Name: dissecting mechanoenzymatic properties of processive myosins with ultrafast force-clamp spectroscopy
Uploaded: 2021-07-01T13:30:00
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Este trabajo fue apoyado por el programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea bajo el Acuerdo de Subvención No. 871124 Laserlab-Europe, por el Ministerio de Universidad e Investigación de Italia (FIRB "Futuro in Ricerca" 2013 Grant No. RBFR13V4M2), y por Ente Cassa di Risparmio di Firenze. A.V. Kashchuk recibió el apoyo de la beca interdisciplinaria LT008/2020-C del Programa de Ciencias de la Frontera Humana.

1. Configuración óptica
NOTA: La configuración experimental se compone de pinzas ópticas dobles con estabilidad de apuntamiento nanométrico y < fluctuaciones de intensidad láser del 1%. En estas condiciones, la estabilidad de la mancuerna a nivel nanométrico está garantizada bajo la rigidez típica de la trampa (0,1 pN/nm) y la tensión (1 pN - pocas decenas de pN). La figura 2 muestra un esquema detallado de la configuración óptica.
<ol><li>Diseño y ...

<ol>
	<li>Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+a+single-beam+gradient+force+optical+trap+for+dielectric+particles.">Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles.</a> Optical Angular Momentum. 11 (5), 196-198 (2016).</li><li>Capitanio, M., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+biology+with+force:+Single+molecule+high-resolution+measurements+with+optical+tweezers.">Interrogating biology with force: Single molecule high-resolution measurements with optical tweezers.</a> Biophysical Journal. 105 (6), 1293-1303 (2013).</li><li>Capitanio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+force-clamp+spectroscopy+of+single+molecules+reveals+load+dependence+of+myosin+working+stroke.">Ultrafast force-clamp spectroscopy of single molecules reveals load dependence of myosin working stroke.</a> Nature Methods. 9 (10), 1013-1019 (2012).</li><li>Gardini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+myosin-5B+mechanosensitivity+and+calcium+regulation+at+the+single+molecule+level.">Dissecting myosin-5B mechanosensitivity and calcium regulation at the single molecule level.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li><li>Woody, M. S., Winkelmann, D. A., Capitanio, M., Ostap, E. M., Goldman, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+mechanics+resolves+the+earliest+events+in+force+generation+by+cardiac+myosin.">Single molecule mechanics resolves the earliest events in force generation by cardiac myosin.</a> eLife. 8, 49266 (2019).</li><li>Clemen, A. E. -. M., Vilfan, M., Jaud, J., Zhang, J., B&#228;, M., Rief, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-dependent+stepping+kinetics+of+myosin-V.">Force-dependent stepping kinetics of myosin-V.</a> Biophysical Journal. 88, 4402-4410 (2005).</li><li>Howard, J., Hancock, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+beads+are+better+than+one.">Three beads are better than one.</a> Biophysical Journal. 118 (1), 1-3 (2020).</li><li>Pyrpassopoulos, S., Shuman, H., Ostap, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+kinesin's+load-bearing+capacity+by+force+geometry+and+the+microtubule+track.">Modulation of kinesin's load-bearing capacity by force geometry and the microtubule track.</a> Biophysical Journal. 118 (1), 243-253 (2020).</li><li>Capitanio, M., Maggi, D., Vanzi, F., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FIONA+in+the+trap:+The+advantages+of+combining+optical+tweezers+and+fluorescence.">FIONA in the trap: The advantages of combining optical tweezers and fluorescence.</a> Journal of Optics A: Pure and Applied Optics. 9 (8), 157 (2007).</li><li>Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Position+control+and+optical+manipulation+for+nanotechnology+applications.">Position control and optical manipulation for nanotechnology applications.</a> European Physical Journal B. 46 (1), 1-8 (2005).</li><li>Capitanio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Optical Tweezers. An introduction to Single Molecule Biophysics. , (2017).</li><li>Capitanio, M., Cicchi, R., Saverio Pavone, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+and+time-shared+multiple+optical+tweezers+for+the+study+of+single+motor+proteins.">Continuous and time-shared multiple optical tweezers for the study of single motor proteins.</a> Optics and Lasers in Engineering. 45 (4), 450-457 (2007).</li><li>Gardini, L., Tempestini, A., Pavone, F. S., Capitanio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+optical+tweezers+for+the+study+of+single+molecular+motors.">High-speed optical tweezers for the study of single molecular motors.</a> Methods in Molecular Biology. 1805, (2018).</li><li>Capitanio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calibration+of+optical+tweezers+with+differential+interference+contrast+signals.">Calibration of optical tweezers with differential interference contrast signals.</a> Review of Scientific Instruments. 73 (4), 1687 (2002).</li><li>Monico, C., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S., Capitanio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+single-molecule+manipulation+and+imaging+for+the+study+of+protein-DNA+interactions.">Combining single-molecule manipulation and imaging for the study of protein-DNA interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. (90), e51446 (2014).</li><li>Greenberg, M. J., Lin, T., Goldman, Y. E., Shuman, H., Ostap, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+IC+generates+power+over+a+range+of+loads+via+a+new+tension-sensing+mechanism.">Myosin IC generates power over a range of loads via a new tension-sensing mechanism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), 2433-2440 (2012).</li><li>Gardini, L., Arbore, C., Capitanio, M., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+single+molecule+imaging+and+tracking+of+processive+myosin+motors.">A protocol for single molecule imaging and tracking of processive myosin motors.</a> MethodsX. 6, 1854-1862 (2019).</li><li>Ramaiya, A., Roy, B., Bugiel, M., Sch&#228;ffer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+rotates+unidirectionally+and+generates+torque+while+walking+on+microtubules.">Kinesin rotates unidirectionally and generates torque while walking on microtubules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (41), 10894-10899 (2017).</li></ol>

Aunque las técnicas de molécula única, como el ensayo de tres perlas, son técnicamente desafiantes y de bajo rendimiento, UFFCS mejora la detección de interacciones moleculares gracias a la alta relación señal-ruido de los datos. UFFCS permite el estudio de la dependencia de la carga de las proteínas motoras, con las principales ventajas de aplicar la fuerza muy rápidamente al unirse el motor al filamento para sondear eventos tempranos y muy rápidos en la producción de fuerza y estados de unión débiles bajo ...

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Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy
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Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy

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Erratum: Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy

En las últimas décadas, las pinzas ópticas han sido una herramienta valiosa para dilucidar la mecanoquímica de las interacciones de proteínas a nivel de molécula única, debido a la sorprendente posibilidad de manipulación concurrente y medición de cambios conformacionales y cinética enzimática 1,2. En particular, la capacidad de aplicar y medir fuerzas en el rango de las ejercidas por los motores moleculares en la célula, junto con la capacidad de medir cambios conformacionales subnanométricos, hicieron de las pinzas ópticas una herramienta única de una sola molécula para desentrañar las propiedades quimiomecánicas de las proteínas motoras y su regulación mecánica.
La espectroscopia ultrarrápida de pinza de fuerza (UFFCS) es una técnica de espectroscopia de fuerza de molécula única basada en pinzas ópticas, desarrollada para estudiar la cinética rápida de motores moleculares bajo carga en una geometría de tres perlas (Figura 1a)3,4. UFFCS reduce el tiempo de aplicación de fuerza a la proteína motora hasta el límite físico de las pinzas ópticas, es decir, el tiempo de relajación mecánica del sistema, permitiendo así la aplicación de la fuerza rápidamente después del comienzo de una carrera de miosina (pocas decenas de microsegundos)3. Esta capacidad se ha explotado para investigar los eventos mecánicos tempranos en la miosina del músculo esquelético 3 rápido y elmúsculo 5 cardíaco para revelar la dependencia de la carga de la carrera de potencia, los estados de unión débil y fuerte, así como el orden de los eventos bioquímicos (Pi) y mecánicos (carrera de potencia).
La geometría de tres perlas se emplea generalmente para estudiar motores no procesivos, una geometría de una sola perla con una abrazadera de fuerza se ha utilizado comúnmente para investigar miosinas procesivas no convencionales como la miosina Va6. Sin embargo, hay varias razones para preferir un ensayo UFFCS de tres perlas también para miosinas procesivas. En primer lugar, la rápida aplicación de la carga justo después de la unión actina-miosina permite la medición de los primeros eventos en el desarrollo de la fuerza como en los motores no procesivos. Además, en el caso de los motores de proceso, también permite una medición precisa de las longitudes de funcionamiento del motor y las duraciones de funcionamiento bajo fuerza constante a lo largo de su progresión (Figura 1b). Además, debido a la alta tasa de retroalimentación de fuerza, el sistema puede mantener la fuerza constante durante los cambios rápidos de posición, como la carrera de trabajo de la miosina, garantizando así una carga constante durante el paso del motor. La alta resolución temporal del sistema permite la detección de interacciones sub-ms, abriendo la posibilidad de investigar la unión débil de la miosina a la actina. Finalmente, la geometría del ensayo garantiza que la fuerza se aplique a lo largo del filamento de actina, con componentes transversales y verticales insignificantes de la fuerza. Este punto es de particular relevancia ya que se ha demostrado que el componente de fuerza vertical influye significativamente en la dependencia de la carga de la cinética del motor 7,8. Mediante el uso de esta técnica, podríamos aplicar un rango de cargas asistenciales y resistivas a la miosina-5B procesiva y medir directamente la dependencia de la carga de su procesividad para un amplio rango de fuerzas4.
Como se muestra en la Figura 1a, en este sistema un solo filamento de actina está suspendido entre dos perlas de poliestireno atrapadas en el foco de pinzas ópticas dobles (la "mancuerna"). Una fuerza neta desequilibrada F = F1-F 2 se impone sobre el filamento, a través de un sistema de retroalimentación rápida, que hace que el filamento se mueva a velocidad constante en una dirección hasta que alcanza un punto de inversión definido por el usuario donde la fuerza neta se invierte en la dirección opuesta. Cuando la proteína motora no está interactuando con el filamento, la mancuerna es libre de moverse hacia adelante y hacia atrás en forma de onda triangular (Figura 1b, panel inferior) que abarca el cordón del pedestal en el que se une una sola proteína motora. Una vez que se establece la interacción, la fuerza transportada por la mancuerna se transfiere muy rápidamente a la proteína motora y el motor comienza a desplazar el filamento al paso por debajo de la intensidad de fuerza y la dirección que aplicó el sistema de retroalimentación en el momento de la interacción, hasta que la miosina se separa de la actina. Dado que el desplazamiento producido por el paso del motor depende de la polaridad del filamento de actina atrapado, según la dirección de la fuerza aplicada, la carga puede ser asistencial, es decir, empujando en la misma dirección del desplazamiento del motor (empuje en el panel superior de la Figura 1b), o resistiva, es decir, tirando en la dirección opuesta con respecto al desplazamiento del motor (tire en la Figura 1b panel superior) que permite estudiar la regulación quimiomecánica de la procesividad del motor tanto por la intensidad como por la direccionalidad de la carga aplicada.
En las siguientes secciones se describen completamente todos los pasos para medir las interacciones actina-miosina-5B bajo diferentes cargas con una configuración de espectroscopia de fuerza-abrazadera ultrarrápida, incluyendo 1) la configuración de la configuración óptica, la alineación de trampas ópticas y los procedimientos de calibración, 2) las preparaciones de todos los componentes y su ensamblaje en la cámara de muestra, 3) el procedimiento de medición, 4) Datos representativos y análisis de datos para extraer parámetros físicos importantes, como la longitud de la carrera, el tamaño del paso y la velocidad de la proteína motora.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;Aliphatic Amine Latex Beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A37362</td>
			<td>1.0-&#956;m diameter, 2% (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin polymerization buffer</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>BSA02</td>
			<td>10X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AODs (acousto-optic deflectors)</td>
			<td>AA Opto Electronic</td>
			<td>DTS-XY 250</td>
			<td>Laser beam deflectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated-BSA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>29130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calmodulin from porcine brain (CaM)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>208783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase from bovine liver</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Condenser</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>OlympusU-AAC, Aplanat, Achromat</td>
			<td>NA 1.4, oil immersion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine phosphate disodium salt tetrahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>27920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine Phosphokinase from rabbit muscle</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDs</td>
			<td>AA Opto Electronic</td>
			<td>AA.DDS.XX</td>
			<td>Two-channel digital synthesizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DTT)/td&#62;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-actin protein</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>AKL99</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase from Aspergillus niger</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;G7141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaloTag succinimidyl ester O2 ligand</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High vacuum silicone grease heavy</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>107921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4/K2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5379/ P8281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labview</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>version 8.1</td>
			<td>Data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labview FPGA module</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>version 8.1</td>
			<td>Fast Force-Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>2016</td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>63020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Plan-Apo 60X</td>
			<td>NA 1.2, WD 0.2 mm, water imm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N8267</td>
			<td>0.45 pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentyl acetate solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>46022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pure Ethanol</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>2860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QPDs</td>
			<td>UDT</td>
			<td>DLS-20</td>
			<td>D Position Detecto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine BSA</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A23016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine Phalloidin</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>P1951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica beads</td>
			<td>Bangslabs</td>
			<td>SS04N</td>
			<td>1.21 mm, 10% solids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin protein</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>189730</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissecting mechanoenzymatic properties of processive myosins with ultrafast force-clamp spectroscopy

La espectroscopia ultrarrápida de pinza de fuerza (UFFCS) es una técnica de molécula única basada en pinzas láser que permite la investigación de la quimiomecánica de miosinas convencionales y no convencionales bajo carga con una resolución de tiempo sin precedentes. En particular, la posibilidad de sondear motores de miosina bajo fuerza constante justo después de la formación del enlace actina-miosina, junto con la alta tasa de retroalimentación de fuerza (200 kHz), ha demostrado que UFFCS es una herramienta valiosa para estudiar la dependencia de la carga de dinámicas rápidas como la carrera de trabajo de la miosina. Además, UFFCS permite el estudio de cómo las interacciones miosina-actina procesivas y no procesivas están influenciadas por la intensidad y la dirección de la fuerza aplicada.
Siguiendo este protocolo, será posible realizar experimentos ultrarrápidos de fuerza-pinza en motores de miosina 5 procesiva y en una variedad de miosinas no convencionales. Mediante algunos ajustes, el protocolo también podría extenderse fácilmente al estudio de otras clases de motores de proceso como quinesinas y dineínas. El protocolo incluye todos los pasos necesarios, desde la configuración del aparato experimental hasta la preparación de muestras, procedimientos de calibración, adquisición de datos y análisis.

Los datos representativos consisten en registros de posición a lo largo del tiempo, como se muestra en la Figura 4. En el registro de posición son visibles dos tipos de desplazamiento. En primer lugar, cuando el motor de miosina no está interactuando con el filamento de actina, las perlas atrapadas se mueven a velocidad constante contra la fuerza de arrastre viscosa de la solución que muestra un desplazamiento lineal oscilando dentro del rango de oscilación establecido por el operador e...

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Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy

Aquí se presenta un protocolo integral para realizar experimentos ultrarrápidos de abrazadera de fuerza en motores de miosina-5 procesuales, que podrían extenderse fácilmente al estudio de otras clases de motores de proceso. El protocolo detalla todos los pasos necesarios, desde la configuración del aparato experimental hasta la preparación de muestras, la adquisición de datos y el análisis.

Disección de las propiedades mecanoenzimáticas de miosinas procesivas con espectroscopia ultrarrápida de pinza de fuerza

Ultrafast force-clamp spectroscopy (UFFCS) is a single molecule technique based on laser tweezers that allows the investigation of the chemomechanics of ...

La espectroscopia ultrarrápida de pinza de fuerza es una técnica de molécula única basada en pinzas láser que permite investigar la quimiomecánica de motores de miosinas bajo carga con la más alta resolución de tiempo. Esta técnica permite sondear eventos muy rápidos en la producción de fuerza manteniendo la fuerza constante durante cada fase de la interacción motora con un control total de la direccionalidad de la fuerza. Al hacer los ajustes apropiados, este protocolo podría aplicarse fácilmente a otros tipos de motores de proceso, incluidas las quinesinas y las dineínas, para descubrir la regulación por la fuerza.Después de montar un conjunto de deflectores acústico-ópticos en un traductor lineal, tome un iris y ajuste su apertura para que se ajuste al tamaño de la apertura posterior del objetivo. Reemplace el objetivo con el iris centrado en la carcasa del objetivo roscada. Mueva el traductor hacia el rayo láser hasta que la parte del haz bloqueada por el cristal piezoeléctrico sea visible después del iris, y gire el traductor ligeramente hacia atrás hasta que el haz llene completamente la abertura del iris.Para preparar perlas de sílice en acetato de pentilo, primero diluya 20 microlitros de perlas de sílice sólida al 10% de 1.2 micras en 1-1.5 mililitros de acetona con vórtice y 30 segundos de sonicación. Después de la sonicación, recoja las perlas por centrifugación y vuelva a suspender el pellet de perla en 1 mililitro de acetona fresca para un segundo lavado. Después del segundo lavado de acetona, lavar las perlas tres veces en 1 mililitro de acetato de pentilo fresco por lavado en las mismas condiciones de centrifugación, y resuspender el pellet en 100 microlitros de 1% de nitrocelulosa y 900 microlitros de acetato de pentilo.A continuación, use un pedazo de tejido de laboratorio empapado en etanol puro para limpiar cuidadosamente un cubreobjetos de vidrio de 24 x 24 milímetros antes de usar pinzas limpias para enjuagar el vidrio directamente en el etanol y permitir que el cubreobjetos se seque bajo un suave flujo de nitrógeno. Vortex y sonicar el stock de perlas de sílice preparado durante 30 segundos y usar un cubreobjetos de 24 x 60 milímetros limpiado con etanol para untar 2 microlitros de solución de perlas de sílice en la superficie del cubreobjetos más pequeño. Mientras las perlas se secan, limpie un portaobjetos de 26 x 76 milímetros como se demuestra, y coloque dos líneas de 60-100 micras de espesor de 3 milímetros de doble cara pegadas con cinta adhesiva en los bordes largos de la diapositiva.Con unas pinzas limpias, coloque el cubrecubierto recubierto de cuentas sobre la cinta con las perlas orientadas hacia el interior de la cámara de deslizamiento y llene la cámara con tampón de fosfato de 15 milimolares y una solución flotante de perlas de poliestireno. Luego, selle la cámara con grasa de silicona. Para calibrar la relación píxel-nanómetro de la cámara de campo claro, adquiera una primera imagen de una cuenta de sílice en la superficie del cubreobjetos aproximadamente a 5 micras del centro del campo de visión.Mueva el escenario para desplazar la cuenta 10 micras hacia el centro del campo de visión y tome una segunda imagen. Calcule la constante de calibración de la cámara midiendo la distancia de píxeles entre dos posiciones del talón. Para calibrar la posición de la trampa, atrape una sola partícula flotante en una trampa y mueva los deflectores acústico-ópticos en pasos de 0,2 megahercios, adquiriendo una imagen de la partícula y la frecuencia correspondiente de los deflectores para cada paso.Luego, repita la calibración de la segunda trampa de la misma manera. Para calibrar la potencia y la rigidez de la trampa, atrape una sola partícula en cada trampa y desplace ambas trampas utilizando los deflectores acústico-ópticos en pasos de 0,2 megahercios, registrando un movimiento browniano de la partícula en ambas trampas con detectores de fotodiodos de cuadrante y la frecuencia correspondiente de los deflectores acústico-ópticos. Obtenga constantes de calibración ajustando una función lorentziana a un espectro de potencia del movimiento browniano registrado.Para ensamblar una muestra para la medición, agregue 1 miligramo por mililitro de BSA biotinilada a una nueva cámara con perlas de sílice en la superficie del cubreobjetos. Después de 5 minutos, lave la cámara con tampón AB y agregue 1 miligramo por mililitro de estreptavidina a la cámara. Después de 5 minutos, lavar la cámara como se demostró y agregar 3 meromiosina pesada biotinilada nanomolar Myosin-5B en tampón M5B suplementado con 2 calmodulina micromolar.Después de 5 minutos, lavar la cámara tres veces con 1 miligramo por mililitro de BSA biotinilada suplementada con 2 micromolares de Calmodulina en tampón AB y esperar 3 minutos después del lavado final. Fluya la mezcla de reacción y selle la cámara con grasa de silicona. Para medir la muestra, coloque la cámara en la etapa del microscopio y mueva el objetivo hasta que las perlas flotantes de alfa-actinina estén enfocadas.Encienda una trampa y atrape una cuenta. Una vez que la primera trampa esté ocupada, mueva el traductor para colocar la cuenta atrapada cerca de la superficie del cubreobjetos para evitar atrapar varias cuentas, y atrape una cuenta en la segunda trampa. Desplazar la muestra a través de los traductores de largo alcance para localizar filamentos de actina de al menos 5 micras de longitud dentro de la solución.Cuando se haya detectado un filamento, mueva la muestra para permitir que una cuenta atrapada se acerque a un extremo del filamento. Una vez que se haya unido el filamento, ajuste la distancia del talón a la longitud aproximada del filamento y mueva la plataforma para crear un flujo en la dirección del talón no unido. El filamento se estirará por el flujo y eventualmente se unirá a la segunda cuenta.El complejo resultante se llama mancuerna"Para establecer el contacto actina-miosina, separe suavemente las dos trampas y ajuste el filamento a niveles de pretensión de hasta aproximadamente 3 piconewtons. Para sondear la rigidez de la mancuerna, haga que una trampa oscile en una onda triangular cambiando la frecuencia de un deflector acústico-óptico y verificando la consiguiente transmisión del movimiento a la cuenta de arrastre a través de su señal de posición. Mueva el escenario para colocar la mancuerna en la proximidad de una cuenta de sílice de pedestal y ajuste la altura de la mancuerna para que el filamento de actina entre en contacto con la superficie de la perla de sílice.Como se observa en este registro de posición representativo, cuando el motor de miosina no está interactuando con el filamento de actina, las perlas atrapadas se mueven a una velocidad constante contra la fuerza de arrastre viscosa de la solución. Una vez que el motor de miosina comienza a interactuar con el filamento, la fuerza transportada por el filamento en movimiento se transfiere muy rápidamente a la proteína, y la velocidad del sistema cae a cero, con los eventos de paso que ocurren bajo fuerza constante hasta el final de la carrera. La fuerza se cambia de la dirección positiva a la negativa por el sistema de retroalimentación, que cambia la dirección de la fuerza cuando el talón alcanza el borde del rango de oscilación establecido por el usuario.Cuando la miosina se une y desplaza el filamento hacia la dirección positiva, empuja la cuenta hacia el borde superior del rango de oscilación. Si esto sucede bajo fuerza de asistencia, la carrera de la miosina será interrumpida por la inversión de la dirección de la fuerza en el borde de oscilación, limitando la duración de la carrera a la amplitud de la oscilación de la mancuerna. La alineación precisa del sistema óptico es necesaria para lograr la resolución espacial y temporal óptima, mientras que una calibración precisa es necesaria para determinar con precisión los valores de las fuerzas aplicadas.Esta técnica se ha adaptado para estudiar la búsqueda deslizante y dirigida de factores de transcripción en el ADN, así como las interacciones dinámicas entre proteínas de mecanotransducción que inducen sobre filamentos de microtúbulos.

Research

JoVE Journal

Biology

Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

Disección y de grabación de la unión neuromuscular C. Elegans

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale.   This ...

Investigación

Biología

Dissecting the Non-human Primate Brain in Stereotaxic Space

La disección de cerebro de los primates no humanos en el espacio estereotáxica

The use of non-human primates provides an excellent translational model for our understanding of developmental and aging processes in humans1-6. In ...

The Gateway to the Brain: Dissecting the Primate Eye

La puerta de enlace para el cerebro: la disección de los ojos de Primates

The visual system in humans is considered the  gateway  to the world and plays a principal role in the plethora of sensory, perceptual and cognitive ...

Exploring Cognitive Functions in Babies, Children &amp; Adults with Near Infrared Spectroscopy

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Explorar las funciones cognitivas en bebés, niños y adultos con Espectroscopia de Infrarrojo Cercano

An explosion of functional Near Infrared Spectroscopy (fNIRS) studies investigating cortical activation in relation to higher cognitive processes, such as ...

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

La evaluación de las propiedades de señalización de ectodérmica epitelio durante el desarrollo craneofacial

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue ...

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

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Procedimientos para la Rata In situ Propiedades contráctiles del músculo esquelético

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

Combinando Manipulación sola molécula y de imagen para el estudio de las interacciones proteína-ADN

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase (ERK) Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

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Fotoestimulación por láser de femtosegundo activa la señalización de la quinasa regulada por señal extracelular (ERK) o eventos mitocondriales en células objetivo

Direct control of cellular defined molecular events is important to life science. Recently, studies have demonstrated that femtosecond laser stimulation ...

Quantification of Cellular Densities and Antigenic Properties using Magnetic Levitation

Cuantificación de las densidades celulares y propiedades antigénicas mediante levitación magnética

The described method was developed based on the principles of magnetic levitation, which separates cells and particles based on their density and magnetic ...

Detection of Protein Aggregation using Fluorescence Correlation Spectroscopy

Detección de agregación de proteínas mediante espectroscopia de correlación de fluorescencia

Protein aggregation is a hallmark of neurodegenerative disorders such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Alzheimer's disease (AD), Parkinson's ...