Name: dissecting mechanoenzymatic properties of processive myosins with ultrafast force-clamp spectroscopy
Uploaded: 2021-07-01T13:30:00
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이 작업은 보조금 계약 No. 871124 Laserlab-Europe에 따른 유럽 연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그램, 이탈리아 대학 및 연구부(FIRB "Futuro in Ricerca" 2013 Grant No. RBFR13V4M2) 및 Ente Cassa di Risparmio di Firenze의 지원을 받았습니다. A.V. Kashchuk은 Human Frontier Science Program Cross-Disciplinary Fellowship LT008 / 2020-C의 지원을 받았습니다.

1. 광학 설정
알림: 실험 설정은 나노미터 포인팅 안정성과 < 1% 레이저 강도 변동이 있는 이중 광학 핀셋으로 구성됩니다. 이러한 조건에서 나노 미터 수준에서 덤벨의 안정성은 일반적인 트랩 강성 (0.1 pN / nm) 및 인장 (1 pN-수십 pN)에서 보장됩니다. 그림 2 는 광학 설정의 세부 체계를 보여줍니다.
<ol><li>광학 핀셋 설계 및 시공 9,10,11.<sup...

<ol>
	<li>Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+a+single-beam+gradient+force+optical+trap+for+dielectric+particles.">Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles.</a> Optical Angular Momentum. 11 (5), 196-198 (2016).</li><li>Capitanio, M., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+biology+with+force:+Single+molecule+high-resolution+measurements+with+optical+tweezers.">Interrogating biology with force: Single molecule high-resolution measurements with optical tweezers.</a> Biophysical Journal. 105 (6), 1293-1303 (2013).</li><li>Capitanio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+force-clamp+spectroscopy+of+single+molecules+reveals+load+dependence+of+myosin+working+stroke.">Ultrafast force-clamp spectroscopy of single molecules reveals load dependence of myosin working stroke.</a> Nature Methods. 9 (10), 1013-1019 (2012).</li><li>Gardini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+myosin-5B+mechanosensitivity+and+calcium+regulation+at+the+single+molecule+level.">Dissecting myosin-5B mechanosensitivity and calcium regulation at the single molecule level.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li><li>Woody, M. S., Winkelmann, D. A., Capitanio, M., Ostap, E. M., Goldman, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+mechanics+resolves+the+earliest+events+in+force+generation+by+cardiac+myosin.">Single molecule mechanics resolves the earliest events in force generation by cardiac myosin.</a> eLife. 8, 49266 (2019).</li><li>Clemen, A. E. -. M., Vilfan, M., Jaud, J., Zhang, J., B&#228;, M., Rief, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-dependent+stepping+kinetics+of+myosin-V.">Force-dependent stepping kinetics of myosin-V.</a> Biophysical Journal. 88, 4402-4410 (2005).</li><li>Howard, J., Hancock, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+beads+are+better+than+one.">Three beads are better than one.</a> Biophysical Journal. 118 (1), 1-3 (2020).</li><li>Pyrpassopoulos, S., Shuman, H., Ostap, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+kinesin's+load-bearing+capacity+by+force+geometry+and+the+microtubule+track.">Modulation of kinesin's load-bearing capacity by force geometry and the microtubule track.</a> Biophysical Journal. 118 (1), 243-253 (2020).</li><li>Capitanio, M., Maggi, D., Vanzi, F., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FIONA+in+the+trap:+The+advantages+of+combining+optical+tweezers+and+fluorescence.">FIONA in the trap: The advantages of combining optical tweezers and fluorescence.</a> Journal of Optics A: Pure and Applied Optics. 9 (8), 157 (2007).</li><li>Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Position+control+and+optical+manipulation+for+nanotechnology+applications.">Position control and optical manipulation for nanotechnology applications.</a> European Physical Journal B. 46 (1), 1-8 (2005).</li><li>Capitanio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Optical Tweezers. An introduction to Single Molecule Biophysics. , (2017).</li><li>Capitanio, M., Cicchi, R., Saverio Pavone, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+and+time-shared+multiple+optical+tweezers+for+the+study+of+single+motor+proteins.">Continuous and time-shared multiple optical tweezers for the study of single motor proteins.</a> Optics and Lasers in Engineering. 45 (4), 450-457 (2007).</li><li>Gardini, L., Tempestini, A., Pavone, F. S., Capitanio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+optical+tweezers+for+the+study+of+single+molecular+motors.">High-speed optical tweezers for the study of single molecular motors.</a> Methods in Molecular Biology. 1805, (2018).</li><li>Capitanio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calibration+of+optical+tweezers+with+differential+interference+contrast+signals.">Calibration of optical tweezers with differential interference contrast signals.</a> Review of Scientific Instruments. 73 (4), 1687 (2002).</li><li>Monico, C., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S., Capitanio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+single-molecule+manipulation+and+imaging+for+the+study+of+protein-DNA+interactions.">Combining single-molecule manipulation and imaging for the study of protein-DNA interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. (90), e51446 (2014).</li><li>Greenberg, M. J., Lin, T., Goldman, Y. E., Shuman, H., Ostap, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+IC+generates+power+over+a+range+of+loads+via+a+new+tension-sensing+mechanism.">Myosin IC generates power over a range of loads via a new tension-sensing mechanism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), 2433-2440 (2012).</li><li>Gardini, L., Arbore, C., Capitanio, M., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+single+molecule+imaging+and+tracking+of+processive+myosin+motors.">A protocol for single molecule imaging and tracking of processive myosin motors.</a> MethodsX. 6, 1854-1862 (2019).</li><li>Ramaiya, A., Roy, B., Bugiel, M., Sch&#228;ffer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+rotates+unidirectionally+and+generates+torque+while+walking+on+microtubules.">Kinesin rotates unidirectionally and generates torque while walking on microtubules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (41), 10894-10899 (2017).</li></ol>

3-비드 분석과 같은 단일 분자 기술은 기술적으로 까다롭고 처리량이 낮지만 UFFCS는 데이터의 높은 신호 대 잡음비 덕분에 분자 상호 작용 감지를 향상시킵니다. UFFCS는 모터 단백질의 부하 의존성을 연구 할 수있게하며, 모터가 필라멘트에 결합 할 때 힘을 매우 빠르게 적용하여 제어 된 힘 하에서 힘 생성 및 약한 결합 상태에서 조기에 매우 빠른 이벤트를 조사하는 주요 이점이 있습니다. 실행 내...

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Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy
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Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy

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Erratum: Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy

지난 수십 년 동안 광학 핀셋은 구조적 변화와 효소 동역학 1,2의 동시 조작 및 측정의 놀라운 가능성으로 인해 단일 분자 수준에서 단백질 상호 작용의 기계 화학을 설명하는 데 유용한 도구였습니다. 특히, 나노미터 미만의 구조적 변화를 측정하는 능력과 함께 세포에서 분자 모터가 가하는 힘 범위의 힘을 적용하고 측정하는 기능은 광학 핀셋을 모터 단백질의 화학기계적 특성과 기계적 조절을 풀기 위한 고유한 단일 분자 도구로 만들었습니다.
초고속 포스 클램프 분광법(UFFCS)은 광학 핀셋을 기반으로 하는 단일 분자 포스 분광법 기술로, 3비드 형상(그림 1a)3,4에서 부하 상태에서 분자 모터의 빠른 동역학을 연구하기 위해 개발되었습니다. UFFCS는 광학 핀셋의 물리적 한계, 즉 시스템의 기계적 이완 시간까지 모터 단백질에 힘을 가하는 시간 지연을 줄여 미오신 실행 시작 후 (수십 마이크로 초) 힘을 빠르게 적용 할 수 있습니다 3. 이 기능은 빠른 골격 3 및 심장5 근육 미오신의 초기 기계적 이벤트를 조사하여 파워 스트로크의 부하 의존성, 약한 결합 및 강한 결합 상태, 생화학 적 (Pi) 및 기계적 (파워 스트로크) 이벤트의 순서를 밝히는 데 활용되었습니다.
3-비드 기하학은 일반적으로 비가공 모터를 연구하기 위해 사용되며, 힘 클램프가 있는 단일 비드 기하학은 일반적으로 미오신Va 6와 같은 가공성 비-통상적인 미오신을 조사하는 데 사용되었습니다. 그러나 처리성 미오신에 대해서도 3-비드 UFFCS 분석을 선호하는 몇 가지 이유가 있습니다. 첫째, 액틴-미오신 결합 직후 부하를 신속하게 적용하면 비공정 모터에서와 같이 힘 발달의 초기 이벤트를 측정할 수 있습니다. 또한 공정 모터의 경우 모터의 작동 길이와 진행 내내 일정한 힘 하에서 작동 시간을 정확하게 측정할 수 있습니다(그림 1b). 또한, 힘 피드백의 비율이 높기 때문에, 시스템은 미오신 작동 행정과 같은 위치의 빠른 변화 동안 힘을 일정하게 유지할 수 있으며, 따라서 모터 스테핑 동안 일정한 부하를 보장 할 수있다. 시스템의 높은 시간적 분해능은 서브 ms 상호 작용의 검출을 허용하여 미오신과 액틴의 약한 결합을 조사 할 가능성을 열어줍니다. 마지막으로, 분석 기하학은 힘이 액틴 필라멘트를 따라 적용되고 힘의 가로 및 수직 성분이 무시할 수 있음을 보장합니다. 이 점은 수직력 성분이 모터의 동역학 7,8의 부하 의존성에 상당한 영향을 미치는 것으로 나타 났기 때문에 특히 관련이 있습니다. 이 기술을 사용하여 다양한 보조 및 저항 부하를 처리 myosin-5B에 적용하고광범위한 힘에 대한 가공성의 부하 의존성을 직접 측정할 수 있습니다4.
그림 1a에 표시된 바와 같이이 시스템에서 단일 액틴 필라멘트는 이중 광학 핀셋 ( "덤벨")의 초점에 갇힌 두 개의 폴리스티렌 비드 사이에 매달려 있습니다. 불균형 순 힘 F = F1-F 2 는 빠른 피드백 시스템을 통해 필라멘트에 부과되며, 이는 필라멘트가 순 힘이 반대 방향으로 반전되는 사용자 정의 반전 지점에 도달 할 때까지 한 방향으로 일정한 속도로 움직이게합니다. 운동 단백질이 필라멘트와 상호 작용하지 않을 때 덤벨은 단일 운동 단백질이 부착된 받침대 비드에 걸쳐 삼각형 파형(그림 1b, 하단 패널)으로 앞뒤로 자유롭게 움직일 수 있습니다. 상호 작용이 확립되면 덤벨이 전달하는 힘이 운동 단백질로 매우 빠르게 전달되고 모터는 미오신이 액틴에서 분리 될 때까지 상호 작용시 피드백 시스템에 의해 적용된 힘의 강도와 방향으로 밟아 필라멘트를 변위하기 시작합니다. 갇힌 액틴 필라멘트의 극성에 의존하는 모터의 스테핑에 의해 생성되는 변위이기 때문에 적용된 힘의 방향에 따라 하중은 보조, 즉 모터 변위의 동일한 방향으로 밀기(그림 1b 상단 패널에서 푸시) 또는 저항, 즉 모터 변위에 대해 반대 방향으로 당기는 것일 수 있습니다(그림 1b에서 당김). 상부 패널)을 통해 적용된 하중의 강도와 방향성 모두에 의해 모터 과정성의 화학 역학적 조절을 연구 할 수 있습니다.
다음 섹션에서는 초고속 포스 클램프 분광법 설정을 사용하여 다양한 부하에서 액틴-미오신 -5B 상호 작용을 측정하는 모든 단계를 완전히 설명하며, 여기에는 1) 광학 설정 설정, 광학 트랩 정렬 및 교정 절차, 2) 샘플 챔버에서 모든 구성 요소 준비 및 조립, 3) 측정 절차, 4) 운동 단백질의 실행 길이, 스텝 크기 및 속도와 같은 중요한 물리적 매개 변수를 추출하기위한 대표 데이터 및 데이터 분석.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;Aliphatic Amine Latex Beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A37362</td>
			<td>1.0-&#956;m diameter, 2% (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin polymerization buffer</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>BSA02</td>
			<td>10X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AODs (acousto-optic deflectors)</td>
			<td>AA Opto Electronic</td>
			<td>DTS-XY 250</td>
			<td>Laser beam deflectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated-BSA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>29130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calmodulin from porcine brain (CaM)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>208783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase from bovine liver</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Condenser</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>OlympusU-AAC, Aplanat, Achromat</td>
			<td>NA 1.4, oil immersion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine phosphate disodium salt tetrahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>27920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine Phosphokinase from rabbit muscle</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDs</td>
			<td>AA Opto Electronic</td>
			<td>AA.DDS.XX</td>
			<td>Two-channel digital synthesizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DTT)/td&#62;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-actin protein</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>AKL99</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase from Aspergillus niger</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;G7141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaloTag succinimidyl ester O2 ligand</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High vacuum silicone grease heavy</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>107921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4/K2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5379/ P8281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labview</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>version 8.1</td>
			<td>Data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labview FPGA module</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>version 8.1</td>
			<td>Fast Force-Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>2016</td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>63020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Plan-Apo 60X</td>
			<td>NA 1.2, WD 0.2 mm, water imm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N8267</td>
			<td>0.45 pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentyl acetate solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>46022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pure Ethanol</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>2860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QPDs</td>
			<td>UDT</td>
			<td>DLS-20</td>
			<td>D Position Detecto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine BSA</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A23016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine Phalloidin</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>P1951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica beads</td>
			<td>Bangslabs</td>
			<td>SS04N</td>
			<td>1.21 mm, 10% solids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin protein</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>189730</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissecting mechanoenzymatic properties of processive myosins with ultrafast force-clamp spectroscopy

초고속 포스 클램프 분광법(UFFCS)은 레이저 핀셋을 기반으로 하는 단일 분자 기술로, 전례 없는 시간 분해능으로 부하가 걸린 기존 및 비기존 미오신 모두의 화학 역학을 조사할 수 있습니다. 특히, 액틴-미오신 결합 형성 직후 일정한 힘으로 미오신 모터를 프로브 할 수있는 가능성과 높은 힘 피드백 속도 (200kHz)는 UFFCS가 미오신 작동 스트로크와 같은 빠른 역학의 부하 의존성을 연구하는 데 유용한 도구임을 보여주었습니다. 또한 UFFCS는 프로세스 및 비 프로세스 미오신 - 액틴 상호 작용이 적용된 힘의 강도와 방향에 의해 어떻게 영향을 받는지에 대한 연구를 가능하게합니다.
이 프로토콜을 따르면 공정 미오신 -5 모터와 다양한 비 전통적인 미오신에 대한 초고속 포스 클램프 실험을 수행 할 수 있습니다. 일부 조정에 의해, 프로토콜은 또한 키네신 및 다인과 같은 다른 종류의 프로세스 모터에 대한 연구로 쉽게 확장 될 수 있습니다. 프로토콜에는 실험 장치의 설정에서 샘플 준비, 교정 절차, 데이터 수집 및 분석에 이르기까지 필요한 모든 단계가 포함됩니다.

대표 데이터는 그림 4와 같이 시간 경과에 따른 위치 레코드로 구성됩니다. 위치 기록에서 두 종류의 변위가 보입니다. 첫째, 미오신 모터가 액틴 필라멘트와 상호 작용하지 않을 때 갇힌 비드는 용액의 점성 항력에 대해 일정한 속도로 움직이며 작업자가 삼각형 파3에서 설정 한 진동 범위 내에서 진동하는 선형 변위를 보여줍니다 (긴 시간 스케일로 인해 <...

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Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy

여기에 제시된 것은 공정 myosin-5 모터에 대한 초고속 포스 클램프 실험을 수행하는 포괄적인 프로토콜이며, 이는 다른 등급의 공정 모터 연구로 쉽게 확장될 수 있습니다. 프로토콜은 실험 장치의 설정에서 샘플 준비, 데이터 수집 및 분석에 이르기까지 필요한 모든 단계를 자세히 설명합니다.

초고속 포스 클램프 분광법을 사용한 공정 미오신의 기계적 효소 특성 해부

Ultrafast force-clamp spectroscopy (UFFCS) is a single molecule technique based on laser tweezers that allows the investigation of the chemomechanics of ...

초고속 포스 클램프 분광법은 레이저 핀셋을 기반으로 하는 단일 분자 기술로, 가장 높은 시간 분해능으로 부하가 걸린 미오신 모터의 화학 역학을 조사할 수 있습니다. 이 기술을 사용하면 힘 방향성을 완전히 제어하면서 모터 상호 작용의 모든 단계에서 힘을 일정하게 유지함으로써 힘 생산에서 매우 빠른 이벤트를 프로빙할 수 있습니다. 적절한 조정을 통해 이 프로토콜을 키네신 및 다인을 포함한 다른 종류의 프로세스 모터에 쉽게 적용하여 강제로 조절을 밝힐 수 있습니다.한 세트의 음향 광학 디플렉터를 선형 변환기에 장착한 후 조리개를 사용하여 대물 렌즈 후면 조리개 크기에 맞게 조리개를 조정합니다. 대물렌즈를 나사산 대물렌즈 하우징 중앙에 있는 조리개로 교체합니다. 압전 크리스탈에 의해 차단된 빔 부분이 아이리스 뒤에 보일 때까지 변환기를 레이저 빔 쪽으로 이동하고 빔이 아이리스 조리개를 완전히 채울 때까지 변환기를 약간 뒤로 돌립니다.펜틸 아세테이트에 실리카 비드를 준비하려면 먼저 1.2 미크론 10 % 고체 실리카 비드 20 마이크로 리터를 1-1.5 밀리리터의 아세톤에 와류 및 30 초의 초음파 처리로 희석하십시오. 초음파 처리 후, 원심 분리에 의해 비드를 수집하고 두 번째 세척을 위해 비드 펠릿을 신선한 아세톤 1ml에 재현탁시킨다. 두 번째 아세톤 세척 후, 동일한 원심 분리 조건에서 세척 당 1 밀리리터의 신선한 펜틸 아세테이트로 비드를 3 번 세척하고, 1 % 니트로 셀룰로오스 및 900 마이크로 리터의 펜틸 아세테이트 100 마이크로 리터에 펠릿을 재현탁한다.다음으로, 순수한 에탄올에 적신 실험실 티슈 조각을 사용하여 24 x 24mm 유리 커버슬립을 조심스럽게 닦은 다음 깨끗한 핀셋을 사용하여 에탄올에서 직접 유리를 헹구고 커버슬립을 부드러운 질소 흐름으로 건조시킵니다. 준비된 실리카 비드 스톡을 30초 동안 와동시키고 초음파 처리하고 에탄올 세척된 24 x 60mm 커버슬립을 사용하여 2마이크로리터의 실리카 비드 용액을 더 작은 커버슬립의 표면에 도말합니다. 구슬이 건조되는 동안 시연된 대로 26 x 76mm 슬라이드를 청소하고 슬라이드의 긴 가장자리에 테이프로 붙인 3mm 양면의 60-100미크론 두께 선 두 개를 놓습니다.깨끗한 핀셋을 사용하여 비드가 슬라이드 챔버 내부를 향하도록 비드 코팅 커버 슬립을 테이프에 놓고 15 밀리몰 인산염 완충액과 플로팅 폴리스티렌 비드 용액으로 챔버를 채 웁니다. 그런 다음 실리콘 그리스로 챔버를 밀봉하십시오. 명시야 카메라의 픽셀 대 나노미터 비율을 보정하려면 시야 중심에서 약 5미크론의 커버슬립 표면에 있는 실리카 비드의 첫 번째 이미지를 획득합니다.스테이지를 이동하여 비드를 시야의 중심으로 10미크론으로 옮기고 두 번째 이미지를 촬영합니다. 비드의 두 위치 사이의 픽셀 거리를 측정하여 카메라 보정 상수를 계산합니다. 트랩 위치를 보정하려면 하나의 트랩에 단일 플로팅 입자를 트래핑하고 음향 광학 디플렉터를 0.2메가헤르츠 단계로 이동하여 입자의 이미지와 각 단계에 대한 디플렉터의 해당 주파수를 획득합니다.그런 다음 동일한 방식으로 두 번째 트랩에 대한 보정을 반복합니다. 트랩 파워와 강성을 보정하려면 각 트랩에 단일 입자를 트래핑하고 음향 광학 디플렉터를 사용하여 두 트랩을 0.2메가헤르츠 단위로 변위하고 사분면 포토다이오드 감지기를 사용하여 두 트랩에서 입자의 브라운 운동과 음향 광학 디플렉터의 해당 주파수를 기록합니다. 로렌치안 함수를 기록된 브라운 운동의 거듭제곱 스펙트럼에 피팅하여 교정 상수를 얻습니다.측정을 위해 샘플을 조립하려면 커버슬립 표면에 실리카 비드가 있는 새 챔버에 비오틴화 BSA 밀리리터당 1mg을 추가합니다. 5 분 후, AB 완충액으로 챔버를 세척하고 스트렙타 비딘 밀리리터 당 1 밀리그램을 챔버에 첨가한다. 5분 후, 입증된 바와 같이 챔버를 세척하고, 2 마이크로몰 칼모듈린이 보충된 M5B 완충액에 3 나노몰 비오닐화 미오신-5B 헤비 메로미오신을 첨가한다.5분 후, AB 완충액에 2마이크로몰 칼모듈린이 보충된 비오티닐화 BSA 밀리리터당 1밀리그램으로 챔버를 3회 세척하고 최종 세척 후 3분 동안 기다립니다. 반응 혼합물을 흐르게 하고 실리콘 그리스로 챔버를 밀봉합니다. 샘플을 측정하려면 챔버를 현미경 스테이지에 놓고 떠다니는 알파-액티닌 비드에 초점이 맞춰질 때까지 대물렌즈를 움직입니다.하나의 트랩을 켜고 하나의 비드를 트랩하십시오. 첫 번째 트랩이 점유되면 변환기를 움직여 트랩된 비드를 커버슬립 표면 가까이에 배치하여 여러 비드가 트랩되지 않도록 하고 두 번째 트랩에 비드를 트랩합니다. 장거리 번역기를 통해 샘플을 대체하여 용액 내에서 최소 5미크론 길이의 액틴 필라멘트를 찾습니다.필라멘트가 발견되면 샘플을 움직여 갇힌 비드가 필라멘트의 한쪽 끝에 접근하도록합니다. 필라멘트가 부착되면 비드의 거리를 대략적인 필라멘트 길이로 조정하고 스테이지를 이동하여 바인딩되지 않은 비드 방향으로 흐름을 만듭니다. 필라멘트는 흐름에 의해 늘어나고 결국 두 번째 비드에 결합합니다.결과 복합체를 덤벨이라고합니다"액틴-미오신 접촉을 설정하려면 두 트랩을 부드럽게 분리하고 필라멘트를 최대 약 3 피코 네우톤의 프리텐션 레벨로 설정하십시오. 덤벨의 강성을 조사하려면 하나의 음향 광학 디플렉터의 주파수를 변경하고 위치 신호를 통해 후행 비드로의 모션의 후속 전송을 확인하여 하나의 트랩을 삼각형파로 진동시킵니다. 스테이지를 이동하여 덤벨을 받침대 실리카 비드 근처에 배치하고 액틴 필라멘트가 실리카 비드 표면에 닿도록 덤벨의 높이를 조정합니다.이 대표적인 위치 기록에서 관찰된 바와 같이, 미오신 모터가 액틴 필라멘트와 상호 작용하지 않을 때, 갇힌 비드는 용액의 점성 항력에 대해 일정한 속도로 움직입니다. 미오신 모터가 필라멘트와 상호 작용하기 시작하면 움직이는 필라멘트가 전달하는 힘이 단백질로 매우 빠르게 전달되고 시스템 속도는 0으로 떨어지며 스테핑 이벤트는 실행이 끝날 때까지 일정한 힘으로 발생합니다. 피드백 시스템에 의해 힘이 양의 방향에서 음의 방향으로 전환되며, 비드가 사용자가 설정한 진동 범위의 가장자리에 도달하면 힘 방향을 전환합니다.미오신이 필라멘트를 양의 방향으로 결합하고 변위시키면 비드를 진동 범위의 위쪽 가장자리로 밀어냅니다. 이것이 보조 힘 하에서 발생하면 진동 가장자리에서 힘 방향 반전에 의해 미오신의 실행이 중단되어 실행 길이가 덤벨 진동의 진폭으로 제한됩니다. 최적의 공간 및 시간 분해능을 얻으려면 광학 시스템의 정확한 정렬이 필요하며, 적용된 힘의 값을 정확하게 결정하려면 정확한 보정이 필요합니다.이 기술은 DNA의 전사 인자에 대한 슬라이딩 및 표적 검색뿐만 아니라 미세 소관 필라멘트를 통해 유도되는 기계 전달 단백질 간의 동적 상호 작용을 연구하는 데 적용되었습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

해부 및 C. 엘레간스 신경근육학 융티온에서 레코딩

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale.   This ...

연구

생물학

Dissecting the Non-human Primate Brain in Stereotaxic Space

Stereotaxic 공간에 비 인간 메이트 브레인 해부

The use of non-human primates provides an excellent translational model for our understanding of developmental and aging processes in humans1-6. In ...

The Gateway to the Brain: Dissecting the Primate Eye

두뇌에 게이트웨이 : 프리 메이트 &#39;눈&#39;을 분석 해 봅시다

The visual system in humans is considered the  gateway  to the world and plays a principal role in the plethora of sensory, perceptual and cognitive ...

Exploring Cognitive Functions in Babies, Children &amp; Adults with Near Infrared Spectroscopy

Exploring Cognitive Functions in Babies, Children & Adults with Near Infrared Spectroscopy

가까운 적외선 분광학과 함께 아기, 어린이 및 성인의인지 기능을 탐색

An explosion of functional Near Infrared Spectroscopy (fNIRS) studies investigating cortical activation in relation to higher cognitive processes, such as ...

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

Craniofacial 개발 과정 Ectodermal 상피 조직의 신호 특성을 평가

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue ...

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

쥐 절차<em&gt; 현장에서</em&gt; 골격근 수축 등록

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

단백질-DNA 상호 작용의 연구에 대한 단일 분자 조작 및 이미지를 결합

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase (ERK) Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase ERK Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

펨토초 레이저에 의한 광자극은 대상 세포에서 세포외 신호 조절 키나아제(ERK) 신호 또는 미토콘드리아 이벤트를 활성화합니다.

Direct control of cellular defined molecular events is important to life science. Recently, studies have demonstrated that femtosecond laser stimulation ...

Quantification of Cellular Densities and Antigenic Properties using Magnetic Levitation

자기 적고를 이용한 세포 밀도 및 항원 적 특성의 정량화

The described method was developed based on the principles of magnetic levitation, which separates cells and particles based on their density and magnetic ...

Detection of Protein Aggregation using Fluorescence Correlation Spectroscopy

형광 상관 분광법을 사용하여 단백질 응집 감지

Protein aggregation is a hallmark of neurodegenerative disorders such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Alzheimer's disease (AD), Parkinson's ...