Name: dissecting mechanoenzymatic properties of processive myosins with ultrafast force-clamp spectroscopy
Uploaded: 2021-07-01T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy at JoVE.com

Эта работа была поддержана исследовательской и инновационной программой Европейского Союза Horizon 2020 в рамках Грантового соглашения No 871124 Laserlab-Europe, Министерством университетов и исследований Италии (грант FIRB «Futuro in Ricerca» 2013 года No RBFR13V4M2) и Ente Cassa di Risparmio di Firenze. А.В. Кащук получил поддержку междисциплинарной стипендии Human Frontier Science Program Lt008/2020-C.

1. Оптическая настройка
ПРИМЕЧАНИЕ: Экспериментальная установка состоит из двойного оптического пинцета с нанометровой стабильностью и < колебаниями интенсивности лазера 1%. В этих условиях стабильность гантели на нанометровом уровне гарантируется при типичной жесткост...

<ol>
	<li>Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+a+single-beam+gradient+force+optical+trap+for+dielectric+particles.">Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles.</a> Optical Angular Momentum. 11 (5), 196-198 (2016).</li><li>Capitanio, M., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+biology+with+force:+Single+molecule+high-resolution+measurements+with+optical+tweezers.">Interrogating biology with force: Single molecule high-resolution measurements with optical tweezers.</a> Biophysical Journal. 105 (6), 1293-1303 (2013).</li><li>Capitanio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+force-clamp+spectroscopy+of+single+molecules+reveals+load+dependence+of+myosin+working+stroke.">Ultrafast force-clamp spectroscopy of single molecules reveals load dependence of myosin working stroke.</a> Nature Methods. 9 (10), 1013-1019 (2012).</li><li>Gardini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+myosin-5B+mechanosensitivity+and+calcium+regulation+at+the+single+molecule+level.">Dissecting myosin-5B mechanosensitivity and calcium regulation at the single molecule level.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li><li>Woody, M. S., Winkelmann, D. A., Capitanio, M., Ostap, E. M., Goldman, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+mechanics+resolves+the+earliest+events+in+force+generation+by+cardiac+myosin.">Single molecule mechanics resolves the earliest events in force generation by cardiac myosin.</a> eLife. 8, 49266 (2019).</li><li>Clemen, A. E. -. M., Vilfan, M., Jaud, J., Zhang, J., B&#228;, M., Rief, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-dependent+stepping+kinetics+of+myosin-V.">Force-dependent stepping kinetics of myosin-V.</a> Biophysical Journal. 88, 4402-4410 (2005).</li><li>Howard, J., Hancock, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+beads+are+better+than+one.">Three beads are better than one.</a> Biophysical Journal. 118 (1), 1-3 (2020).</li><li>Pyrpassopoulos, S., Shuman, H., Ostap, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+kinesin's+load-bearing+capacity+by+force+geometry+and+the+microtubule+track.">Modulation of kinesin's load-bearing capacity by force geometry and the microtubule track.</a> Biophysical Journal. 118 (1), 243-253 (2020).</li><li>Capitanio, M., Maggi, D., Vanzi, F., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FIONA+in+the+trap:+The+advantages+of+combining+optical+tweezers+and+fluorescence.">FIONA in the trap: The advantages of combining optical tweezers and fluorescence.</a> Journal of Optics A: Pure and Applied Optics. 9 (8), 157 (2007).</li><li>Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Position+control+and+optical+manipulation+for+nanotechnology+applications.">Position control and optical manipulation for nanotechnology applications.</a> European Physical Journal B. 46 (1), 1-8 (2005).</li><li>Capitanio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Optical Tweezers. An introduction to Single Molecule Biophysics. , (2017).</li><li>Capitanio, M., Cicchi, R., Saverio Pavone, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+and+time-shared+multiple+optical+tweezers+for+the+study+of+single+motor+proteins.">Continuous and time-shared multiple optical tweezers for the study of single motor proteins.</a> Optics and Lasers in Engineering. 45 (4), 450-457 (2007).</li><li>Gardini, L., Tempestini, A., Pavone, F. S., Capitanio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+optical+tweezers+for+the+study+of+single+molecular+motors.">High-speed optical tweezers for the study of single molecular motors.</a> Methods in Molecular Biology. 1805, (2018).</li><li>Capitanio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calibration+of+optical+tweezers+with+differential+interference+contrast+signals.">Calibration of optical tweezers with differential interference contrast signals.</a> Review of Scientific Instruments. 73 (4), 1687 (2002).</li><li>Monico, C., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S., Capitanio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+single-molecule+manipulation+and+imaging+for+the+study+of+protein-DNA+interactions.">Combining single-molecule manipulation and imaging for the study of protein-DNA interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. (90), e51446 (2014).</li><li>Greenberg, M. J., Lin, T., Goldman, Y. E., Shuman, H., Ostap, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+IC+generates+power+over+a+range+of+loads+via+a+new+tension-sensing+mechanism.">Myosin IC generates power over a range of loads via a new tension-sensing mechanism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), 2433-2440 (2012).</li><li>Gardini, L., Arbore, C., Capitanio, M., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+single+molecule+imaging+and+tracking+of+processive+myosin+motors.">A protocol for single molecule imaging and tracking of processive myosin motors.</a> MethodsX. 6, 1854-1862 (2019).</li><li>Ramaiya, A., Roy, B., Bugiel, M., Sch&#228;ffer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+rotates+unidirectionally+and+generates+torque+while+walking+on+microtubules.">Kinesin rotates unidirectionally and generates torque while walking on microtubules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (41), 10894-10899 (2017).</li></ol>

Хотя методы с одной молекулой, такие как трехшарновый анализ, технически сложны и имеют низкую пропускную способность, UFFCS улучшает обнаружение молекулярных взаимодействий благодаря высокому соотношению сигнал/шум данных. UFFCS позволяет изучать нагрузочно-зависимость моторных белков,...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62388">Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy</a>. The title was updated.
The title was updated from:
Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy
to:
Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62388">Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy</a>. The title was updated.

Erratum: Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy

В последние десятилетия оптический пинцет был ценным инструментом для выяснения механохимии белковых взаимодействий на уровне одной молекулы из-за поразительной возможности одновременных манипуляций и измерения конформационных изменений и ферментативной кинетики 1,2. В частности, способность применять и измерять силы в диапазоне сил, оказываемых молекулярными двигателями в клетке, вместе со способностью измерять субнанометровые конформационные изменения сделали оптический пинцет уникальным одномолекулярным инструментом для разгадки хемомеханических свойств моторных белков и их механической регуляции.
Сверхбыстрая силово-зажимная спектроскопия (UFFCS) - это метод одномолекулярной силовой спектроскопии, основанный на оптических пинцетах, разработанный для изучения быстрой кинетики молекулярных двигателей под нагрузкой в трехшаровой геометрии (рисунок 1a)3,4. UFFCS сокращает временной лаг для приложения силы к моторному белку до физического предела оптического пинцета, т. е. времени механической релаксации системы, что позволяет быстро прикладывать силу после начала пробега миозина (несколько десятков микросекунд)3. Эта способность была использована для исследования ранних механических событий в быстрых скелетных 3 и сердечных5 мышцах миозина, чтобы выявить зависимость нагрузки от силового удара, слабых и сильных связывающих состояний, а также порядок биохимических (Pi) и механических (powerstroke) событий.
Геометрия из трех шариков обычно используется для изучения непроцессных двигателей, геометрия одного шарика с силовым зажимом обычно используется для исследования процессных нетрадиционных миозинов, таких как миозин Va6. Тем не менее, есть несколько причин, чтобы предпочесть анализ UFFCS с тремя шариками также для процессивных миозинов. Во-первых, быстрое применение нагрузки сразу после связывания актин-миозин позволяет измерять ранние события в развитии силы, как в непроцессных двигателях. Кроме того, в случае процессивных двигателей это также позволяет точно измерять длину хода двигателя и продолжительность хода при постоянном усилии на протяжении всей их прогрессии (рисунок 1b). Кроме того, из-за высокой скорости силовой обратной связи система может поддерживать постоянную силу во время быстрых изменений положения, таких как рабочий ход миозина, тем самым гарантируя постоянную нагрузку во время шага двигателя. Высокое временное разрешение системы позволяет обнаруживать суб-мс взаимодействия, открывая возможность исследования слабого связывания миозина с актином. Наконец, геометрия анализа гарантирует, что сила приложена вдоль актиновой нити, с незначительными поперечными и вертикальными компонентами силы. Этот момент имеет особое значение, поскольку было показано, что вертикальная силовая составляющая существенно влияет на нагрузочную зависимость кинетики двигателя 7,8. Используя эту технику, мы могли бы применить ряд вспомогательных и резистивных нагрузок к процессивному миозину-5B и непосредственно измерить зависимость нагрузки от его процессивности для широкого диапазона сил4.
Как показано на фиг.1а, в этой системе одна актиновая нить подвешена между двумя полистирольными шариками, захваченными в фокусе двойного оптического пинцета («гантели»). Несбалансированная чистая сила F= F1-F 2 накладывается на нить через систему быстрой обратной связи, которая заставляет нить накала двигаться с постоянной скоростью в одном направлении, пока она не достигнет определенной пользователем точки инверсии, где чистая сила обращена в противоположном направлении. Когда моторный белок не взаимодействует с нитью, гантель может свободно перемещаться вперед и назад в форме треугольной волны (рисунок 1b, нижняя панель), охватывающей бусину пьедестала, на которой прикреплен один двигательный белок. Как только взаимодействие установлено, сила, переносимая гантелью, очень быстро передается моторному белку, и двигатель начинает вытеснять нить накала, наступая под интенсивность и направление силы, которые были приложены системой обратной связи во время взаимодействия, пока миозин не отделяется от актина. Поскольку смещение, создаваемое шагом двигателя, зависит от полярности захваченной актиновой нити накала, в зависимости от направления приложенной силы нагрузка может быть либо вспомогательной, т.е. толкающей в том же направлении двигатель смещения (толчок на фиг.1b верхней панели), либо резистивной, т.е. тягой в противоположном направлении по отношению к смещению двигателя (тяга на фиг.1b) верхняя панель), позволяющая изучать хемомеханическую регуляцию двигательной процессности как по интенсивности, так и по направленности приложенной нагрузки.
В следующих разделах полностью описаны все этапы измерения взаимодействий актин-миозин-5В при различных нагрузках с установкой сверхбыстрой силово-зажимной спектроскопии, в том числе 1) настройка оптической установки, выравнивание оптических ловушек и процедуры калибровки, 2) подготовка всех компонентов и их сборка в камере для образцов, 3) процедура измерения, 4) репрезентативные данные и анализ данных для извлечения важных физических параметров, таких как длина пробега, размер шага и скорость моторного белка.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;Aliphatic Amine Latex Beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A37362</td>
			<td>1.0-&#956;m diameter, 2% (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin polymerization buffer</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>BSA02</td>
			<td>10X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AODs (acousto-optic deflectors)</td>
			<td>AA Opto Electronic</td>
			<td>DTS-XY 250</td>
			<td>Laser beam deflectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated-BSA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>29130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calmodulin from porcine brain (CaM)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>208783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase from bovine liver</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Condenser</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>OlympusU-AAC, Aplanat, Achromat</td>
			<td>NA 1.4, oil immersion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine phosphate disodium salt tetrahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>27920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine Phosphokinase from rabbit muscle</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDs</td>
			<td>AA Opto Electronic</td>
			<td>AA.DDS.XX</td>
			<td>Two-channel digital synthesizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DTT)/td&#62;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-actin protein</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>AKL99</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase from Aspergillus niger</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;G7141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaloTag succinimidyl ester O2 ligand</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High vacuum silicone grease heavy</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>107921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4/K2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5379/ P8281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labview</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>version 8.1</td>
			<td>Data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labview FPGA module</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>version 8.1</td>
			<td>Fast Force-Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>2016</td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>63020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Plan-Apo 60X</td>
			<td>NA 1.2, WD 0.2 mm, water imm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N8267</td>
			<td>0.45 pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentyl acetate solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>46022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pure Ethanol</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>2860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QPDs</td>
			<td>UDT</td>
			<td>DLS-20</td>
			<td>D Position Detecto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine BSA</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A23016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine Phalloidin</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>P1951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica beads</td>
			<td>Bangslabs</td>
			<td>SS04N</td>
			<td>1.21 mm, 10% solids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin protein</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>189730</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissecting mechanoenzymatic properties of processive myosins with ultrafast force-clamp spectroscopy

Сверхбыстрая силово-зажимная спектроскопия (UFFCS) представляет собой одномолекулярную методику, основанную на лазерном пинцете, которая позволяет исследовать хемомеханику как обычных, так и нетрадиционных миозинов под нагрузкой с беспрецедентным временным разрешением. В частности, возможность зондирования миозиновых двигателей под постоянной силой сразу после образования актин-миозиновой связи вместе с высокой скоростью силовой обратной связи (200 кГц) показала, что UFFCS является ценным инструментом для изучения зависимости нагрузки от быстрой динамики, такой как рабочий ход миозина. Кроме того, UFFCS позволяет изучать, как процессивные и непроцессные взаимодействия миозин-актин влияют на интенсивность и направление приложенной силы.
Следуя этому протоколу, можно будет проводить сверхбыстрые эксперименты с силовым зажимом на процессивных двигателях миозина-5 и на различных нетрадиционных миозинах. Путем некоторых корректировок протокол также может быть легко распространен на изучение других классов процессивных двигателей, таких как кинезины и динеины. Протокол включает в себя все необходимые этапы, от настройки экспериментального аппарата до пробоподготовки, процедур калибровки, сбора и анализа данных.

Репрезентативные данные состоят из записей позиций с течением времени, как показано на рисунке 4. В позиционной записи видны два вида смещения. Во-первых, когда миозиновый двигатель не взаимодействует с актиновой нитью, захваченные шарики движутся с постоянной скорость...

Watch this Scientific Journal Video about Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy at JoVE.com

Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy

Здесь представлен комплексный протокол для проведения сверхбыстрых экспериментов с силовым зажимом на процессивных двигателях миозина-5, который можно легко распространить на изучение других классов процессных двигателей. В протоколе подробно описаны все необходимые этапы, от настройки экспериментального аппарата до пробоподготовки, сбора и анализа данных.

Рассечение механоферментных свойств процессивных миозидов с помощью сверхбыстрой силово-зажимной спектроскопии

Ultrafast force-clamp spectroscopy (UFFCS) is a single molecule technique based on laser tweezers that allows the investigation of the chemomechanics of ...

Сверхбыстрая силово-зажимная спектроскопия представляет собой одномолекулярную методику, основанную на лазерном пинцете, которая позволяет исследовать хемомеханику двигателей миозидов под нагрузкой с наивысшим временным разрешением. Этот метод позволяет зондировать очень быстрые события в производстве силы, поддерживая постоянную силу во время каждой фазы моторного взаимодействия с полным контролем направленности силы. Внеся соответствующие коррективы, этот протокол может быть легко применен к другим видам процессных двигателей, включая кинезины и динеины, чтобы раскрыть регулирование силой.После установки одного набора акустооптических дефлекторов на линейный транслятор возьмите диафрагму и отрегулируйте ее диафрагму в соответствии с размером задней диафрагмы объектива. Замените объектив на диафрагму, центрированную на резьбовом корпусе объектива. Переместите транслятор в сторону лазерного луча до тех пор, пока часть луча, заблокированная пьезокристаллом, не будет видна после диафрагмы, и поверните транслятор немного назад, пока луч полностью не заполнит диафрагму диафрагму.Для приготовления шариков кремнезема в пентилацетате сначала разводят 20 микролитров 1,2 микронных 10% твердых шариков кремнезема в 1-1,5 миллилитрах ацетона с вихрем и 30 секундами обработки ультразвуком. После обработки ультразвуком соберите шарики центрифугированием и повторно суспендируйте гранулу бусины в 1 миллилитре свежего ацетона для второй промывки. После второй промывки ацетоном промыть шарики три раза в 1 миллилитре свежего пентилацетата за промывку в тех же условиях центрифугирования и повторно использовать гранулу в 100 микролитрах 1% нитроцеллюлозы и 900 микролитрах пентилацетата.Затем используйте чистый пропитанный этанолом кусок лабораторной ткани, чтобы тщательно протереть стеклянную крышку размером 24 x 24 миллиметра, прежде чем использовать чистый пинцет, чтобы промыть стекло непосредственно в этаноле и позволить крышке высохнуть под мягким потоком азота. Вихрь и обжарьте обработанный кремнезем в течение 30 секунд и используйте очищенный этанолом покров 24 x 60 миллиметров, чтобы намазать 2 микролитра раствора из кварцевого бисера на поверхность меньшего покрова. Пока бусины сохнут, очистите слайд размером 26 x 76 миллиметров, как показано на рисунке, и поместите две линии толщиной 60-100 микрон 3-миллиметровой двусторонней наклеенными на длинные края слайда.Используя чистый пинцет, поместите покрытую бисером крышку на ленту бусинами, обращенными к внутренней части слайд-камеры, и заполните камеру 15-миллимолярным фосфатным буфером и плавающим раствором полистирольного бисера. Затем запечатайте камеру силиконовой смазкой. Чтобы откалибровать соотношение пикселей к нанометру камеры brightfield, получите первое изображение кварцевой бусины на поверхности крышки примерно в 5 микронах от центра поля зрения.Переместите сцену, чтобы сместить бусину на 10 микрон к центру поля зрения и сделать второе изображение. Рассчитайте константу калибровки камеры, измерив расстояние в пикселях между двумя положениями шарика. Чтобы откалибровать положение ловушки, задержите одну плавающую частицу в одной ловушке и переместите акустооптические дефлекторы с шагом 0,2 мегагерца, получив изображение частицы и соответствующую частоту дефлекторов для каждого шага.Затем повторите калибровку для второй ловушки таким же образом. Чтобы откалибровать мощность и жесткость ловушки, задерните одну частицу в каждой ловушке и сместите обе ловушки с помощью акустооптических дефлекторов с шагом 0,2 мегагерца, регистрируя броуновское движение частицы в обеих ловушках с помощью квадрантных фотодиодных детекторов и соответствующую частоту акустооптических дефлекторов. Получение калибровочных констант путем подгонки функции Лоренца к степенному спектру записанного броуновского движения.Чтобы собрать образец для измерения, добавьте 1 миллиграмм на миллилитр биотинилированного BSA в новую камеру с кварцевыми шариками на поверхности крышки. Через 5 минут промыть камеру AB-буфером и добавить в камеру 1 миллиграмм на миллилитр стрептавидина. Через 5 минут промыть камеру, как показано, и добавить 3 наномолярных биотинилированных миозина-5В тяжелый меромиозин в буфер M5B, дополненный 2 микромолярными калмодулином.Через 5 минут промыть камеру три раза 1 миллиграммом на миллилитр биотинилированного BSA с добавлением 2 микромолярных калмодулинов в буфере AB и подождать 3 минуты после окончательной промывки. Протейте реакционную смесь и запечатайте камеру силиконовой смазкой. Чтобы измерить образец, поместите камеру на ступень микроскопа и переместите объектив до тех пор, пока плавающие альфа-актининовые шарики не окажутся в фокусе.Включите одну ловушку и поймайте одну бусину. Как только первая ловушка занята, переместите транслятор, чтобы расположить захваченную бусину близко к поверхности крышки, чтобы избежать захвата нескольких бусин, и поймайте бусину во второй ловушке. Вытесните образец через трансляторы дальнего действия, чтобы найти актиновые нити длиной не менее 5 микрон в растворе.Когда нить накала была обнаружена, переместите образец, чтобы захваченная бусина приблизилась к одному концу нити. После того, как нить накала была прикреплена, отрегулируйте расстояние бусины до приблизительной длины нити и переместите ступень, чтобы создать поток в направлении несвязанного шарика. Нить накала будет растягиваться потоком и в конечном итоге связываться со второй бусиной.Полученный комплекс называется гантелью«Чтобы установить контакт актин-миозин, аккуратно разделите две ловушки и установите нить на уровень претензии примерно до 3 пиконьютонов. Чтобы исследовать жесткость гантели, заставьте одну ловушку колебаться в треугольной волне, изменяя частоту одного акустооптического дефлектора и проверяя последующую передачу движения на замыкающий шарик через сигнал его положения. Переместите сцену, чтобы расположить гантель в непосредственной близости от пьедестала кварцевой бусины и отрегулируйте высоту гантели так, чтобы нить актина соприкасалась с поверхностью кварцевого шарика.Как видно из этой репрезентативной записи положения, когда миозиновый двигатель не взаимодействует с актиновой нитью, захваченные шарики движутся с постоянной скоростью против вязкой силы сопротивления раствора. Как только миозиновый двигатель начинает взаимодействовать с нитью, сила, переносимая движущейся нитью, очень быстро передается белку, и скорость системы падает до нуля, причем события шага происходят под постоянной силой до конца пробега. Сила переключается с положительного на отрицательное направление системой обратной связи, которая переключает направление силы, когда шарик достигает края диапазона колебаний, заданного пользователем.Когда миозин связывает и смещает нить накала в положительном направлении, он толкает шарик к верхнему краю диапазона колебаний. Если это происходит под действием вспомогательной силы, то бег миозина будет прерван инверсией направления силы на краю колебания, ограничивая длину пробега амплитудой колебаний гантели. Точное выравнивание оптической системы необходимо для достижения оптимального пространственного и временного разрешения, в то время как точная калибровка необходима для точного определения значений приложенных сил.Этот метод был адаптирован для изучения скользящего и целенаправленного поиска факторов транскрипции в ДНК, а также динамических взаимодействий между белками механотрансдукции, индуцированными по нитям микротрубочек.

Research

JoVE Journal

Biology

Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

Разбор и запись с Junction C. Elegans нервно-мышечной

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale.   This ...

Dissecting the Non-human Primate Brain in Stereotaxic Space

Пройдя без человеческого мозга приматов в стереотаксической космического

The use of non-human primates provides an excellent translational model for our understanding of developmental and aging processes in humans1-6. In ...

The Gateway to the Brain: Dissecting the Primate Eye

Ворота в мозг: Пройдя Предстоятель глаз

The visual system in humans is considered the  gateway  to the world and plays a principal role in the plethora of sensory, perceptual and cognitive ...

Exploring Cognitive Functions in Babies, Children &amp; Adults with Near Infrared Spectroscopy

Exploring Cognitive Functions in Babies, Children & Adults with Near Infrared Spectroscopy

Изучение когнитивных функций у новорожденных, детей и взрослых с ближней инфракрасной спектроскопии

An explosion of functional Near Infrared Spectroscopy (fNIRS) studies investigating cortical activation in relation to higher cognitive processes, such as ...

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

Оценка сигнализации Свойства эктодермальная эпителия Во время черепно-лицевых развития

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue ...

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Процедуры для Крысы<em&gt; На месте</em&gt; Скелетных мышц сократительные свойства

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

Сочетание Манипуляции одиночных молекул и визуализации по изучению взаимодействий белок-ДНК

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase (ERK) Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase ERK Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Фотостимуляция Femtosecond Laser активирует внеклеточные сигналы, регулируемые Kinase (ERK) Сигнализация или Митохондриальные События в целевых клетках

Direct control of cellular defined molecular events is important to life science. Recently, studies have demonstrated that femtosecond laser stimulation ...

Quantification of Cellular Densities and Antigenic Properties using Magnetic Levitation

Количественная оценка клеточных плотностей и антигенных свойств с использованием магнитной левитации

The described method was developed based on the principles of magnetic levitation, which separates cells and particles based on their density and magnetic ...

Detection of Protein Aggregation using Fluorescence Correlation Spectroscopy

Обнаружение агрегации белка с помощью спектроскопии корреляции флуоресценции

Protein aggregation is a hallmark of neurodegenerative disorders such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Alzheimer's disease (AD), Parkinson's ...