Name: dissecting mechanoenzymatic properties of processive myosins with ultrafast force-clamp spectroscopy
Uploaded: 2021-07-01T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av EUs Horizon 2020 forsknings- og innovasjonsprogram under tilskuddsavtale nr. 871124 Laserlab-Europe, av det italienske departementet for universitet og forskning (FIRB "Futuro in Ricerca" 2013 Grant No. RBFR13V4M2), og av Ente Cassa di Risparmio di Firenze. A.V. Kashchuk ble støttet av Human Frontier Science Program Cross-Disciplinary Fellowship LT008/2020-C.

1. Optisk oppsett
MERK: Det eksperimentelle oppsettet består av dobbel optisk pinsett med nanometerpunktstabilitet og < 1% laserintensitetsfluktuasjoner. Under disse forholdene er stabiliteten til hantelen på nanometernivå garantert under typisk fellestivhet (0,1 pN / nm) og spenning (1 pN - noen få titalls pN). Figur 2 viser et detaljert skjema for det optiske oppsettet.
<ol><li>Optisk pinsett design og konstruksjon 9,10,11.</su...

<ol>
	<li>Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+a+single-beam+gradient+force+optical+trap+for+dielectric+particles.">Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles.</a> Optical Angular Momentum. 11 (5), 196-198 (2016).</li><li>Capitanio, M., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+biology+with+force:+Single+molecule+high-resolution+measurements+with+optical+tweezers.">Interrogating biology with force: Single molecule high-resolution measurements with optical tweezers.</a> Biophysical Journal. 105 (6), 1293-1303 (2013).</li><li>Capitanio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+force-clamp+spectroscopy+of+single+molecules+reveals+load+dependence+of+myosin+working+stroke.">Ultrafast force-clamp spectroscopy of single molecules reveals load dependence of myosin working stroke.</a> Nature Methods. 9 (10), 1013-1019 (2012).</li><li>Gardini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+myosin-5B+mechanosensitivity+and+calcium+regulation+at+the+single+molecule+level.">Dissecting myosin-5B mechanosensitivity and calcium regulation at the single molecule level.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li><li>Woody, M. S., Winkelmann, D. A., Capitanio, M., Ostap, E. M., Goldman, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+mechanics+resolves+the+earliest+events+in+force+generation+by+cardiac+myosin.">Single molecule mechanics resolves the earliest events in force generation by cardiac myosin.</a> eLife. 8, 49266 (2019).</li><li>Clemen, A. E. -. M., Vilfan, M., Jaud, J., Zhang, J., B&#228;, M., Rief, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-dependent+stepping+kinetics+of+myosin-V.">Force-dependent stepping kinetics of myosin-V.</a> Biophysical Journal. 88, 4402-4410 (2005).</li><li>Howard, J., Hancock, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+beads+are+better+than+one.">Three beads are better than one.</a> Biophysical Journal. 118 (1), 1-3 (2020).</li><li>Pyrpassopoulos, S., Shuman, H., Ostap, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+kinesin's+load-bearing+capacity+by+force+geometry+and+the+microtubule+track.">Modulation of kinesin's load-bearing capacity by force geometry and the microtubule track.</a> Biophysical Journal. 118 (1), 243-253 (2020).</li><li>Capitanio, M., Maggi, D., Vanzi, F., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FIONA+in+the+trap:+The+advantages+of+combining+optical+tweezers+and+fluorescence.">FIONA in the trap: The advantages of combining optical tweezers and fluorescence.</a> Journal of Optics A: Pure and Applied Optics. 9 (8), 157 (2007).</li><li>Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Position+control+and+optical+manipulation+for+nanotechnology+applications.">Position control and optical manipulation for nanotechnology applications.</a> European Physical Journal B. 46 (1), 1-8 (2005).</li><li>Capitanio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Optical Tweezers. An introduction to Single Molecule Biophysics. , (2017).</li><li>Capitanio, M., Cicchi, R., Saverio Pavone, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+and+time-shared+multiple+optical+tweezers+for+the+study+of+single+motor+proteins.">Continuous and time-shared multiple optical tweezers for the study of single motor proteins.</a> Optics and Lasers in Engineering. 45 (4), 450-457 (2007).</li><li>Gardini, L., Tempestini, A., Pavone, F. S., Capitanio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+optical+tweezers+for+the+study+of+single+molecular+motors.">High-speed optical tweezers for the study of single molecular motors.</a> Methods in Molecular Biology. 1805, (2018).</li><li>Capitanio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calibration+of+optical+tweezers+with+differential+interference+contrast+signals.">Calibration of optical tweezers with differential interference contrast signals.</a> Review of Scientific Instruments. 73 (4), 1687 (2002).</li><li>Monico, C., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S., Capitanio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+single-molecule+manipulation+and+imaging+for+the+study+of+protein-DNA+interactions.">Combining single-molecule manipulation and imaging for the study of protein-DNA interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. (90), e51446 (2014).</li><li>Greenberg, M. J., Lin, T., Goldman, Y. E., Shuman, H., Ostap, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+IC+generates+power+over+a+range+of+loads+via+a+new+tension-sensing+mechanism.">Myosin IC generates power over a range of loads via a new tension-sensing mechanism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), 2433-2440 (2012).</li><li>Gardini, L., Arbore, C., Capitanio, M., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+single+molecule+imaging+and+tracking+of+processive+myosin+motors.">A protocol for single molecule imaging and tracking of processive myosin motors.</a> MethodsX. 6, 1854-1862 (2019).</li><li>Ramaiya, A., Roy, B., Bugiel, M., Sch&#228;ffer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+rotates+unidirectionally+and+generates+torque+while+walking+on+microtubules.">Kinesin rotates unidirectionally and generates torque while walking on microtubules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (41), 10894-10899 (2017).</li></ol>

Selv om enkeltmolekylteknikker, som tredråpeanalysen, er teknisk utfordrende og lav gjennomstrømning, forbedrer UFFCS deteksjonen av molekylære interaksjoner takket være det høye signal-støy-forholdet mellom dataene. UFFCS tillater studier av belastningsavhengigheten av motorproteiner, med de viktigste fordelene ved å påføre kraften veldig raskt ved binding av motoren til filamentet for å undersøke tidlige og svært raske hendelser i kraftproduksjon og svake bindingstilstander under kontrollert kraft; oppretth...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62388">Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy</a>. The title was updated.
The title was updated from:
Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy
to:
Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62388">Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy</a>. The title was updated.

Erratum: Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy

I de siste tiårene har optisk pinsett vært et verdifullt verktøy for å belyse mekanokjemien av proteininteraksjoner på enkeltmolekylnivå, på grunn av den slående muligheten for samtidig manipulering og måling av konformasjonsendringer og enzymatisk kinetikk 1,2. Spesielt evnen til å anvende og måle krefter i området av de som utøves av molekylære motorer i cellen, sammen med kapasiteten til å måle sub-nanometer konformasjonsendringer, gjorde optisk pinsett et unikt enkeltmolekylverktøy for å unraveling de kjemomekaniske egenskapene til motorproteiner og deres mekaniske regulering.
Ultrafast force-clamp spectroscopy (UFFCS) er en enkeltmolekylær kraftspektroskopiteknikk basert på optisk pinsett, utviklet for å studere den raske kinetikken til molekylære motorer under belastning i en tre-perle geometri (figur 1a) 3,4. UFFCS reduserer tidsforsinkelsen for kraftpåføring på motorproteinet til den fysiske grensen for optisk pinsett, dvs. den mekaniske relaksasjonstiden til systemet, og tillater dermed påføring av kraften raskt etter begynnelsen av en myosinkjøring (noen få titalls mikrosekunder)3. Denne evnen har blitt utnyttet til å undersøke de tidlige mekaniske hendelsene i rask skjelett 3 oghjerte 5 muskelmyosin for å avsløre belastningsavhengigheten av kraftslaget, de svake og sterke bindingstilstandene, samt rekkefølgen av biokjemiske (Pi) og mekaniske (powerstroke) hendelser.
Treperlegeometrien brukes vanligvis til å studere ikke-prosessive motorer, en enkelt perlegeometri med en kraftklemme har ofte blitt brukt til å undersøke prosessive ikke-konvensjonelle myosiner som myosin Va6. Det er imidlertid flere grunner til å foretrekke en tre-perle UFFCS-analyse også for prosessive myosiner. For det første tillater den raske påføringen av belastning rett etter aktin-myosinbinding måling av de tidlige hendelsene i kraftutvikling som i ikke-prosessive motorer. I tillegg, når det gjelder prosessive motorer, tillater det også en nøyaktig måling av motorens kjørelengder og driftsvarigheter under konstant kraft gjennom hele progresjonen (figur 1b). Videre, på grunn av den høye frekvensen av krafttilbakemeldingen, kan systemet opprettholde kraften konstant under raske endringer i posisjon, for eksempel myosin-arbeidsslaget, og garanterer dermed en konstant belastning under motorsteg. Den høye temporale oppløsningen av systemet tillater deteksjon av sub-ms-interaksjoner, og åpner muligheten for å undersøke svak binding av myosin til aktin. Til slutt garanterer analysegeometrien at kraften påføres langs aktinfilamentet, med ubetydelige tverrgående og vertikale komponenter av kraften. Dette punktet er spesielt relevant siden den vertikale kraftkomponenten har vist seg å påvirke lastavhengigheten av motorens kinetikk 7,8 betydelig. Ved å bruke denne teknikken kunne vi bruke en rekke assistive og resistive belastninger på prosessiv myosin-5B og direkte måle lastavhengigheten av dens prosessivitet for et bredt spekter av krefter4.
Som vist i figur 1a, henger en enkelt aktinfilament i dette systemet mellom to isoporperler fanget i fokus for dobbel optisk pinsett ("manualen"). En ubalansert nettokraft F = F1-F 2 påføres filamentet, gjennom et raskt tilbakemeldingssystem, som gjør at filamentet beveger seg med konstant hastighet i en retning til det når et brukerdefinert inversjonspunkt hvor nettokraften reverseres i motsatt retning. Når det motoriske proteinet ikke interagerer med filamentet, er hantelen fri til å bevege seg frem og tilbake i en trekantet bølgeform (figur 1b, bunnpanel) som spenner over sokkelperlen som et enkelt motorprotein er festet på. Når interaksjonen er etablert, overføres kraften som bæres av hantelen svært raskt til motorproteinet, og motoren begynner å forskyve filamentet ved å gå under kraftintensiteten og retningen som ble påført av tilbakemeldingssystemet på tidspunktet for interaksjonen, til myosin løsner fra aktin. Å være forskyvningen produsert av motorens stepping avhengig av polariteten til det fangede aktinfilamentet, i henhold til retningen av den påførte kraften, kan lasten enten være hjelpemiddel, dvs. skyve i samme retning av motorens forskyvning (trykk i figur 1b øvre panel), eller resistiv, dvs. trekke i motsatt retning med hensyn til motorens forskyvning (trekk i figur 1b øvre panel) som gjør det mulig å studere den kjemomekaniske reguleringen av motorens prosessivitet med både intensiteten og retningen til den påførte lasten.
I de neste avsnittene er alle trinnene for å måle aktin-myosin-5B-interaksjoner under forskjellige belastninger med et ultrafast kraftklemmespektroskopioppsett fullstendig beskrevet, inkludert 1) oppsett av det optiske oppsettet, justering av optiske feller og kalibreringsprosedyrer, 2) forberedelsene til alle komponentene og deres montering i prøvekammeret, 3) måleprosedyren, 4) Representative data og dataanalyse for å trekke ut viktige fysiske parametere, for eksempel kjørelengden, trinnstørrelsen og hastigheten til motorproteinet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;Aliphatic Amine Latex Beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A37362</td>
			<td>1.0-&#956;m diameter, 2% (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin polymerization buffer</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>BSA02</td>
			<td>10X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AODs (acousto-optic deflectors)</td>
			<td>AA Opto Electronic</td>
			<td>DTS-XY 250</td>
			<td>Laser beam deflectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated-BSA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>29130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calmodulin from porcine brain (CaM)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>208783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase from bovine liver</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Condenser</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>OlympusU-AAC, Aplanat, Achromat</td>
			<td>NA 1.4, oil immersion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine phosphate disodium salt tetrahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>27920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine Phosphokinase from rabbit muscle</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDs</td>
			<td>AA Opto Electronic</td>
			<td>AA.DDS.XX</td>
			<td>Two-channel digital synthesizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DTT)/td&#62;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-actin protein</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>AKL99</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase from Aspergillus niger</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;G7141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaloTag succinimidyl ester O2 ligand</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High vacuum silicone grease heavy</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>107921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4/K2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5379/ P8281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labview</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>version 8.1</td>
			<td>Data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labview FPGA module</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>version 8.1</td>
			<td>Fast Force-Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>2016</td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>63020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Plan-Apo 60X</td>
			<td>NA 1.2, WD 0.2 mm, water imm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N8267</td>
			<td>0.45 pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentyl acetate solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>46022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pure Ethanol</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>2860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QPDs</td>
			<td>UDT</td>
			<td>DLS-20</td>
			<td>D Position Detecto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine BSA</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A23016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine Phalloidin</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>P1951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica beads</td>
			<td>Bangslabs</td>
			<td>SS04N</td>
			<td>1.21 mm, 10% solids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin protein</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>189730</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissecting mechanoenzymatic properties of processive myosins with ultrafast force-clamp spectroscopy

Ultrafast force-clamp spectroscopy (UFFCS) er en enkelt molekylteknikk basert på laserpinsett som gjør det mulig å undersøke kjemomekanikken til både konvensjonelle og ukonvensjonelle myosiner under belastning med enestående tidsoppløsning. Spesielt har muligheten til å undersøke myosinmotorer under konstant kraft rett etter aktin-myosinbindingsdannelsen, sammen med den høye frekvensen av krafttilbakemeldingen (200 kHz), vist at UFFCS er et verdifullt verktøy for å studere belastningsavhengigheten av rask dynamikk som myosin-arbeidsslaget. Videre muliggjør UFFCS studiet av hvordan prosessive og ikke-prosessive myosin-aktin-interaksjoner påvirkes av intensiteten og retningen til den påførte kraften.
Ved å følge denne protokollen vil det være mulig å utføre ultrafast kraftklemmeeksperimenter på prosessive myosin-5-motorer og på en rekke ukonvensjonelle myosiner. Ved noen justeringer kan protokollen også enkelt utvides til studiet av andre klasser av prosessive motorer som kinesiner og dyneiner. Protokollen inneholder alle nødvendige trinn, fra oppsett av eksperimentelt apparat til prøvepreparering, kalibreringsprosedyrer, datainnsamling og analyse.

Representative data består av posisjonsposter over tid som vist i figur 4. I posisjonsposten er to typer forskyvning synlige. For det første, når myosinmotoren ikke interagerer med aktinfilamentet, beveger de fangede perlene seg med konstant hastighet mot løsningens viskøse dragkraft, og viser en lineær forskyvning som svinger innenfor oscillasjonsområdet satt av operatøren i en trekantet bølge3 (ikke synlig i figur 4</st...

Watch this Scientific Journal Video about Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy at JoVE.com

Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy

Presentert her er en omfattende protokoll for å utføre ultrafast kraftklemmeeksperimenter på prosessive myosin-5-motorer, som lett kan utvides til studiet av andre klasser av prosessive motorer. Protokollen beskriver alle nødvendige trinn, fra oppsett av eksperimentelt apparat til prøvepreparering, datainnsamling og analyse.

Dissekere mekanoenzymatiske egenskaper av prosessive myosiner med ultrafast kraft-klemmespektroskopi

Ultrafast force-clamp spectroscopy (UFFCS) is a single molecule technique based on laser tweezers that allows the investigation of the chemomechanics of ...

Ultrafast kraftklemmespektroskopi er en enkelt molekylteknikk basert på laserpinsett som gjør det mulig å undersøke kjemomekanikken til myosinmotorer under belastning med høyeste tidsoppløsning. Denne teknikken gjør det mulig å undersøke svært raske hendelser i kraftproduksjon ved å opprettholde kraftkonstanten i hver fase av motorinteraksjonen med full kontroll over kraftretningen. Ved å gjøre nødvendige justeringer kan denne protokollen enkelt brukes på andre typer prosessive motorer, inkludert kinesiner og dyneiner, for å avdekke reguleringen med makt.Etter å ha montert ett sett med akustooptiske deflektorer på en lineær oversetter, ta en iris og juster blenderåpningen for å passe til størrelsen på objektivets bakside. Erstatt målet med iris sentrert på det gjengede objektive huset. Flytt oversetteren mot laserstrålen til den delen av strålen som er blokkert av piezokrystallet er synlig etter iris, og vri oversetteren litt bakover til strålen fyller irisåpningen helt.For å forberede silikaperler i pentylacetat, fortynn først 20 mikroliter 1,2 mikron 10% faste silikaperler i 1-1,5 ml aceton med vortexing og 30 sekunder sonikering. Etter sonikering, samle perlene ved sentrifugering og resuspender perlepelleten i 1 milliliter frisk aceton for en annen vask. Etter den andre acetonvasken, vask perlene tre ganger i 1 milliliter fersk pentylacetat per vask under de samme sentrifugeringsforholdene, og resuspender pelleten i 100 mikroliter 1% nitrocellulose og 900 mikroliter pentylacetat.Bruk deretter et rent etanol-gjennomvåt stykke laboratorievev for å forsiktig tørke av et 24 x 24 millimeter glassdeksel før du bruker ren pinsett for å skylle glasset direkte i etanolen og la dekselet tørke under forsiktig nitrogenstrøm. Vortex og sonicate den tilberedte silikaperlebestanden i 30 sekunder og bruk et etanolrenset 24 x 60 millimeter deksel for å smøre 2 mikroliter silikaperleoppløsning på overflaten av det mindre dekselet. Mens perlene tørker, rengjør du et 26 x 76 millimeter lysbilde som demonstrert, og plasser to 60-100 mikron tykke linjer med 3 millimeter dobbeltsidig teipet på de lange kantene av lysbildet.Bruk ren pinsett, plasser det perlebelagte dekselet på båndet med perlene vendt mot innsiden av glidekammeret, og fyll kammeret med 15 millimolar fosfatbuffer og flytende polystyrenperleløsning. Forsegl deretter kammeret med silisiumfett. For å kalibrere piksel-til-nanometerforholdet til brightfield-kameraet, ta et første bilde av en silikaperle på dekseloverflaten omtrent 5 mikron fra midten av synsfeltet.Flytt scenen for å forskyve perlen 10 mikron mot midten av synsfeltet og ta et nytt bilde. Beregn kamerakalibreringskonstanten ved å måle pikselavstanden mellom to posisjoner av perlen. For å kalibrere felleposisjonen, fang en enkelt flytende partikkel i en felle og flytt de akustooptiske deflektorene i trinn på 0,2 megahertz, og skaff deg et bilde av partikkelen og den tilsvarende frekvensen til deflektorene for hvert trinn.Gjenta deretter kalibreringen for den andre overlappingen på samme måte. For å kalibrere fellekraften og stivheten, fang en enkelt partikkel i hver felle og forskyv begge fellene ved hjelp av de akustooptiske deflektorene i trinn på 0,2 megahertz, og registrer en brownsk bevegelse av partikkelen i begge fellene med kvadrant fotodiodedetektorer og den tilsvarende frekvensen til de akustooptiske deflektorene. Oppnå kalibreringskonstanter ved å tilpasse en Lorentzian-funksjon til et potensspektrum av den registrerte brownske bevegelsen.For å sette sammen en prøve for måling, tilsett 1 milligram per milliliter biotinylert BSA til et nytt kammer med silikaperler på dekseloverflaten. Etter 5 minutter, vask kammeret med AB-buffer og tilsett 1 milligram per milliliter streptavidin til kammeret. Etter 5 minutter, vask kammeret som demonstrert, og tilsett 3 nanomolar biotinylert Myosin-5B tung meromyosin i M5B buffer supplert med 2 mikromolar Calmodulin.Etter 5 minutter, vask kammeret tre ganger med 1 milligram per milliliter biotinylert BSA supplert med 2 mikromolar Calmodulin i AB-buffer og vent 3 minutter etter siste vask. Flow reaksjonsblandingen og forsegl kammeret med silisiumfett. For å måle prøven, plasser kammeret på mikroskopstadiet og flytt målet til de flytende alfa-aktininkulene er i fokus.Slå på en felle og fell en perle. Når den første fellen er okkupert, flytter du oversetteren for å plassere den fangede perlen nær dekkslipoverflaten for å unngå å fange flere perler, og fanger en perle i den andre fellen. Forskyv prøven gjennom langdistanseoversetterne for å finne aktinfilamenter på minst 5 mikron i lengde i løsningen.Når et filament har blitt oppdaget, flytt prøven for å la en fanget perle nærme seg den ene enden av filamentet. Når filamentet er festet, justerer du perlens avstand til den omtrentlige filamentlengden og flytter scenen for å skape en strøm i den ubundne perleretningen. Filamentet vil bli strukket av strømmen og til slutt binde seg til den andre perlen.Det resulterende komplekset kalles en manual"For å etablere aktin-myosinkontakt, skille forsiktig de to fellene og sett filamentet til forspenningsnivåer opp til ca. 3 piconewtons. For å undersøke stivheten til manualen, få en felle til å svinge i en trekantet bølge ved å endre frekvensen til en akustooptisk deflektor og verifisere den påfølgende overføringen av bevegelsen til den etterfølgende perlen gjennom posisjonssignalet. Flytt scenen for å plassere hantelen i nærheten av en pidestallsilikaperle og juster høyden på hantelen slik at aktinfilamentet kommer i kontakt med silikaperleoverflaten.Som observert i denne representative posisjonsregistreringen, når myosinmotoren ikke interagerer med aktinfilamentet, beveger de fangede perlene seg med konstant hastighet mot løsningens viskøse dragkraft. Når myosinmotoren begynner å interagere med filamentet, overføres kraften som bæres av det bevegelige filamentet meget raskt til proteinet, og systemhastigheten faller til null, med trinnhendelsene som forekommer under konstant kraft til slutten av løpet. Kraften byttes fra positiv til negativ retning av tilbakemeldingssystemet, som bytter kraftretning når perlen når kanten av oscillasjonsområdet som er satt av brukeren.Når myosinet binder og forskyver filamentet mot den positive retningen, skyver den perlen mot den øvre kanten av oscillasjonsområdet. Hvis dette skjer under hjelpekraft, vil myosinets løp bli avbrutt av kraftretningsinversjonen ved oscillasjonskanten, noe som begrenser lengden på løpet til amplituden til manualoscillasjonen. Nøyaktig justering av det optiske systemet er nødvendig for å oppnå optimal romlig og tidsmessig oppløsning, mens en nøyaktig kalibrering er nødvendig for å nøyaktig bestemme verdiene til de påførte kreftene.Denne teknikken har blitt tilpasset for å studere glidende og målrettet søk av transkripsjonsfaktorer i DNA, samt dynamiske interaksjoner mellom mekanotransduksjonsproteiner som indukterer over mikrotubulifilamenter.

Research

JoVE Journal

Biology

Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale.   This ...

Dissecting the Non-human Primate Brain in Stereotaxic Space

The use of non-human primates provides an excellent translational model for our understanding of developmental and aging processes in humans1-6. In ...

The Gateway to the Brain: Dissecting the Primate Eye

The visual system in humans is considered the  gateway  to the world and plays a principal role in the plethora of sensory, perceptual and cognitive ...

Exploring Cognitive Functions in Babies, Children &amp; Adults with Near Infrared Spectroscopy

Exploring Cognitive Functions in Babies, Children & Adults with Near Infrared Spectroscopy

An explosion of functional Near Infrared Spectroscopy (fNIRS) studies investigating cortical activation in relation to higher cognitive processes, such as ...

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue ...

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

Kombinere Single-molekyl Manipulasjon og bildebehandling for studier av protein-DNA interaksjoner

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase (ERK) Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase ERK Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Photostimulation av femtosecond laser aktiverer ekstracellulære-signal-regulert kinase (ERK) signalering eller mitokondrie hendelser i målceller

Direct control of cellular defined molecular events is important to life science. Recently, studies have demonstrated that femtosecond laser stimulation ...

Quantification of Cellular Densities and Antigenic Properties using Magnetic Levitation

Kvantifisering av cellulære tettheter og antigene egenskaper ved hjelp av magnetisk levitasjon

The described method was developed based on the principles of magnetic levitation, which separates cells and particles based on their density and magnetic ...

Detection of Protein Aggregation using Fluorescence Correlation Spectroscopy

Påvisning av proteinaggregering ved hjelp av fluorescenskorrelasjonsspektroskopi

Protein aggregation is a hallmark of neurodegenerative disorders such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Alzheimer's disease (AD), Parkinson's ...