Name: dissecting mechanoenzymatic properties of processive myosins with ultrafast force-clamp spectroscopy
Uploaded: 2021-07-01T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy at JoVE.com

Detta arbete stöddes av Europeiska unionens forsknings- och innovationsprogram Horizon 2020 enligt bidragsavtal nr 871124 Laserlab-Europe, av det italienska ministeriet för universitet och forskning (FIRB "Futuro in Ricerca" 2013 Grant No. RBFR13V4M2) och av Ente Cassa di Risparmio di Firenze. A.V. Kashchuk stöddes av Human Frontier Science Program Cross-Disciplinary Fellowship LT008/2020-C.

1. Optisk inställning
OBS: Den experimentella installationen består av dubbla optiska pincett med nanometerpekstabilitet och < 1% laserintensitetsfluktuationer. Under dessa förhållanden garanteras hantelns stabilitet på nanometernivå under typisk fällstyvhet (0,1 pN / nm) och spänning (1 pN - några tiotals pN). Figur 2 visar ett detaljerat schema för den optiska inställningen.
<ol><li>Optisk pincett design och konstruktion 9,10,11.</...

<ol>
	<li>Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+a+single-beam+gradient+force+optical+trap+for+dielectric+particles.">Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles.</a> Optical Angular Momentum. 11 (5), 196-198 (2016).</li><li>Capitanio, M., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+biology+with+force:+Single+molecule+high-resolution+measurements+with+optical+tweezers.">Interrogating biology with force: Single molecule high-resolution measurements with optical tweezers.</a> Biophysical Journal. 105 (6), 1293-1303 (2013).</li><li>Capitanio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+force-clamp+spectroscopy+of+single+molecules+reveals+load+dependence+of+myosin+working+stroke.">Ultrafast force-clamp spectroscopy of single molecules reveals load dependence of myosin working stroke.</a> Nature Methods. 9 (10), 1013-1019 (2012).</li><li>Gardini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+myosin-5B+mechanosensitivity+and+calcium+regulation+at+the+single+molecule+level.">Dissecting myosin-5B mechanosensitivity and calcium regulation at the single molecule level.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li><li>Woody, M. S., Winkelmann, D. A., Capitanio, M., Ostap, E. M., Goldman, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+mechanics+resolves+the+earliest+events+in+force+generation+by+cardiac+myosin.">Single molecule mechanics resolves the earliest events in force generation by cardiac myosin.</a> eLife. 8, 49266 (2019).</li><li>Clemen, A. E. -. M., Vilfan, M., Jaud, J., Zhang, J., B&#228;, M., Rief, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-dependent+stepping+kinetics+of+myosin-V.">Force-dependent stepping kinetics of myosin-V.</a> Biophysical Journal. 88, 4402-4410 (2005).</li><li>Howard, J., Hancock, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+beads+are+better+than+one.">Three beads are better than one.</a> Biophysical Journal. 118 (1), 1-3 (2020).</li><li>Pyrpassopoulos, S., Shuman, H., Ostap, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+kinesin's+load-bearing+capacity+by+force+geometry+and+the+microtubule+track.">Modulation of kinesin's load-bearing capacity by force geometry and the microtubule track.</a> Biophysical Journal. 118 (1), 243-253 (2020).</li><li>Capitanio, M., Maggi, D., Vanzi, F., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FIONA+in+the+trap:+The+advantages+of+combining+optical+tweezers+and+fluorescence.">FIONA in the trap: The advantages of combining optical tweezers and fluorescence.</a> Journal of Optics A: Pure and Applied Optics. 9 (8), 157 (2007).</li><li>Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Position+control+and+optical+manipulation+for+nanotechnology+applications.">Position control and optical manipulation for nanotechnology applications.</a> European Physical Journal B. 46 (1), 1-8 (2005).</li><li>Capitanio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Optical Tweezers. An introduction to Single Molecule Biophysics. , (2017).</li><li>Capitanio, M., Cicchi, R., Saverio Pavone, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+and+time-shared+multiple+optical+tweezers+for+the+study+of+single+motor+proteins.">Continuous and time-shared multiple optical tweezers for the study of single motor proteins.</a> Optics and Lasers in Engineering. 45 (4), 450-457 (2007).</li><li>Gardini, L., Tempestini, A., Pavone, F. S., Capitanio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+optical+tweezers+for+the+study+of+single+molecular+motors.">High-speed optical tweezers for the study of single molecular motors.</a> Methods in Molecular Biology. 1805, (2018).</li><li>Capitanio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calibration+of+optical+tweezers+with+differential+interference+contrast+signals.">Calibration of optical tweezers with differential interference contrast signals.</a> Review of Scientific Instruments. 73 (4), 1687 (2002).</li><li>Monico, C., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S., Capitanio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+single-molecule+manipulation+and+imaging+for+the+study+of+protein-DNA+interactions.">Combining single-molecule manipulation and imaging for the study of protein-DNA interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. (90), e51446 (2014).</li><li>Greenberg, M. J., Lin, T., Goldman, Y. E., Shuman, H., Ostap, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+IC+generates+power+over+a+range+of+loads+via+a+new+tension-sensing+mechanism.">Myosin IC generates power over a range of loads via a new tension-sensing mechanism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), 2433-2440 (2012).</li><li>Gardini, L., Arbore, C., Capitanio, M., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+single+molecule+imaging+and+tracking+of+processive+myosin+motors.">A protocol for single molecule imaging and tracking of processive myosin motors.</a> MethodsX. 6, 1854-1862 (2019).</li><li>Ramaiya, A., Roy, B., Bugiel, M., Sch&#228;ffer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+rotates+unidirectionally+and+generates+torque+while+walking+on+microtubules.">Kinesin rotates unidirectionally and generates torque while walking on microtubules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (41), 10894-10899 (2017).</li></ol>

Även om enmolekylära tekniker, såsom tre-pärlanalysen, är tekniskt utmanande och låg genomströmning, förbättrar UFFCS detekteringen av molekylära interaktioner tack vare det höga signal-brusförhållandet mellan data. UFFCS möjliggör studier av belastningsberoende av motorproteiner, med de främsta fördelarna med att applicera kraften mycket snabbt vid bindning av motorn till filamentet för att undersöka tidiga och mycket snabba händelser i kraftproduktion och svaga bindningstillstånd under kontrollerad...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62388">Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy</a>. The title was updated.
The title was updated from:
Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy
to:
Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62388">Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy</a>. The title was updated.

Erratum: Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy

Under de senaste decennierna har optiska pincetter varit ett värdefullt verktyg för att belysa mekanokemin för proteininteraktioner på enmolekylnivå, på grund av den slående möjligheten till samtidig manipulation och mätning av konformationsförändringar och enzymatisk kinetik 1,2. I synnerhet förmågan att applicera och mäta krafter inom området för de som utövas av molekylära motorer i cellen, tillsammans med förmågan att mäta subnanometerkonformationsförändringar, gjorde optiska pincett till ett unikt enmolekylverktyg för att avslöja de kemomekaniska egenskaperna hos motorproteiner och deras mekaniska reglering.
Ultrafast force-clamp spectroscopy (UFFCS) är en enmolekylär kraftspektroskopiteknik baserad på optisk pincett, utvecklad för att studera den snabba kinetiken hos molekylära motorer under belastning i en tre-pärlgeometri (figur 1a)3,4. UFFCS minskar tidsfördröjningen för kraftapplicering på motorproteinet till den fysiska gränsen för optisk pincett, dvs systemets mekaniska avkopplingstid, vilket möjliggör applicering av kraften snabbt efter början av en myosinkörning (några tiotals mikrosekunder)3. Denna förmåga har utnyttjats för att undersöka de tidiga mekaniska händelserna i snabb skelett 3 och hjärt5 muskelmyosin för att avslöja belastningsberoendet av kraftslag, de svaga och starka bindande tillstånden, liksom ordningen på biokemiska (Pi) och mekaniska (powerstroke) händelser.
Trepärlgeometrin används vanligtvis för att studera icke-processiva motorer, en enda pärlgeometri med en kraftklämma har vanligtvis använts för att undersöka processiva icke-konventionella myosiner såsom myosin Va6. Det finns dock flera skäl att föredra en UFFCS-analys med tre pärlor även för processiva myosiner. För det första möjliggör den snabba appliceringen av belastning direkt efter aktin-myosinbindning mätning av de tidiga händelserna i kraftutveckling som i icke-processiva motorer. När det gäller processiva motorer möjliggör den dessutom en noggrann mätning av motorns körlängder och körtider under konstant kraft under hela deras progression (figur 1b). På grund av den höga hastigheten på kraftåterkopplingen kan systemet dessutom hålla kraften konstant under snabba positionsförändringar, såsom myosinets arbetsslag, vilket garanterar en konstant belastning under motorstegning. Systemets högtidsupplösning möjliggör detektering av sub-ms-interaktioner, vilket öppnar möjligheten att undersöka svag bindning av myosin till aktin. Slutligen garanterar analysgeometrin att kraften appliceras längs aktinfilamentet, med försumbara tvärgående och vertikala komponenter av kraften. Denna punkt är särskilt relevant eftersom den vertikala kraftkomponenten har visat sig väsentligt påverka belastningsberoendet hos motorns kinetik 7,8. Genom att använda denna teknik kunde vi tillämpa en rad hjälpande och resistiva belastningar på processiv myosin-5B och direkt mäta belastningsberoendet av dess processivitet för ett brett spektrum av krafter4.
Som visas i figur 1a är i detta system ett enda aktinfilament upphängt mellan två polystyrenpärlor som fångas i fokus för dubbla optiska pincetter ("hanteln"). En obalanserad nettokraft F = F1-F 2 påförs glödtråden genom ett snabbt återkopplingssystem, vilket gör att glödtråden rör sig med konstant hastighet i en riktning tills den når en användardefinierad inversionspunkt där nettokraften vänds i motsatt riktning. När motorproteinet inte interagerar med filamentet kan hanteln röra sig fram och tillbaka i en triangulär vågform (figur 1b, bottenpanelen) som spänner över piedestalsträngen på vilken ett enda motorprotein är fäst. När interaktionen är etablerad överförs kraften som bärs av hanteln mycket snabbt till motorproteinet och motorn börjar förskjuta filamentet genom att kliva under kraftintensiteten och riktningen som applicerades av återkopplingssystemet vid tidpunkten för interaktionen tills myosin lossnar från aktin. Eftersom förskjutningen som produceras av motorns stegning är beroende av polariteten hos det fångade aktinfilamentet, beroende på riktningen för den applicerade kraften, kan belastningen antingen vara assisterande, dvs trycka i samma riktning av motorförskjutningen (tryck i figur 1b övre panelen) eller resistiv, dvs dra i motsatt riktning med avseende på motorförskjutningen (dra i figur 1b övre panelen) vilket gör det möjligt att studera den kemomekaniska regleringen av motorprocessiviteten med både intensiteten och riktningen hos den applicerade belastningen.
I nästa avsnitt beskrivs alla steg för att mäta aktin-myosin-5B-interaktioner under olika belastningar med en ultrasnabb kraft-klämspektroskopiinställning fullständigt, inklusive 1) installationen av den optiska installationen, optiska fällor justering och kalibreringsprocedurer, 2) förberedelserna av alla komponenter och deras montering i provkammaren, 3) mätproceduren, 4) representativa data och dataanalys för att extrahera viktiga fysikaliska parametrar, såsom körlängd, stegstorlek och motorproteinets hastighet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;Aliphatic Amine Latex Beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A37362</td>
			<td>1.0-&#956;m diameter, 2% (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin polymerization buffer</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>BSA02</td>
			<td>10X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AODs (acousto-optic deflectors)</td>
			<td>AA Opto Electronic</td>
			<td>DTS-XY 250</td>
			<td>Laser beam deflectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated-BSA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>29130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calmodulin from porcine brain (CaM)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>208783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase from bovine liver</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Condenser</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>OlympusU-AAC, Aplanat, Achromat</td>
			<td>NA 1.4, oil immersion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine phosphate disodium salt tetrahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>27920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine Phosphokinase from rabbit muscle</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDs</td>
			<td>AA Opto Electronic</td>
			<td>AA.DDS.XX</td>
			<td>Two-channel digital synthesizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DTT)/td&#62;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-actin protein</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>AKL99</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase from Aspergillus niger</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;G7141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaloTag succinimidyl ester O2 ligand</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High vacuum silicone grease heavy</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>107921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4/K2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5379/ P8281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labview</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>version 8.1</td>
			<td>Data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labview FPGA module</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>version 8.1</td>
			<td>Fast Force-Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>2016</td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>63020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Plan-Apo 60X</td>
			<td>NA 1.2, WD 0.2 mm, water imm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N8267</td>
			<td>0.45 pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentyl acetate solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>46022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pure Ethanol</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>2860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QPDs</td>
			<td>UDT</td>
			<td>DLS-20</td>
			<td>D Position Detecto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine BSA</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A23016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine Phalloidin</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>P1951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica beads</td>
			<td>Bangslabs</td>
			<td>SS04N</td>
			<td>1.21 mm, 10% solids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin protein</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>189730</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissecting mechanoenzymatic properties of processive myosins with ultrafast force-clamp spectroscopy

Ultrafast force-clamp spectroscopy (UFFCS) är en enmolekylär teknik baserad på laserpincett som möjliggör undersökning av kemomekaniken hos både konventionella och okonventionella myosiner under belastning med oöverträffad tidsupplösning. I synnerhet har möjligheten att sondra myosinmotorer under konstant kraft direkt efter aktin-myosinbindningsbildningen, tillsammans med den höga hastigheten för kraftåterkopplingen (200 kHz), visat UFFCS vara ett värdefullt verktyg för att studera belastningsberoendet av snabb dynamik såsom myosinets arbetsslag. Dessutom möjliggör UFFCS studier av hur processiva och icke-processiva myosin-aktininteraktioner påverkas av intensiteten och riktningen hos den applicerade kraften.
Genom att följa detta protokoll kommer det att vara möjligt att utföra ultrasnabba kraftklämma experiment på processiva myosin-5-motorer och på en mängd olika okonventionella myosiner. Genom vissa justeringar kan protokollet också lätt utvidgas till studier av andra klasser av processiva motorer såsom kinesiner och dyneiner. Protokollet innehåller alla nödvändiga steg, från installationen av experimentapparaten till provberedning, kalibreringsförfaranden, datainsamling och analys.

Representativa data består av positionsposter över tid som visas i figur 4. I positionsposten är två typer av förskjutningar synliga. För det första, när myosinmotorn inte interagerar med aktinfilamentet, rör sig de fångade pärlorna med konstant hastighet mot lösningens viskösa dragkraft som visar en linjär förskjutning som oscillerar inom det svängningsområde som ställts in av operatören i en triangulär våg3 (inte synlig i <stron...

Watch this Scientific Journal Video about Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy at JoVE.com

Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy

Här presenteras ett omfattande protokoll för att utföra ultrasnabba kraftklämma experiment på processiva myosin-5-motorer, som lätt kan utvidgas till studier av andra klasser av processiva motorer. Protokollet beskriver alla nödvändiga steg, från installationen av experimentapparaten till provberedning, datainsamling och analys.

Dissekera mekanoenzymatiska egenskaper hos processiva myosiner med ultrasnabb kraftklämspektroskopi

Ultrafast force-clamp spectroscopy (UFFCS) is a single molecule technique based on laser tweezers that allows the investigation of the chemomechanics of ...

Ultrafast force-clamp spektroskopi är en enmolekylär teknik baserad på laserpincett som gör det möjligt att undersöka kemomekaniken hos myosinmotorer under belastning med högsta tidsupplösning. Denna teknik möjliggör sondering av mycket snabba händelser i kraftproduktionen genom att upprätthålla kraften konstant under varje fas av motorinteraktionen med full kontroll över kraftriktningen. Genom att göra lämpliga justeringar kan detta protokoll enkelt tillämpas på andra typer av processiva motorer, inklusive kinesiner och dyneiner, för att avslöja regleringen med våld.Efter att ha monterat en uppsättning akustooptiska deflektorer på en linjär översättare, ta en iris och justera bländaren för att passa objektivets bakre bländarstorlek. Ersätt målet med iris centrerad på det gängade objektivhuset. Flytta översättaren mot laserstrålen tills den del av strålen som blockeras av piezokristallen är synlig efter iris, och vrid översättaren något bakåt tills strålen helt fyller irisöppningen.För att förbereda kiseldioxidpärlor i pentylacetat, späd först 20 mikroliter 1,2 mikron 10%fasta kiseldioxidpärlor i 1-1,5 ml aceton med virvel och 30 sekunder ultraljudsbehandling. Efter ultraljudsbehandling, samla pärlorna genom centrifugering och återsuspendera pärlpelleten i 1 ml färsk aceton för en andra tvätt. Efter den andra acetontvätten, tvätta pärlorna tre gånger i 1 ml färsk pentylacetat per tvätt under samma centrifugeringsbetingelser och resuspendera pelleten i 100 mikroliter 1% nitrocellulosa och 900 mikroliter pentylacetat.Använd sedan en ren etanolindränkt bit laboratorievävnad för att försiktigt torka av ett 24 x 24 millimeter glastäckglas innan du använder ren pincett för att skölja glaset direkt i etanolen och låta täckglaset torka under mjukt kväveflöde. Vortex och sonicate den beredda kiseldioxidpärlan lager i 30 sekunder och använd en etanolrengjord 24 x 60 millimeter täckglas för att smeta 2 mikroliter kiseldioxidpärllösning på ytan av den mindre täckglaset. Medan pärlorna torkar, rengör en 26 x 76 millimeter glid enligt bilden och placera två 60-100 mikron tjocka linjer med 3 millimeter dubbelsidig tejpad på glidens långa kanter.Använd en ren pincett och placera det pärlbelagda täckglaset på tejpen med pärlorna mot insidan av glidkammaren och fyll kammaren med 15 millimolär fosfatbuffert och flytande polystyrenstränglösning. Försegla sedan kammaren med kiselfett. För att kalibrera pixel-till-nanometer-förhållandet för ljusfältskameran, skaffa en första bild av en kiseldioxidpärla på täckglasytan cirka 5 mikron från mitten av synfältet.Flytta scenen för att förskjuta pärlan 10 mikron mot mitten av synfältet och ta en andra bild. Beräkna kamerans kalibreringskonstant genom att mäta pixelavståndet mellan två positioner på pärlan. För att kalibrera fällans position, fälla en enda flytande partikel i en fälla och flytta de akustooptiska deflektorerna i steg om 0,2 megahertz, få en bild av partikeln och motsvarande frekvens för deflektorerna för varje steg.Upprepa sedan kalibreringen för den andra svällningen på samma sätt. För att kalibrera fällans kraft och styvhet, fånga en enda partikel i varje fälla och förskjuta båda fällorna med hjälp av akustooptiska deflektorer i steg om 0,2 megahertz, registrera en brunsk rörelse av partikeln i båda fällorna med kvadrantfotodioddetektorer och motsvarande frekvens för akustooptiska deflektorer. Hämta kalibreringskonstanter genom att anpassa en Lorentzisk funktion till ett effektspektrum av den registrerade Brownska rörelsen.För att montera ett prov för mätning, tillsätt 1 milligram per milliliter biotinylerad BSA till en ny kammare med kiseldioxidpärlor på täckglasytan. Tvätta kammaren med AB-buffert efter 5 minuter och tillsätt 1 milligram per milliliter streptavidin till kammaren. Tvätta kammaren efter 5 minuter enligt bilden och tillsätt 3 nanomolar biotinylerade Myosin-5B tunga meromyosin i M5B-buffert kompletterad med 2 mikromolar kalmodulin.Efter 5 minuter, tvätta kammaren tre gånger med 1 milligram per milliliter biotinylerad BSA kompletterad med 2 mikromolar kalmodulin i AB-buffert och vänta 3 minuter efter den slutliga tvätten. Flöda reaktionsblandningen och försegla kammaren med kiselfett. För att mäta provet, placera kammaren på mikroskopsteget och flytta målet tills de flytande alfa-aktininpärlorna är i fokus.Slå på en fälla och fånga en pärla. När den första fällan är upptagen flyttar du översättaren för att placera den fångade pärlan nära täckglasytan för att undvika att fånga flera pärlor och fångar en pärla i den andra fällan. Förskjut provet genom långdistansöversättarna för att lokalisera aktinfilament med en längd på minst 5 mikrometer i lösningen.När en glödtråd har upptäckts, flytta provet för att låta en fångad sträng närma sig ena änden av filamentet. När filamentet har fästs, justera strängens avstånd till den ungefärliga filamentlängden och flytta scenen för att skapa ett flöde i den obundna strängriktningen. Filamentet kommer att sträckas av flödet och så småningom binda till den andra pärlan.Det resulterande komplexet kallas en hantel"För att upprätta aktin-myosinkontakt, separera försiktigt de två fällorna och ställ filamentet på förspänningsnivåer upp till cirka 3 piconewton. För att undersöka hantelns styvhet, få en fälla att svänga i en triangulär våg genom att ändra frekvensen för en akustooptisk deflektor och verifiera den därav följande överföringen av rörelsen till den efterföljande pärlan genom dess positionssignal. Flytta scenen för att placera hanteln i närheten av en piedestal kiseldioxidpärla och justera hantelns höjd så att aktinfilamentet kommer i kontakt med kiselsträngytan.Som observerats i denna representativa positionspost, när myosinmotorn inte interagerar med aktinfilamentet, rör sig de fångade pärlorna med konstant hastighet mot lösningens viskösa dragkraft. När myosinmotorn börjar interagera med filamentet överförs kraften som bärs av det rörliga filamentet mycket snabbt till proteinet och systemhastigheten sjunker till noll, med steghändelserna som uppträder under konstant kraft till slutet av körningen. Kraften växlas från den positiva till den negativa riktningen av återkopplingssystemet, som växlar kraftriktningen när strängen når kanten av det svängningsområde som ställts in av användaren.När myosinet binder och förskjuter filamentet mot den positiva riktningen, skjuter den pärlan mot den övre kanten av svängningsområdet. Om detta händer under hjälpkraft kommer myosinets körning att avbrytas av kraftriktningsinversionen vid svängningskanten, vilket begränsar körningens längd till hantelsvängningens amplitud. Exakt inriktning av det optiska systemet är nödvändigt för att uppnå optimal rumslig och tidsmässig upplösning, medan en noggrann kalibrering är nödvändig för att exakt bestämma värdena för de applicerade krafterna.Denna teknik har anpassats för att studera glidande och riktad sökning av transkriptionsfaktorer i DNA samt dynamiska interaktioner mellan mekanotransduktionsproteiner som indukterar över mikrotubulifilament.

Research

JoVE Journal

Biology

Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

Dela upp och inspelning från The C. elegans neuromuskulära förbindelsen

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale.   This ...

Dissecting the Non-human Primate Brain in Stereotaxic Space

Gå igenom Icke-mänskliga primater Brain i Stereotaxic rymden

The use of non-human primates provides an excellent translational model for our understanding of developmental and aging processes in humans1-6. In ...

The Gateway to the Brain: Dissecting the Primate Eye

Porten till hjärnan: Gå igenom Primate Eye

The visual system in humans is considered the  gateway  to the world and plays a principal role in the plethora of sensory, perceptual and cognitive ...

Exploring Cognitive Functions in Babies, Children &amp; Adults with Near Infrared Spectroscopy

Exploring Cognitive Functions in Babies, Children & Adults with Near Infrared Spectroscopy

Exploring kognitiva funktioner hos Bebisar, Barn &amp; Vuxna med nära infraröd spektroskopi

An explosion of functional Near Infrared Spectroscopy (fNIRS) studies investigating cortical activation in relation to higher cognitive processes, such as ...

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

Bedöma Signalering egenskaper Ectodermal epitel Under Kraniofaciala utveckling

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue ...

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Förfaranden för råtta<em&gt; In situ</em&gt; Skelettmuskulaturen Kontraktila egenskaper

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

Kombinera enda molekyl manipulation och Imaging för studier av protein-DNA-interaktioner

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase (ERK) Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase ERK Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Photostimulation av Femtosecond laser aktiverar extracellulär-signalreglerade Kinas (ERK) signalering eller mitokondriella händelser i målceller

Direct control of cellular defined molecular events is important to life science. Recently, studies have demonstrated that femtosecond laser stimulation ...

Quantification of Cellular Densities and Antigenic Properties using Magnetic Levitation

Kvantifiering av cellulär densitet och antigena egenskaper med hjälp av magnetisk levitation

The described method was developed based on the principles of magnetic levitation, which separates cells and particles based on their density and magnetic ...

Detection of Protein Aggregation using Fluorescence Correlation Spectroscopy

Påvisande av proteinaggregering med fluorescenskorrelationsspektroskopi

Protein aggregation is a hallmark of neurodegenerative disorders such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Alzheimer's disease (AD), Parkinson's ...