Name: dissecting mechanoenzymatic properties of processive myosins with ultrafast force-clamp spectroscopy
Uploaded: 2021-07-01T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dal programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione Europea nell'ambito del Grant Agreement n. 871124 Laserlab-Europe, dal Ministero dell'Università e della Ricerca (FIRB "Futuro in Ricerca" 2013 Grant No. RBFR13V4M2), e dall'Ente Cassa di Risparmio di Firenze. A.V. Kashchuk è stato supportato dalla Human Frontier Science Program Cross-Disciplinary Fellowship LT008/2020-C.

1. Configurazione ottica
NOTA: La configurazione sperimentale è composta da pinzette ottiche doppie con stabilità di puntamento nanometrica e fluttuazioni < intensità laser dell'1%. In queste condizioni, la stabilità del manubrio a livello nanometrico è garantita in condizioni tipiche di rigidità della trappola (0,1 pN/nm) e tensione (1 pN - poche decine di pN). La Figura 2 mostra uno schema dettagliato della configurazione ottica.
<ol><li>Progettazione e ...

<ol>
	<li>Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+a+single-beam+gradient+force+optical+trap+for+dielectric+particles.">Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles.</a> Optical Angular Momentum. 11 (5), 196-198 (2016).</li><li>Capitanio, M., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+biology+with+force:+Single+molecule+high-resolution+measurements+with+optical+tweezers.">Interrogating biology with force: Single molecule high-resolution measurements with optical tweezers.</a> Biophysical Journal. 105 (6), 1293-1303 (2013).</li><li>Capitanio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+force-clamp+spectroscopy+of+single+molecules+reveals+load+dependence+of+myosin+working+stroke.">Ultrafast force-clamp spectroscopy of single molecules reveals load dependence of myosin working stroke.</a> Nature Methods. 9 (10), 1013-1019 (2012).</li><li>Gardini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+myosin-5B+mechanosensitivity+and+calcium+regulation+at+the+single+molecule+level.">Dissecting myosin-5B mechanosensitivity and calcium regulation at the single molecule level.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li><li>Woody, M. S., Winkelmann, D. A., Capitanio, M., Ostap, E. M., Goldman, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+mechanics+resolves+the+earliest+events+in+force+generation+by+cardiac+myosin.">Single molecule mechanics resolves the earliest events in force generation by cardiac myosin.</a> eLife. 8, 49266 (2019).</li><li>Clemen, A. E. -. M., Vilfan, M., Jaud, J., Zhang, J., B&#228;, M., Rief, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-dependent+stepping+kinetics+of+myosin-V.">Force-dependent stepping kinetics of myosin-V.</a> Biophysical Journal. 88, 4402-4410 (2005).</li><li>Howard, J., Hancock, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+beads+are+better+than+one.">Three beads are better than one.</a> Biophysical Journal. 118 (1), 1-3 (2020).</li><li>Pyrpassopoulos, S., Shuman, H., Ostap, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+kinesin's+load-bearing+capacity+by+force+geometry+and+the+microtubule+track.">Modulation of kinesin's load-bearing capacity by force geometry and the microtubule track.</a> Biophysical Journal. 118 (1), 243-253 (2020).</li><li>Capitanio, M., Maggi, D., Vanzi, F., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FIONA+in+the+trap:+The+advantages+of+combining+optical+tweezers+and+fluorescence.">FIONA in the trap: The advantages of combining optical tweezers and fluorescence.</a> Journal of Optics A: Pure and Applied Optics. 9 (8), 157 (2007).</li><li>Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Position+control+and+optical+manipulation+for+nanotechnology+applications.">Position control and optical manipulation for nanotechnology applications.</a> European Physical Journal B. 46 (1), 1-8 (2005).</li><li>Capitanio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Optical Tweezers. An introduction to Single Molecule Biophysics. , (2017).</li><li>Capitanio, M., Cicchi, R., Saverio Pavone, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+and+time-shared+multiple+optical+tweezers+for+the+study+of+single+motor+proteins.">Continuous and time-shared multiple optical tweezers for the study of single motor proteins.</a> Optics and Lasers in Engineering. 45 (4), 450-457 (2007).</li><li>Gardini, L., Tempestini, A., Pavone, F. S., Capitanio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+optical+tweezers+for+the+study+of+single+molecular+motors.">High-speed optical tweezers for the study of single molecular motors.</a> Methods in Molecular Biology. 1805, (2018).</li><li>Capitanio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calibration+of+optical+tweezers+with+differential+interference+contrast+signals.">Calibration of optical tweezers with differential interference contrast signals.</a> Review of Scientific Instruments. 73 (4), 1687 (2002).</li><li>Monico, C., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S., Capitanio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+single-molecule+manipulation+and+imaging+for+the+study+of+protein-DNA+interactions.">Combining single-molecule manipulation and imaging for the study of protein-DNA interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. (90), e51446 (2014).</li><li>Greenberg, M. J., Lin, T., Goldman, Y. E., Shuman, H., Ostap, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+IC+generates+power+over+a+range+of+loads+via+a+new+tension-sensing+mechanism.">Myosin IC generates power over a range of loads via a new tension-sensing mechanism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), 2433-2440 (2012).</li><li>Gardini, L., Arbore, C., Capitanio, M., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+single+molecule+imaging+and+tracking+of+processive+myosin+motors.">A protocol for single molecule imaging and tracking of processive myosin motors.</a> MethodsX. 6, 1854-1862 (2019).</li><li>Ramaiya, A., Roy, B., Bugiel, M., Sch&#228;ffer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+rotates+unidirectionally+and+generates+torque+while+walking+on+microtubules.">Kinesin rotates unidirectionally and generates torque while walking on microtubules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (41), 10894-10899 (2017).</li></ol>

Sebbene le tecniche a singola molecola, come il saggio a tre perline, siano tecnicamente impegnative e a basso rendimento, UFFCS migliora il rilevamento delle interazioni molecolari grazie all'elevato rapporto segnale-rumore dei dati. UFFCS permette lo studio della carico-dipendenza delle proteine motorie, con i principali vantaggi di applicare la forza molto rapidamente al momento del legame del motore al filamento per sondare eventi precoci e molto rapidi nella produzione di forza e stati di legame deboli sotto forza c...

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Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy

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Erratum: Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy

Negli ultimi decenni le pinzette ottiche sono state un valido strumento per chiarire la meccanochimica delle interazioni proteiche a livello di singola molecola, grazie alla sorprendente possibilità di manipolazione e misurazione simultanea dei cambiamenti conformazionali e della cinetica enzimatica 1,2. In particolare, la capacità di applicare e misurare forze nell'intervallo di quelle esercitate dai motori molecolari nella cellula, insieme alla capacità di misurare i cambiamenti conformazionali sub-nanometrici, ha reso le pinzette ottiche uno strumento unico a singola molecola per svelare le proprietà chemiomeccaniche delle proteine motorie e la loro regolazione meccanica.
La spettroscopia force-clamp ultraveloce (UFFCS) è una tecnica di spettroscopia di forza a singola molecola basata su pinzette ottiche, sviluppata per studiare la cinetica veloce dei motori molecolari sotto carico in una geometria a tre sfere (Figura 1a)3,4. UFFCS riduce il ritardo temporale per l'applicazione della forza alla proteina motoria al limite fisico delle pinzette ottiche, cioè il tempo di rilassamento meccanico del sistema, consentendo così l'applicazione della forza rapidamente dopo l'inizio di una corsa di miosina (poche decine di microsecondi)3. Questa capacità è stata sfruttata per studiare i primi eventi meccanici nella miosina muscolare scheletrica 3 veloce e nella miosina muscolare cardiaca5 per rivelare la dipendenza dal carico del powerstroke, gli stati di legame debole e forte, nonché l'ordine degli eventi biochimici (Pi) e meccanici (powerstroke).
La geometria a tre sfere viene solitamente impiegata per studiare motori non processivi, una geometria a singola perla con un morsetto di forza è stata comunemente usata per studiare miosine non convenzionali processive come la miosina Va6. Tuttavia, ci sono diversi motivi per preferire un test UFFCS a tre sfere anche per le miosine processive. In primo luogo, la rapida applicazione del carico subito dopo il legame actina-miosina consente la misurazione degli eventi precoci nello sviluppo della forza come nei motori non processivi. Inoltre, nel caso dei motori processivi, consente anche una misurazione accurata delle lunghezze di corsa e della durata di corsa del motore sotto forza costante durante tutta la loro progressione (Figura 1b). Inoltre, a causa dell'elevata velocità di feedback della forza, il sistema può mantenere costante la forza durante rapidi cambi di posizione, come la corsa di lavoro della miosina, garantendo così un carico costante durante il passo del motore. L'elevata risoluzione temporale del sistema consente la rilevazione di interazioni sub-ms, aprendo la possibilità di indagare il legame debole della miosina all'actina. Infine, la geometria del saggio garantisce che la forza venga applicata lungo il filamento di actina, con componenti trasversali e verticali trascurabili della forza. Questo punto è di particolare rilevanza in quanto è stato dimostrato che la componente di forza verticale influenza significativamente la dipendenza dal carico della cinetica del motore 7,8. Utilizzando questa tecnica, potremmo applicare una gamma di carichi assistivi e resistivi alla miosina-5B processiva e misurare direttamente la dipendenza dal carico della sua processività per un'ampia gamma di forze4.
Come mostrato nella figura 1a, in questo sistema un singolo filamento di actina è sospeso tra due perle di polistirene intrappolate nel fuoco di una pinzetta ottica doppia (il "manubrio"). Una forza netta sbilanciata F = F1-F 2 viene imposta sul filamento, attraverso un sistema di feedback veloce, che fa muovere il filamento a velocità costante in una direzione fino a raggiungere un punto di inversione definito dall'utente in cui la forza netta viene invertita nella direzione opposta. Quando la proteina motrice non interagisce con il filamento, il manubrio è libero di muoversi avanti e indietro in una forma d'onda triangolare (Figura 1b, pannello inferiore) che attraversa il tallone del piedistallo su cui è attaccata una singola proteina motoria. Una volta stabilita l'interazione, la forza trasportata dal manubrio viene trasferita molto rapidamente alla proteina motoria e il motore inizia a spostare il filamento passando sotto l'intensità e la direzione della forza che è stata applicata dal sistema di feedback al momento dell'interazione, fino a quando la miosina si stacca dall'actina. Essendo lo spostamento prodotto dal passo del motore dipendente dalla polarità del filamento di actina intrappolato, a seconda della direzione della forza applicata il carico può essere assistivo, cioè spingendo nella stessa direzione dello spostamento del motore (spinta nel pannello superiore della figura 1b), o resistivo, cioè tirando nella direzione opposta rispetto allo spostamento del motore (trazione in figura 1b pannello superiore) che consente di studiare la regolazione chemiomeccanica della processività motoria sia per l'intensità che per la direzionalità del carico applicato.
Nelle sezioni successive vengono descritti in modo completo tutti i passaggi per misurare le interazioni actina-miosina-5B sotto diversi carichi con una configurazione spettroscopica force-clamp ultraveloce, tra cui 1) l'impostazione del setup ottico, l'allineamento delle trappole ottiche e le procedure di calibrazione, 2) la preparazione di tutti i componenti e il loro assemblaggio nella camera del campione, 3) la procedura di misura, 4) dati rappresentativi e analisi dei dati per estrarre importanti parametri fisici, come la lunghezza della corsa, la dimensione del passo e la velocità della proteina motoria.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;Aliphatic Amine Latex Beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A37362</td>
			<td>1.0-&#956;m diameter, 2% (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin polymerization buffer</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>BSA02</td>
			<td>10X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AODs (acousto-optic deflectors)</td>
			<td>AA Opto Electronic</td>
			<td>DTS-XY 250</td>
			<td>Laser beam deflectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated-BSA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>29130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calmodulin from porcine brain (CaM)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>208783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase from bovine liver</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Condenser</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>OlympusU-AAC, Aplanat, Achromat</td>
			<td>NA 1.4, oil immersion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine phosphate disodium salt tetrahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>27920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine Phosphokinase from rabbit muscle</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDs</td>
			<td>AA Opto Electronic</td>
			<td>AA.DDS.XX</td>
			<td>Two-channel digital synthesizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DTT)/td&#62;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-actin protein</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>AKL99</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase from Aspergillus niger</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;G7141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaloTag succinimidyl ester O2 ligand</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High vacuum silicone grease heavy</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>107921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4/K2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5379/ P8281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labview</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>version 8.1</td>
			<td>Data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labview FPGA module</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>version 8.1</td>
			<td>Fast Force-Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>2016</td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>63020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Plan-Apo 60X</td>
			<td>NA 1.2, WD 0.2 mm, water imm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N8267</td>
			<td>0.45 pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentyl acetate solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>46022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pure Ethanol</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>2860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QPDs</td>
			<td>UDT</td>
			<td>DLS-20</td>
			<td>D Position Detecto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine BSA</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A23016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine Phalloidin</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>P1951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica beads</td>
			<td>Bangslabs</td>
			<td>SS04N</td>
			<td>1.21 mm, 10% solids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin protein</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>189730</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissecting mechanoenzymatic properties of processive myosins with ultrafast force-clamp spectroscopy

La spettroscopia force-clamp ultraveloce (UFFCS) è una tecnica a singola molecola basata su pinzette laser che consente lo studio della chemiomeccanica delle miosine convenzionali e non convenzionali sotto carico con una risoluzione temporale senza precedenti. In particolare, la possibilità di sondare motori di miosina sotto forza costante subito dopo la formazione del legame actina-miosina, insieme all'alto tasso di feedback di forza (200 kHz), ha dimostrato che l'UFFCS è un valido strumento per studiare la dipendenza dal carico di dinamiche veloci come la corsa di lavoro della miosina. Inoltre, UFFCS consente lo studio di come le interazioni miosina-actina processive e non processive sono influenzate dall'intensità e dalla direzione della forza applicata.
Seguendo questo protocollo, sarà possibile eseguire esperimenti di force-clamp ultraveloci su motori processivi di miosina-5 e su una varietà di miosine non convenzionali. Con alcuni aggiustamenti, il protocollo potrebbe anche essere facilmente esteso allo studio di altre classi di motori processivi come chinesine e dineine. Il protocollo comprende tutte le fasi necessarie, dalla messa a punto dell'apparato sperimentale alla preparazione del campione, alle procedure di taratura, all'acquisizione e all'analisi dei dati.

I dati rappresentativi consistono in record di posizione nel tempo, come mostrato nella Figura 4. Nel record di posizione sono visibili due tipi di spostamento. In primo luogo, quando il motore della miosina non interagisce con il filamento di actina, le sfere intrappolate si muovono a velocità costante contro la forza di trascinamento viscoso della soluzione mostrando uno spostamento lineare oscillante all'interno dell'intervallo di oscillazione impostato dall'operatore in un'onda triangol...

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Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy

Presentato qui è un protocollo completo per eseguire esperimenti di force-clamp ultraveloci su motori processivi miosina-5, che potrebbe essere facilmente esteso allo studio di altre classi di motori processivi. Il protocollo descrive in dettaglio tutte le fasi necessarie, dalla messa a punto dell'apparato sperimentale alla preparazione del campione, all'acquisizione dei dati e all'analisi.

Dissezione delle proprietà meccanoenzimatiche delle miosine processive con spettroscopia ultraveloce a force-clamp

Ultrafast force-clamp spectroscopy (UFFCS) is a single molecule technique based on laser tweezers that allows the investigation of the chemomechanics of ...

La spettroscopia force-clamp ultraveloce è una tecnica a singola molecola basata su pinzette laser che consente di studiare la chemiomeccanica dei motori di miosine sotto carico con la massima risoluzione temporale. Questa tecnica consente di sondare eventi molto rapidi nella produzione di forza mantenendo costante la forza durante ogni fase dell'interazione motoria con pieno controllo sulla direzionalità della forza. Apportando le opportune regolazioni, questo protocollo potrebbe essere facilmente applicato ad altri tipi di motori processivi, tra cui chinesine e dineine, per scoprire la regolazione con la forza.Dopo aver montato un set di deflettori acusto-ottici su un traslatore lineare, prendi un diaframma e regola la sua apertura per adattarla alle dimensioni dell'apertura posteriore dell'obiettivo. Sostituite l'obiettivo con il diaframma centrato sull'alloggiamento filettato dell'obiettivo. Spostare il traslatore verso il raggio laser fino a quando la porzione del raggio bloccata dal cristallo piezoelettrico è visibile dopo l'iride e ruotare leggermente indietro il traslatore fino a quando il raggio riempie completamente l'apertura del diaframma.Per preparare le perle di silice in acetato di pentile, prima diluire 20 microlitri di perle di silice solida al 10% da 1,2 micron in 1-1,5 millilitri di acetone con vortice e 30 secondi di sonicazione. Dopo la sonicazione, raccogliere le perle mediante centrifugazione e risospendere il pellet di perline in 1 millilitro di acetone fresco per un secondo lavaggio. Dopo il secondo lavaggio dell'acetone, lavare le perle tre volte in 1 millilitro di acetato di pentile fresco per lavaggio nelle stesse condizioni di centrifugazione e risospendere il pellet in 100 microlitri di 1% di nitrocellulosa e 900 microlitri di acetato di pentile.Quindi, utilizzare un pezzo di tessuto da laboratorio imbevuto di etanolo puro per pulire accuratamente un coprivetro da 24 x 24 millimetri prima di utilizzare una pinzetta pulita per sciacquare il vetro direttamente nell'etanolo e lasciare asciugare il coprislip sotto un delicato flusso di azoto. Vortice e sonicare il brodo di perline di silice preparato per 30 secondi e utilizzare un coprislip da 24 x 60 millimetri pulito con etanolo per spalmare 2 microlitri di soluzione di perline di silice sulla superficie del coprislip più piccolo. Mentre le perline si stanno asciugando, pulire una diapositiva di 26 x 76 millimetri come dimostrato e posizionare due linee spesse 60-100 micron di 3 millimetri a doppia faccia nastrate sui bordi lunghi della diapositiva.Usando una pinzetta pulita, posizionare il coprislip rivestito di perline sul nastro con le perline rivolte verso l'interno della camera di scorrimento e riempire la camera con tampone fosfato 15 millimolare e soluzione di perline di polistirene galleggiante. Quindi, sigillare la camera con grasso al silicone. Per calibrare il rapporto pixel-nanometro della fotocamera a campo chiaro, acquisire una prima immagine di una perla di silice sulla superficie del coprislip a circa 5 micron dal centro del campo visivo.Sposta il palco per spostare il tallone di 10 micron verso il centro del campo visivo e scatta una seconda immagine. Calcolare la costante di calibrazione della fotocamera misurando la distanza in pixel tra due posizioni del tallone. Per calibrare la posizione della trappola, intrappolare una singola particella galleggiante in una trappola e spostare i deflettori acusto-ottici in passi di 0,2 megahertz, acquisendo un'immagine della particella e la frequenza corrispondente dei deflettori per ogni passo.Quindi, ripetere la calibrazione per la seconda trappola nello stesso modo. Per calibrare la potenza e la rigidità della trappola, intrappolare una singola particella in ciascuna trappola e spostare entrambe le trappole usando i deflettori acusto-ottici in incrementi di 0,2 megahertz, registrando un moto browniano della particella in entrambe le trappole con rivelatori a fotodiodi a quadrante e la frequenza corrispondente dei deflettori acusto-ottici. Ottenere costanti di calibrazione adattando una funzione lorentziana ad uno spettro di potenza del moto browniano registrato.Per assemblare un campione per la misurazione, aggiungere 1 milligrammo per millilitro di BSA biotinilato in una nuova camera con perline di silice sulla superficie del coperchio. Dopo 5 minuti, lavare la camera con tampone AB e aggiungere 1 milligrammo per millilitro di streptavidina alla camera. Dopo 5 minuti, lavare la camera come dimostrato e aggiungere 3 nanomolari biotinilati Myosin-5B pesante meromiosina in tampone M5B integrato con 2 micromolari Calmodulin.Dopo 5 minuti, lavare la camera tre volte con 1 milligrammo per millilitro di BSA biotinilato integrato con 2 micromolari di calmodulina in tampone AB e attendere 3 minuti dopo il lavaggio finale. Far scorrere la miscela di reazione e sigillare la camera con grasso al silicio. Per misurare il campione, posizionare la camera sullo stadio del microscopio e spostare l'obiettivo fino a quando le perle galleggianti di alfa-actina sono a fuoco.Accendi una trappola e intrappola una perlina. Una volta occupata la prima trappola, spostare il traduttore per posizionare il tallone intrappolato vicino alla superficie del coprislip per evitare di intrappolare più perline e intrappolare una perlina nella seconda trappola. Spostare il campione attraverso i trasduttori a lungo raggio per individuare filamenti di actina di almeno 5 micron di lunghezza all'interno della soluzione.Quando è stato individuato un filamento, spostare il campione per consentire a una perla intrappolata di avvicinarsi a un'estremità del filamento. Una volta che il filamento è stato attaccato, regolare la distanza del tallone alla lunghezza approssimativa del filamento e spostare il palcoscenico per creare un flusso nella direzione del tallone non legato. Il filamento si allungherà dal flusso e alla fine si legherà alla seconda perla.Il complesso risultante è chiamato manubrio"Per stabilire il contatto actina-miosina, separare delicatamente le due trappole e impostare il filamento a livelli di pretensione fino a circa 3 piconewton. Per sondare la rigidità del manubrio, far oscillare una trappola in un'onda triangolare cambiando la frequenza di un deflettore acusto-ottico e verificando la conseguente trasmissione del moto al tallone di coda attraverso il suo segnale di posizione. Spostare il palco per posizionare il manubrio in prossimità di una perla di silice a piedistallo e regolare l'altezza del manubrio in modo che il filamento di actina entri in contatto con la superficie del tallone di silice.Come osservato in questo record di posizione rappresentativa, quando il motore della miosina non interagisce con il filamento di actina, le perle intrappolate si muovono a velocità costante contro la forza di trascinamento viscoso della soluzione. Una volta che il motore della miosina inizia a interagire con il filamento, la forza trasportata dal filamento in movimento viene trasferita molto rapidamente alla proteina e la velocità del sistema scende a zero, con gli eventi di passo che si verificano sotto forza costante fino alla fine della corsa. La forza viene commutata dalla direzione positiva a quella negativa dal sistema di feedback, che cambia la direzione della forza quando il tallone raggiunge il bordo dell'intervallo di oscillazione impostato dall'utente.Quando la miosina si lega e sposta il filamento verso la direzione positiva, spinge il tallone verso il bordo superiore dell'intervallo di oscillazione. Se ciò avviene sotto la forza assistiva, la corsa della miosina sarà interrotta dall'inversione della direzione della forza sul bordo dell'oscillazione, limitando la lunghezza della corsa all'ampiezza dell'oscillazione del manubrio. L'allineamento preciso del sistema ottico è necessario per ottenere la risoluzione spaziale e temporale ottimale, mentre è necessaria una calibrazione accurata per determinare con precisione i valori delle forze applicate.Questa tecnica è stata adattata per studiare la ricerca scorrevole e mirata di fattori di trascrizione nel DNA e le interazioni dinamiche tra proteine meccanotrasduttrici che inducono su filamenti di microtubuli.

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