Name: dissecting mechanoenzymatic properties of processive myosins with ultrafast force-clamp spectroscopy
Uploaded: 2021-07-01T13:30:00
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Este trabalho foi apoiado pelo programa de investigação e inovação Horizonte 2020 da União Europeia ao abrigo do Acordo de Subvenção n.º 871124 Laserlab-Europe, pelo Ministério da Universidade e Investigação italiano (FIRB "Futuro in Ricerca" 2013 Grant No. RBFR13V4M2) e por Ente Cassa di Risparmio di Firenze. A.V. Kashchuk foi apoiado pela Human Frontier Science Program Cross-Disciplinary Fellowship LT008/2020-C.

1. Configuração óptica
NOTA: A configuração experimental é composta por pinças ópticas duplas com estabilidade de apontamento nanométrico e < flutuações de intensidade de laser de 1%. Nessas condições, a estabilidade do haltere no nível nanométrico é garantida sob rigidez típica do purgador (0,1 pN / nm) e tensão (1 pN - algumas dezenas de pN). A Figura 2 mostra um esquema detalhado da configuração óptica.
<ol><li>Projeto e construção de p...

<ol>
	<li>Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+a+single-beam+gradient+force+optical+trap+for+dielectric+particles.">Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles.</a> Optical Angular Momentum. 11 (5), 196-198 (2016).</li><li>Capitanio, M., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+biology+with+force:+Single+molecule+high-resolution+measurements+with+optical+tweezers.">Interrogating biology with force: Single molecule high-resolution measurements with optical tweezers.</a> Biophysical Journal. 105 (6), 1293-1303 (2013).</li><li>Capitanio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+force-clamp+spectroscopy+of+single+molecules+reveals+load+dependence+of+myosin+working+stroke.">Ultrafast force-clamp spectroscopy of single molecules reveals load dependence of myosin working stroke.</a> Nature Methods. 9 (10), 1013-1019 (2012).</li><li>Gardini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+myosin-5B+mechanosensitivity+and+calcium+regulation+at+the+single+molecule+level.">Dissecting myosin-5B mechanosensitivity and calcium regulation at the single molecule level.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li><li>Woody, M. S., Winkelmann, D. A., Capitanio, M., Ostap, E. M., Goldman, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+mechanics+resolves+the+earliest+events+in+force+generation+by+cardiac+myosin.">Single molecule mechanics resolves the earliest events in force generation by cardiac myosin.</a> eLife. 8, 49266 (2019).</li><li>Clemen, A. E. -. M., Vilfan, M., Jaud, J., Zhang, J., B&#228;, M., Rief, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-dependent+stepping+kinetics+of+myosin-V.">Force-dependent stepping kinetics of myosin-V.</a> Biophysical Journal. 88, 4402-4410 (2005).</li><li>Howard, J., Hancock, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+beads+are+better+than+one.">Three beads are better than one.</a> Biophysical Journal. 118 (1), 1-3 (2020).</li><li>Pyrpassopoulos, S., Shuman, H., Ostap, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+kinesin's+load-bearing+capacity+by+force+geometry+and+the+microtubule+track.">Modulation of kinesin's load-bearing capacity by force geometry and the microtubule track.</a> Biophysical Journal. 118 (1), 243-253 (2020).</li><li>Capitanio, M., Maggi, D., Vanzi, F., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FIONA+in+the+trap:+The+advantages+of+combining+optical+tweezers+and+fluorescence.">FIONA in the trap: The advantages of combining optical tweezers and fluorescence.</a> Journal of Optics A: Pure and Applied Optics. 9 (8), 157 (2007).</li><li>Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Position+control+and+optical+manipulation+for+nanotechnology+applications.">Position control and optical manipulation for nanotechnology applications.</a> European Physical Journal B. 46 (1), 1-8 (2005).</li><li>Capitanio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Optical Tweezers. An introduction to Single Molecule Biophysics. , (2017).</li><li>Capitanio, M., Cicchi, R., Saverio Pavone, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+and+time-shared+multiple+optical+tweezers+for+the+study+of+single+motor+proteins.">Continuous and time-shared multiple optical tweezers for the study of single motor proteins.</a> Optics and Lasers in Engineering. 45 (4), 450-457 (2007).</li><li>Gardini, L., Tempestini, A., Pavone, F. S., Capitanio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+optical+tweezers+for+the+study+of+single+molecular+motors.">High-speed optical tweezers for the study of single molecular motors.</a> Methods in Molecular Biology. 1805, (2018).</li><li>Capitanio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calibration+of+optical+tweezers+with+differential+interference+contrast+signals.">Calibration of optical tweezers with differential interference contrast signals.</a> Review of Scientific Instruments. 73 (4), 1687 (2002).</li><li>Monico, C., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S., Capitanio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+single-molecule+manipulation+and+imaging+for+the+study+of+protein-DNA+interactions.">Combining single-molecule manipulation and imaging for the study of protein-DNA interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. (90), e51446 (2014).</li><li>Greenberg, M. J., Lin, T., Goldman, Y. E., Shuman, H., Ostap, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+IC+generates+power+over+a+range+of+loads+via+a+new+tension-sensing+mechanism.">Myosin IC generates power over a range of loads via a new tension-sensing mechanism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), 2433-2440 (2012).</li><li>Gardini, L., Arbore, C., Capitanio, M., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+single+molecule+imaging+and+tracking+of+processive+myosin+motors.">A protocol for single molecule imaging and tracking of processive myosin motors.</a> MethodsX. 6, 1854-1862 (2019).</li><li>Ramaiya, A., Roy, B., Bugiel, M., Sch&#228;ffer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+rotates+unidirectionally+and+generates+torque+while+walking+on+microtubules.">Kinesin rotates unidirectionally and generates torque while walking on microtubules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (41), 10894-10899 (2017).</li></ol>

Embora as técnicas de molécula única, como o ensaio de três contas, sejam tecnicamente desafiadoras e de baixo rendimento, o UFFCS melhora a detecção de interações moleculares graças à alta relação sinal-ruído dos dados. A UFFCS permite o estudo da dependência de carga de proteínas motoras, com as principais vantagens de aplicar a força muito rapidamente após a ligação do motor ao filamento para sondar eventos precoces e muito rápidos na produção de força e estados de ligação fracos sob força co...

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Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy
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Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy

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Erratum: Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy

Nas últimas décadas, as pinças ópticas têm sido uma ferramenta valiosa para elucidar a mecanoquímica das interações proteicas no nível de molécula única, devido à impressionante possibilidade de manipulação e mensuração simultâneas de alterações conformacionais e cinética enzimática 1,2. Em particular, a capacidade de aplicar e medir forças na faixa daquelas exercidas por motores moleculares na célula, juntamente com a capacidade de medir mudanças conformacionais subnanométricas, tornou as pinças ópticas uma ferramenta única de molécula única para desvendar as propriedades quimiomecânicas das proteínas motoras e sua regulação mecânica.
A espectroscopia de pinça de força ultrarrápida (UFFCS) é uma técnica de espectroscopia de força de molécula única baseada em pinças ópticas, desenvolvida para estudar a cinética rápida de motores moleculares sob carga em uma geometria de três esferas (Figura 1a)3,4. A UFFCS reduz o intervalo de tempo para aplicação de força à proteína motora ao limite físico das pinças ópticas, ou seja, o tempo de relaxamento mecânico do sistema, permitindo assim a aplicação da força rapidamente após o início de uma corrida de miosina (poucas dezenas de microssegundos)3. Essa capacidade tem sido explorada para investigar os primeiros eventos mecânicos na miosina do músculo esquelético rápido 3 e cardíaco5 para revelar a dependência de carga do powerstroke, os estados de ligação fraca e forte, bem como a ordem dos eventos bioquímicos (Pi) e mecânicos (powerstroke).
A geometria de três esferas é geralmente empregada para estudar motores não processivos, uma geometria de um único grânulo com um grampo de força tem sido comumente usada para investigar miosinas processivas não convencionais, como a miosina Va6. No entanto, existem várias razões para preferir um ensaio UFFCS de três contas também para miosinas processivas. Em primeiro lugar, a rápida aplicação da carga logo após a ligação actina-miosina permite a medição dos eventos iniciais no desenvolvimento da força, como em motores não processivos. Além disso, no caso de motores processivos, também permite uma medição precisa dos comprimentos de funcionamento e durações de funcionamento do motor sob força constante durante toda a sua progressão (Figura 1b). Além disso, devido à alta taxa de feedback de força, o sistema pode manter a força constante durante mudanças rápidas de posição, como o curso de trabalho da miosina, garantindo assim uma carga constante durante o passo motor. A alta resolução temporal do sistema permite a detecção de interações sub-ms, abrindo a possibilidade de investigar a fraca ligação da miosina à actina. Finalmente, a geometria do ensaio garante que a força seja aplicada ao longo do filamento de actina, com componentes transversais e verticais insignificantes da força. Este ponto é de particular relevância, uma vez que o componente de força vertical demonstrou influenciar significativamente a dependência de carga da cinética do motor 7,8. Utilizando essa técnica, pudemos aplicar uma gama de cargas assistivas e resistivas à miosina-5B processiva e medir diretamente a dependência de carga de sua processividade para uma ampla gama de forças4.
Como mostrado na Figura 1a, neste sistema um único filamento de actina é suspenso entre duas esferas de poliestireno presas no foco de pinças ópticas duplas (o "haltere"). Uma força líquida desequilibrada F= F1-F 2 é imposta ao filamento, através de um sistema de feedback rápido, que faz com que o filamento se mova a uma velocidade constante em uma direção até atingir um ponto de inversão definido pelo usuário, onde a força líquida é revertida na direção oposta. Quando a proteína motora não está interagindo com o filamento, o haltere está livre para se mover para frente e para trás em uma forma de onda triangular (Figura 1b, painel inferior) abrangendo o grânulo do pedestal no qual uma única proteína motora está ligada. Uma vez que a interação é estabelecida, a força transportada pelo haltere é muito rapidamente transferida para a proteína motora e o motor começa a deslocar o filamento, pisando sob a intensidade e direção da força que foi aplicada pelo sistema de feedback no momento da interação, até que a miosina se desprenda da actina. Sendo o deslocamento produzido pelo passo do motor dependente da polaridade do filamento de actina preso, de acordo com a direção da força aplicada a carga pode ser tanto assistiva, ou seja, empurrando na mesma direção do deslocamento do motor (empurrar no painel superior da Figura 1b), ou resistiva, ou seja, puxando na direção oposta em relação ao deslocamento do motor (puxar na Figura 1b painel superior) possibilitando estudar a regulação quimiomecânica da processividade motora tanto pela intensidade quanto pela direcionalidade da carga aplicada.
Nas próximas seções, todas as etapas para medir as interações actina-miosina-5B sob diferentes cargas com uma configuração ultrarrápida de espectroscopia força-pinça são totalmente descritas, incluindo 1) a configuração da configuração óptica, alinhamento de armadilhas ópticas e procedimentos de calibração, 2) as preparações de todos os componentes e sua montagem na câmara de amostra, 3) o procedimento de medição, 4) dados representativos e análise de dados para extrair parâmetros físicos importantes, como o comprimento da corrida, o tamanho do passo e a velocidade da proteína motora.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;Aliphatic Amine Latex Beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A37362</td>
			<td>1.0-&#956;m diameter, 2% (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin polymerization buffer</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>BSA02</td>
			<td>10X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AODs (acousto-optic deflectors)</td>
			<td>AA Opto Electronic</td>
			<td>DTS-XY 250</td>
			<td>Laser beam deflectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated-BSA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>29130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calmodulin from porcine brain (CaM)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>208783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase from bovine liver</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Condenser</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>OlympusU-AAC, Aplanat, Achromat</td>
			<td>NA 1.4, oil immersion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine phosphate disodium salt tetrahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>27920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine Phosphokinase from rabbit muscle</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDs</td>
			<td>AA Opto Electronic</td>
			<td>AA.DDS.XX</td>
			<td>Two-channel digital synthesizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DTT)/td&#62;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-actin protein</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>AKL99</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase from Aspergillus niger</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;G7141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaloTag succinimidyl ester O2 ligand</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High vacuum silicone grease heavy</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>107921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4/K2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5379/ P8281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labview</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>version 8.1</td>
			<td>Data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labview FPGA module</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>version 8.1</td>
			<td>Fast Force-Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>2016</td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>63020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Plan-Apo 60X</td>
			<td>NA 1.2, WD 0.2 mm, water imm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N8267</td>
			<td>0.45 pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentyl acetate solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>46022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pure Ethanol</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>2860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QPDs</td>
			<td>UDT</td>
			<td>DLS-20</td>
			<td>D Position Detecto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine BSA</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A23016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine Phalloidin</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>P1951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica beads</td>
			<td>Bangslabs</td>
			<td>SS04N</td>
			<td>1.21 mm, 10% solids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin protein</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>189730</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissecting mechanoenzymatic properties of processive myosins with ultrafast force-clamp spectroscopy

A espectroscopia ultrarrápida de pinça de força (UFFCS) é uma técnica de molécula única baseada em pinças a laser que permite a investigação da quimiomecânica de miosinas convencionais e não convencionais sob carga com resolução de tempo sem precedentes. Em particular, a possibilidade de sondar motores de miosina sob força constante logo após a formação da ligação actina-miosina, juntamente com a alta taxa de feedback de força (200 kHz), mostrou que a UFFCS é uma ferramenta valiosa para estudar a dependência de carga de dinâmicas rápidas, como o acidente vascular cerebral de trabalho da miosina. Além disso, a UFFCS permite o estudo de como as interações miosina-actina processivas e não processivas são influenciadas pela intensidade e direção da força aplicada.
Seguindo este protocolo, será possível realizar experimentos ultrarrápidos de pinça de força em motores de miosina-5 processiva e em uma variedade de miosinas não convencionais. Por alguns ajustes, o protocolo também poderia ser facilmente estendido para o estudo de outras classes de motores processivos, como cinesinas e dineínas. O protocolo inclui todas as etapas necessárias, desde a instalação do aparelho experimental até a preparação da amostra, procedimentos de calibração, aquisição e análise de dados.

Os dados representativos consistem em registros de posição ao longo do tempo, conforme mostrado na Figura 4. No registro de posição dois tipos de deslocamento são visíveis. Em primeiro lugar, quando o motor de miosina não está interagindo com o filamento de actina, as esferas presas estão se movendo a uma velocidade constante contra a força de arrasto viscosa da solução, mostrando um deslocamento linear oscilando dentro da faixa de oscilação definida pelo operador em uma onda t...

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Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy

Apresenta-se aqui um protocolo abrangente para a realização de experimentos ultrarrápidos de pinça de força em motores processivos de miosina-5, que poderia ser facilmente estendido para o estudo de outras classes de motores processivos. O protocolo detalha todas as etapas necessárias, desde a instalação do aparato experimental até a preparação da amostra, aquisição e análise dos dados.

Dissecando as propriedades mecanoenzimáticas de miosinas processivas com espectroscopia de força-braçadeira ultrarrápida

Ultrafast force-clamp spectroscopy (UFFCS) is a single molecule technique based on laser tweezers that allows the investigation of the chemomechanics of ...

A espectroscopia de pinça de força ultrarrápida é uma técnica de molécula única baseada em pinças a laser que permite investigar a quimiomecânica de motores de miosinas sob carga com a maior resolução de tempo. Esta técnica permite sondar eventos muito rápidos na produção de força, mantendo a força constante durante todas as fases da interação motora com controle total sobre a direcionalidade da força. Ao fazer os ajustes apropriados, este protocolo poderia ser facilmente aplicado a outros tipos de motores processivos, incluindo cinesinas e dineínas, para descobrir a regulação pela força.Depois de montar um conjunto de defletores acousto-ópticos em um tradutor linear, pegue uma íris e ajuste sua abertura para se ajustar ao tamanho da abertura traseira objetiva. Substitua a objetiva pela íris centrada na caixa da objetiva rosqueada. Mova o tradutor em direção ao feixe de laser até que a parte do feixe bloqueada pelo cristal piezo seja visível após a íris e gire o tradutor ligeiramente para trás até que o feixe preencha completamente a abertura da íris.Para preparar contas de sílica em acetato de pentila, primeiro dilua 20 microlitros de 1,2 mícron 10% de contas de sílica sólida em 1-1,5 mililitros de acetona com vórtice e 30 segundos de sonicação. Após a sonicação, recolha as contas por centrifugação e ressuscite o grânulo em 1 mililitro de acetona fresca para uma segunda lavagem. Após a segunda lavagem com acetona, lave as contas três vezes em 1 mililitro de acetato de pentila fresco por lavagem sob as mesmas condições de centrifugação e ressuspenda o pellet em 100 microlitros de 1% de nitrocelulose e 900 microlitros de acetato de pentila.Em seguida, use um pedaço de tecido de laboratório embebido em etanol puro para limpar cuidadosamente uma tampa de vidro de 24 x 24 milímetros antes de usar pinças limpas para enxaguar o vidro diretamente no etanol e permitir que a tampa seque sob um fluxo suave de nitrogênio. Vórtice e sonicate o caldo de contas de sílica preparado por 30 segundos e use um coverslip de 24 x 60 milímetros limpo a etanol para espalhar 2 microlitros de solução de grânulo de sílica na superfície do coverslip menor. Enquanto as contas estão secando, limpe uma lâmina de 26 x 76 milímetros, conforme demonstrado, e coloque duas linhas de 60-100 mícrons de espessura de 3 milímetros de dupla face coladas nas bordas longas do slide.Usando pinças limpas, coloque a tampa revestida de contas na fita com as contas voltadas para o interior da câmara deslizante e encha a câmara com tampão fosfato de 15 milimolares e solução flutuante de esferas de poliestireno. Em seguida, sele a câmara com graxa de silício. Para calibrar a relação pixel-nanômetro da câmera de campo brilhante, adquira uma primeira imagem de um grânulo de sílica na superfície da tampa a aproximadamente 5 mícrons do centro do campo de visão.Mova o palco para deslocar o talão de 10 mícrons em direção ao centro do campo de visão e tire uma segunda imagem. Calcule a constante de calibração da câmera medindo a distância de pixels entre duas posições do talão. Para calibrar a posição do purgador, prenda uma única partícula flutuante em um purgador e mova os defletores acousto-ópticos em passos de 0,2 mega-hertz, adquirindo uma imagem da partícula e a frequência correspondente dos defletores para cada passo.Em seguida, repita a calibração para o segundo purgador da mesma maneira. Para calibrar a potência e a rigidez do purgador, prenda uma única partícula em cada purgador e desloque ambas as armadilhas usando os defletores acousto-ópticos em passos de 0,2 mega-hertz, registrando um movimento browniano da partícula em ambas as armadilhas com detectores de fotodiodo de quadrante e a frequência correspondente dos defletores acousto-ópticos. Obtenha constantes de calibração ajustando uma função lorentziana a um espectro de potência do movimento browniano registrado.Para montar uma amostra para medição, adicione 1 miligrama por mililitro de BSA biotinilado a uma nova câmara com contas de sílica na superfície da tampa. Após 5 minutos, lave a câmara com tampão AB e adicione 1 miligrama por mililitro de estreptavidina à câmara. Após 5 minutos, lavar a câmara, conforme demonstrado, e adicionar 3 miosina pesada biotinilada nanomolar biotinilada em tampão M5B suplementado com 2 calmodulina micromolar.Após 5 minutos, lavar a câmara três vezes com 1 miligrama por mililitro de BSA biotinilada suplementada com 2 calmodulinas micromolares em tampão AB e aguardar 3 minutos após a lavagem final. Fluidar a mistura de reação e selar a câmara com graxa de silício. Para medir a amostra, coloque a câmara no estágio do microscópio e mova a objetiva até que as esferas flutuantes de alfa-actinina estejam em foco.Ligue uma armadilha e prenda um talão. Uma vez que a primeira armadilha esteja ocupada, mova o tradutor para posicionar o talão preso perto da superfície da tampa para evitar prender várias contas e prenda um talão na segunda armadilha. Deslocar a amostra através dos tradutores de longo alcance para localizar filamentos de actina de pelo menos 5 mícrons de comprimento dentro da solução.Quando um filamento tiver sido avistado, mova a amostra para deixar uma conta presa se aproximar de uma extremidade do filamento. Uma vez que o filamento tenha sido anexado, ajuste a distância do talão ao comprimento aproximado do filamento e mova o palco para criar um fluxo na direção do grânulo não ligado. O filamento será esticado pelo fluxo e, eventualmente, se ligará ao segundo grânulo.O complexo resultante é chamado de haltere"Para estabelecer contato actina-miosina, separe suavemente as duas armadilhas e ajuste o filamento para níveis de pretensão de até cerca de 3 piconewtons. Para sondar a rigidez do haltere, faça uma armadilha oscilar em uma onda triangular, alterando a frequência de um defletor acousto-óptico e verificando a consequente transmissão do movimento para o cordão de fuga através de seu sinal de posição. Mova o palco para posicionar o haltere na proximidade de um grânulo de sílica de pedestal e ajuste a altura do haltere para que o filamento de actina entre em contato com a superfície do grânulo de sílica.Como observado neste registro de posição representativa, quando o motor da miosina não está interagindo com o filamento de actina, as esferas presas se movem a uma velocidade constante contra a força de arrasto viscosa da solução. Uma vez que o motor da miosina começa a interagir com o filamento, a força transportada pelo filamento em movimento é muito rapidamente transferida para a proteína, e a velocidade do sistema cai para zero, com os eventos de pisada ocorrendo sob força constante até o final da corrida. A força é comutada da direção positiva para a negativa pelo sistema de feedback, que muda a direção da força quando o talão atinge a borda da faixa de oscilação definida pelo usuário.Quando a miosina se liga e desloca o filamento em direção à direção positiva, ela empurra o talão em direção à borda superior da faixa de oscilação. Se isso acontecer sob força auxiliar, o funcionamento da miosina será interrompido pela inversão da direção da força na borda de oscilação, limitando o comprimento da corrida à amplitude da oscilação do haltere. O alinhamento preciso do sistema óptico é necessário para alcançar a resolução espacial e temporal ideal, enquanto uma calibração precisa é necessária para determinar com precisão os valores das forças aplicadas.Esta técnica foi adaptada para estudar a busca deslizante e direcionada de fatores de transcrição no DNA, bem como interações dinâmicas entre proteínas de mecanotransdução induzidas sobre filamentos de microtúbulos.

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