, קח קשתית וכוונן את הצמצם שלה כך שיתאים לגודל הצמצם האחורי האובייקטיבי. החלף את המטרה בקשתית המרוכזת בבית המטרה המושחל. הזיזו את המתרגם לכיוון קרן הלייזר עד שהחלק של הקרן שנחסם על ידי גביש הפיזו ייראה אחרי הקשתית, וסובבו את המתרגם מעט אחורה עד שהקרן תמלא לחלוטין את פתח הקשתית.כדי להכין חרוזי סיליקה בפנטיל אצטט, תחילה יש לדלל 20 מיקרוליטר של 1.2 מיקרון 10% חרוזי סיליקה מוצקים ב-1-1.5 מיליליטר אצטון עם מערבולות ו-30 שניות של סוניקציה. לאחר הסוניקציה, לאסוף את החרוזים על ידי צנטריפוגה ולהשעות מחדש את גלולת החרוז במיליליטר אחד של אצטון טרי לשטיפה שנייה. לאחר שטיפת האצטון השנייה, שטפו את החרוזים שלוש פעמים במיליליטר אחד של פנטיל אצטט טרי בכל שטיפה באותם תנאי צנטריפוגה, והשהו מחדש את הגלולה ב-100 מיקרוליטר של 1% ניטרוצלולוז ו-900 מיקרוליטר פנטיל אצטט.לאחר מכן, השתמשו בחתיכת רקמת מעבדה טהורה ספוגה באתנול כדי לנגב בזהירות כיסוי זכוכית בגודל 24 x 24 מילימטר לפני שתשתמשו בפינצטה נקייה כדי לשטוף את הזכוכית ישירות באתנול ולאפשר לכיסוי להתייבש תחת זרימת חנקן עדינה. מערבבים ומסוננים את מלאי חרוזי הסיליקה המוכנים למשך 30 שניות ומשתמשים בכיסוי 24 x 60 מ"מ מנוקה אתנול כדי למרוח 2 מיקרוליטר של תמיסת חרוזי סיליקה על פני השטח של הכיסוי הקטן יותר. בזמן שהחרוזים מתייבשים, נקו מגלשה בגודל 26X76 מ"מ כפי שהודגם והניחו שני קווים בעובי 60-100 מיקרון של 3 מ"מ דו-צדדיים מודבקים על הקצוות הארוכים של המגלשה.בעזרת פינצטה נקייה, הניחו את הכיסוי מצופה החרוזים על הסרט כשהחרוזים פונים לחלק הפנימי של תא ההחלקה, ומלאו את התא בחיץ פוספט 15 מילימולרי ותמיסת חרוזי פוליסטירן צפה. לאחר מכן, לאטום את החדר עם שומן סיליקון. כדי לכייל את יחס הפיקסלים לננומטר של מצלמת שדה הבהיר, קבל תמונה ראשונה של חרוז סיליקה על משטח הכיסוי במרחק של כ -5 מיקרון ממרכז שדה הראייה.הזיזו את הבמה כדי להזיז את החרוז 10 מיקרון לכיוון מרכז שדה הראייה ולצלם תמונה שנייה. חשב את קבוע כיול המצלמה על-ידי מדידת מרחק הפיקסלים בין שני מיקומים של החרוז. כדי לכייל את מיקום ההשמנה, לכדו חלקיק צף בודד במלכודת אחת והזיזו את מסיטי ההדבקה האקוסטיים-אופטיים בצעדים של 0.2 מגה-הרץ, תוך קבלת תמונה של החלקיק והתדירות המתאימה של המסיט לכל שלב.לאחר מכן, חזור על הכיול עבור המלכודת השנייה באותו אופן. כדי לכייל את עוצמת המלכודת ואת קשיחותה, לכוד חלקיק בודד בכל מלכודת והזז את שתי המלכודות באמצעות מסיטי האקוסטיקה האופטיים בצעדים של 0.2 מגה-הרץ, תוך רישום תנועה בראונית של החלקיק בשתי המלכודות עם גלאי פוטודיודה רבעוניים והתדר המתאים של מסיטי האקוסטיקה-אופטיים. קבל קבועי כיול על ידי התאמת פונקציה לורנציאנית לספקטרום עוצמה של התנועה הבראונית המוקלטת.כדי להרכיב דגימה למדידה, הוסף 1 מיליגרם למיליליטר של BSA ביוטינילציה לתא חדש עם חרוזי סיליקה על משטח הכיסוי. לאחר 5 דקות, לשטוף את החדר עם חיץ AB ולהוסיף 1 מיליגרם לכל מיליליטר של סטרפטווידין לחדר. לאחר 5 דקות, שטפו את התא כפי שהודגם והוסיפו 3 מרומיוזין כבד מיוזין-5B ביוטינילציה ננומולרית במאגר M5B בתוספת 2 קלמודולין מיקרומולארי.לאחר 5 דקות, שטפו את החדר שלוש פעמים עם 1 מיליגרם למיליליטר של BSA ביוטינילציה בתוספת 2 קלמודולין מיקרומולרי במאגר AB והמתינו 3 דקות לאחר השטיפה הסופית. מזרימים את תערובת התגובה ואוטמים את התא בשומן סיליקון. כדי למדוד את הדגימה, הניחו את התא על במת המיקרוסקופ והזיזו את המטרה עד שחרוזי האלפא-אקטינין הצפים יהיו ממוקדים.הפעילו מלכודת אחת ולכדו חרוז אחד. לאחר שהמלכודת הראשונה תפוסה, הזיזו את המתרגם כדי למקם את החרוז הלכוד קרוב למשטח הכיסוי כדי למנוע השמנת חרוזים מרובים, ולכדו חרוז במלכודת השנייה. העבירו את הדגימה דרך המתרגמים ארוכי הטווח כדי לאתר סיבי אקטין באורך של לפחות 5 מיקרון בתוך התמיסה.כאשר זוהה חוט להט, הזיזו את הדגימה כדי לאפשר לחרוז לכוד להתקרב לקצה אחד של חוט הלהט. לאחר חיבור חוט הלהט, התאימו את מרחק החרוז לאורך הנימה המשוער והזיזו את הבמה כדי ליצור זרימה בכיוון החרוז הלא קשור. חוט הלהט יימתח על ידי הזרימה ובסופו של דבר ייקשר לחרוז השני.הקומפלקס המתקבל נקרא משקולת"כדי ליצור מגע אקטין מיוזין, להפריד בעדינות את שתי המלכודות ולהגדיר את חוט הלהט לרמות יומרה עד כ 3 piconewtons. כדי לבחון את קשיחות המשקולת, גרמו למלכודת אחת להתנדנד בגל משולש על ידי שינוי התדר של מסיט אקוסטי-אופטי אחד ואימות העברת התנועה לחרוז הנגרר באמצעות אות המיקום שלו. הזיזו את הבמה כדי למקם את המשקולת בקרבת חרוז סיליקה והתאימו את גובה המשקולת כך שחוט האקטין יבוא במגע עם משטח חרוזי הסיליקה.כפי שנצפה ברשומת מיקום מייצגת זו, כאשר מנוע המיוזין אינו מקיים אינטראקציה עם חוט האקטין , החרוזים הלכודים נעים במהירות קבועה כנגד כוח הגרר הצמיגי של התמיסה. ברגע שמנוע המיוזין מתחיל לתקשר עם חוט הלהט, הכוח הנישא על ידי חוט הלהט הנע מועבר במהירות רבה לחלבון, ומהירות המערכת יורדת לאפס, כאשר אירועי הדריכה מתרחשים תחת כוח קבוע עד סוף הריצה. הכוח מועבר מהכיוון החיובי לכיוון השלילי על ידי מערכת המשוב, שמחליפה את כיוון הכוח כאשר החרוז מגיע לקצה טווח התנודות שנקבע על ידי המשתמש.כאשר המיוזין נקשר ומזיז את חוט הלהט לכיוון החיובי, הוא דוחף את החרוז לכיוון הקצה העליון של טווח התנודות. אם זה קורה תחת כוח מסייע, הריצה של המיוזין תופרע על ידי היפוך כיוון הכוח בקצה התנודה, מה שיגביל את אורך הריצה למשרעת של תנודת המשקולת. יישור מדויק של המערכת האופטית נחוץ כדי להשיג את הרזולוציה המרחבית והזמנית האופטימלית, בעוד כיול מדויק נחוץ כדי לקבוע במדויק את ערכי הכוחות המופעלים.טכניקה זו הותאמה לחקר הזזה וחיפוש ממוקד של גורמי שעתוק בדנ"א, כמו גם אינטראקציות דינמיות בין חלבוני מכנוטרנסדוקציה המושרים על חוטי מיקרוטובול.

Research

JoVE Journal

Biology

Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

הביתור, הקלטה מ צומת C. elegans Neuromuscular

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale.   This ...

Dissecting the Non-human Primate Brain in Stereotaxic Space

בניתוח מוח בלתי אנושי הפרימאטים בחלל Stereotaxic

The use of non-human primates provides an excellent translational model for our understanding of developmental and aging processes in humans1-6. In ...

The Gateway to the Brain: Dissecting the Primate Eye

השער המוח: בניתוח עיניים הפרימאטים

The visual system in humans is considered the  gateway  to the world and plays a principal role in the plethora of sensory, perceptual and cognitive ...

Exploring Cognitive Functions in Babies, Children &amp; Adults with Near Infrared Spectroscopy

Exploring Cognitive Functions in Babies, Children & Adults with Near Infrared Spectroscopy

היכרות עם תפקודים קוגניטיביים אצל תינוקות, ילדים &amp; מבוגרים עם ספקטרוסקופית אינפרא אדום הקרוב

An explosion of functional Near Infrared Spectroscopy (fNIRS) studies investigating cortical activation in relation to higher cognitive processes, such as ...

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

הערכת נכסים איתות של Ectodermal epithelia במהלך פיתוח Craniofacial

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue ...

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

נהלים לעכברוש<em&gt; באתר</em&gt; מאפייני התכווצות שרירי שלד

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

שילוב מניפולציה מולקולה בודדת והדמיה לחקר אינטראקציות החלבון-DNA

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase (ERK) Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase ERK Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

גירוי התמונה על ידי לייזר מפעיל בלייזר-האות-מוסדרים-קינאז (טיפשה) איתות או האירועים מיטוכונדריאלי בתאי היעד

Direct control of cellular defined molecular events is important to life science. Recently, studies have demonstrated that femtosecond laser stimulation ...

Quantification of Cellular Densities and Antigenic Properties using Magnetic Levitation

כימות של צפיפות תאית ומאפיינים אנטיגניים באמצעות ריחוף מגנטי

The described method was developed based on the principles of magnetic levitation, which separates cells and particles based on their density and magnetic ...

Detection of Protein Aggregation using Fluorescence Correlation Spectroscopy

איתור צבירת חלבונים באמצעות ספקטרוסקופיית מתאם פלואורסצנטי

Protein aggregation is a hallmark of neurodegenerative disorders such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Alzheimer's disease (AD), Parkinson's ...