Name: dissecting mechanoenzymatic properties of processive myosins with ultrafast force-clamp spectroscopy
Uploaded: 2021-07-01T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy at JoVE.com

Bu çalışma, Avrupa Birliği'nin Laserlab-Europe 871124 Hibe Anlaşması kapsamındaki Horizon 2020 araştırma ve inovasyon programı, İtalya Üniversite ve Araştırma Bakanlığı (FIRB "Futuro in Ricerca" 2013 Hibe No. RBFR13V4M2) ve Ente Cassa di Risparmio di Firenze tarafından desteklenmiştir. A.V. Kashchuk, Human Frontier Science Program Cross-Disciplinary Fellowship LT008/2020-C tarafından desteklenmiştir.

1. Optik kurulum
NOT: Deney düzeneği, nanometre işaretleme kararlılığına sahip çift optik cımbızdan ve %1 lazer yoğunluğu dalgalanmalarına < oluşur. Bu koşullar altında, dambılın nanometre seviyesindeki stabilitesi, tipik tuzak sertliği (0.1 pN / nm) ve gerginlik (1 pN - birkaç on pN) altında garanti edilir. Şekil 2 , optik kurulumun ayrıntılı bir şemasını göstermektedir.
<ol><li>Optik cımbız tasarım ve yapımı 9,10,11.<sup class...

<ol>
	<li>Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+a+single-beam+gradient+force+optical+trap+for+dielectric+particles.">Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles.</a> Optical Angular Momentum. 11 (5), 196-198 (2016).</li><li>Capitanio, M., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+biology+with+force:+Single+molecule+high-resolution+measurements+with+optical+tweezers.">Interrogating biology with force: Single molecule high-resolution measurements with optical tweezers.</a> Biophysical Journal. 105 (6), 1293-1303 (2013).</li><li>Capitanio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+force-clamp+spectroscopy+of+single+molecules+reveals+load+dependence+of+myosin+working+stroke.">Ultrafast force-clamp spectroscopy of single molecules reveals load dependence of myosin working stroke.</a> Nature Methods. 9 (10), 1013-1019 (2012).</li><li>Gardini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+myosin-5B+mechanosensitivity+and+calcium+regulation+at+the+single+molecule+level.">Dissecting myosin-5B mechanosensitivity and calcium regulation at the single molecule level.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li><li>Woody, M. S., Winkelmann, D. A., Capitanio, M., Ostap, E. M., Goldman, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+mechanics+resolves+the+earliest+events+in+force+generation+by+cardiac+myosin.">Single molecule mechanics resolves the earliest events in force generation by cardiac myosin.</a> eLife. 8, 49266 (2019).</li><li>Clemen, A. E. -. M., Vilfan, M., Jaud, J., Zhang, J., B&#228;, M., Rief, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force-dependent+stepping+kinetics+of+myosin-V.">Force-dependent stepping kinetics of myosin-V.</a> Biophysical Journal. 88, 4402-4410 (2005).</li><li>Howard, J., Hancock, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+beads+are+better+than+one.">Three beads are better than one.</a> Biophysical Journal. 118 (1), 1-3 (2020).</li><li>Pyrpassopoulos, S., Shuman, H., Ostap, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+kinesin's+load-bearing+capacity+by+force+geometry+and+the+microtubule+track.">Modulation of kinesin's load-bearing capacity by force geometry and the microtubule track.</a> Biophysical Journal. 118 (1), 243-253 (2020).</li><li>Capitanio, M., Maggi, D., Vanzi, F., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FIONA+in+the+trap:+The+advantages+of+combining+optical+tweezers+and+fluorescence.">FIONA in the trap: The advantages of combining optical tweezers and fluorescence.</a> Journal of Optics A: Pure and Applied Optics. 9 (8), 157 (2007).</li><li>Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Position+control+and+optical+manipulation+for+nanotechnology+applications.">Position control and optical manipulation for nanotechnology applications.</a> European Physical Journal B. 46 (1), 1-8 (2005).</li><li>Capitanio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Optical Tweezers. An introduction to Single Molecule Biophysics. , (2017).</li><li>Capitanio, M., Cicchi, R., Saverio Pavone, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+and+time-shared+multiple+optical+tweezers+for+the+study+of+single+motor+proteins.">Continuous and time-shared multiple optical tweezers for the study of single motor proteins.</a> Optics and Lasers in Engineering. 45 (4), 450-457 (2007).</li><li>Gardini, L., Tempestini, A., Pavone, F. S., Capitanio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+optical+tweezers+for+the+study+of+single+molecular+motors.">High-speed optical tweezers for the study of single molecular motors.</a> Methods in Molecular Biology. 1805, (2018).</li><li>Capitanio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calibration+of+optical+tweezers+with+differential+interference+contrast+signals.">Calibration of optical tweezers with differential interference contrast signals.</a> Review of Scientific Instruments. 73 (4), 1687 (2002).</li><li>Monico, C., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S., Capitanio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+single-molecule+manipulation+and+imaging+for+the+study+of+protein-DNA+interactions.">Combining single-molecule manipulation and imaging for the study of protein-DNA interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. (90), e51446 (2014).</li><li>Greenberg, M. J., Lin, T., Goldman, Y. E., Shuman, H., Ostap, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+IC+generates+power+over+a+range+of+loads+via+a+new+tension-sensing+mechanism.">Myosin IC generates power over a range of loads via a new tension-sensing mechanism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), 2433-2440 (2012).</li><li>Gardini, L., Arbore, C., Capitanio, M., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+single+molecule+imaging+and+tracking+of+processive+myosin+motors.">A protocol for single molecule imaging and tracking of processive myosin motors.</a> MethodsX. 6, 1854-1862 (2019).</li><li>Ramaiya, A., Roy, B., Bugiel, M., Sch&#228;ffer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+rotates+unidirectionally+and+generates+torque+while+walking+on+microtubules.">Kinesin rotates unidirectionally and generates torque while walking on microtubules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (41), 10894-10899 (2017).</li></ol>

Üç boncuklu tahlil gibi tek moleküllü teknikler teknik olarak zorlu ve düşük verim olmasına rağmen, UFFCS, verilerin yüksek sinyal-gürültü oranı sayesinde moleküler etkileşimlerin tespitini geliştirir. UFFCS, motor proteinlerinin yüke bağımlılığının incelenmesine izin verir, motorun filamente bağlanması üzerine kuvvetin çok hızlı bir şekilde uygulanmasının temel avantajlarıyla, kuvvet üretimindeki erken ve çok hızlı olayları ve kontrollü kuvvet altındaki zayıf bağlanma durumlar...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62388">Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy</a>. The title was updated.
The title was updated from:
Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy
to:
Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62388">Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy</a>. The title was updated.

Erratum: Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy

Son yıllarda optik cımbız, eşzamanlı manipülasyon ve konformasyonel değişikliklerin ve enzimatik kinetiğin ölçülmesinin çarpıcı olasılığı nedeniyle, tek molekül düzeyinde protein etkileşimlerinin mekanokimyasını aydınlatmak için değerli bir araç olmuştur 1,2. Özellikle, hücredeki moleküler motorlar tarafından uygulananlar aralığındaki kuvvetleri uygulama ve ölçme yeteneği, nanometre altı konformasyonel değişiklikleri ölçme kapasitesiyle birlikte, optik cımbızları, motor proteinlerinin kemomekanik özelliklerini ve mekanik düzenlemelerini çözmek için benzersiz bir tek moleküllü araç haline getirmiştir.
Ultra hızlı kuvvet-kelepçe spektroskopisi (UFFCS), üç boncuklu bir geometride yük altındaki moleküler motorların hızlı kinetiğini incelemek için geliştirilmiş, optik cımbızlara dayanan tek moleküllü bir kuvvet-spektroskopi tekniğidir (Şekil 1a)3,4. UFFCS, motor proteine kuvvet uygulama gecikmesini optik cımbızların fiziksel sınırına, yani sistemin mekanik gevşeme süresine indirir, böylece bir miyozin çalışmasının başlamasından sonra kuvvetin hızla uygulanmasına izin verir (birkaç on mikrosaniye)3. Bu yetenek, hızlı iskelet 3 ve kardiyak5 kas miyozinindeki erken mekanik olayları araştırmak için güç çarpmasının yük bağımlılığını, zayıf ve güçlü bağlanma durumlarını ve ayrıca biyokimyasal (Pi) ve mekanik (powerstroke) olayların sırasını ortaya çıkarmak için kullanılmıştır.
Üç boncuklu geometri genellikle işlemsel olmayan motorları incelemek için kullanılır, kuvvet kelepçeli tek bir boncuk geometrisi, miyozin Va6 gibi işlemsel geleneksel olmayan miyosinleri araştırmak için yaygın olarak kullanılmıştır. Bununla birlikte, işlemsel miyosinler için de üç boncuklu bir UFFCS testini tercih etmenin birkaç nedeni vardır. İlk olarak, aktin-miyozin bağlanmasından hemen sonra yükün hızlı bir şekilde uygulanması, işlemsel olmayan motorlarda olduğu gibi kuvvet gelişimindeki erken olayların ölçülmesine izin verir. Ek olarak, prosesir motorlar söz konusu olduğunda, motorun çalışma uzunluklarının ve çalışma sürelerinin, ilerlemeleri boyunca sabit kuvvet altında doğru bir şekilde ölçülmesini de sağlar (Şekil 1b). Ayrıca, kuvvet geri bildiriminin yüksek oranı nedeniyle, sistem miyozin çalışma stroku gibi pozisyondaki hızlı değişiklikler sırasında kuvveti sabit tutabilir, böylece motor basamağı sırasında sabit bir yükü garanti eder. Sistemin yüksek zamansal çözünürlüğü, sub-ms etkileşimlerinin tespit edilmesine izin verir ve miyozinin aktin'e zayıf bağlanmasını araştırma olasılığını açar. Son olarak, tahlil geometrisi, kuvvetin ihmal edilebilir enine ve dikey bileşenleri ile aktin filamenti boyunca uygulandığını garanti eder. Bu nokta, dikey kuvvet bileşeninin, motorun kinetik 7,8'inin yüke bağımlılığını önemli ölçüde etkilediği gösterildiğinden, özellikle önemlidir. Bu tekniği kullanarak, prosesif miyosin-5B'ye bir dizi yardımcı ve dirençli yük uygulayabilir ve çok çeşitli kuvvetler için prosesinin yük bağımlılığını doğrudan ölçebiliriz4.
Şekil 1a'da gösterildiği gibi, bu sistemde çift optik cımbızın ("dambıl") odağında sıkışmış iki polistiren boncuk arasında tek bir aktin filament asılıdır. Dengesiz bir net kuvvet F = F1-F 2, filamente hızlı bir geri besleme sistemi aracılığıyla empoze edilir, bu da filamentin net kuvvetin ters yönde tersine çevrildiği kullanıcı tanımlı bir ters çevirme noktasına ulaşana kadar bir yönde sabit hızda hareket etmesini sağlar. Motor protein filament ile etkileşime girmediğinde, dambıl, üzerine tek bir motor proteininin tutturulduğu kaide boncuğuna yayılan üçgen dalga şeklinde (Şekil 1b, alt panel) ileri geri hareket etmekte serbesttir. Etkileşim kurulduktan sonra, dambıl tarafından taşınan kuvvet çok hızlı bir şekilde motor proteinine aktarılır ve motor, miyozin aktinden ayrılana kadar, etkileşim sırasında geri besleme sistemi tarafından uygulanan kuvvet yoğunluğu ve yönü altında adım atarak filamenti yerinden oynatmaya başlar. Sıkışmış aktin filamentinin polaritesine bağlı olarak motorun kademelendirilmesiyle üretilen yer değiştirme, uygulanan kuvvetin yönüne göre yük ya yardımcı olabilir, yani motor deplasmanının aynı yönünde itilebilir (Şekil 1b üst panelde itme) veya dirençli, yani motor deplasmanına göre ters yönde çekme (Şekil 1b'de çekme) olabilir. üst panel), motor işlenebilirliğinin kemomekanik regülasyonunu, uygulanan yükün hem yoğunluğu hem de yönlülüğü ile incelemeyi mümkün kılar.
Sonraki bölümlerde, ultra hızlı bir kuvvet-kelepçe spektroskopisi kurulumu ile farklı yükler altında aktin-miyosin-5B etkileşimlerini ölçmek için tüm adımlar, 1) optik kurulumun kurulumu, optik tuzakların hizalanması ve kalibrasyon prosedürleri, 2) tüm bileşenlerin hazırlıkları ve numune odasındaki montajları, 3) ölçüm prosedürü, 4) çalışma uzunluğu, adım boyutu ve motor proteinin hızı gibi önemli fiziksel parametreleri çıkarmak için temsili veri ve veri analizi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;Aliphatic Amine Latex Beads</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A37362</td>
			<td>1.0-&#956;m diameter, 2% (w/v)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>32201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Actin polymerization buffer</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>BSA02</td>
			<td>10X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AODs (acousto-optic deflectors)</td>
			<td>AA Opto Electronic</td>
			<td>DTS-XY 250</td>
			<td>Laser beam deflectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated-BSA</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>29130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B4287</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calmodulin from porcine brain (CaM)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>208783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase from bovine liver</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Condenser</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>OlympusU-AAC, Aplanat, Achromat</td>
			<td>NA 1.4, oil immersion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine phosphate disodium salt tetrahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>27920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Creatine Phosphokinase from rabbit muscle</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDs</td>
			<td>AA Opto Electronic</td>
			<td>AA.DDS.XX</td>
			<td>Two-channel digital synthesizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-Dithiothreitol (DTT)/td&#62;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G-actin protein</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>AKL99</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Oxidase from Aspergillus niger</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;G7141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaloTag succinimidyl ester O2 ligand</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High vacuum silicone grease heavy</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>107921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4/K2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5379/ P8281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labview</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>version 8.1</td>
			<td>Data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labview FPGA module</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>version 8.1</td>
			<td>Fast Force-Clamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>2016</td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>63020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Objective</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Plan-Apo 60X</td>
			<td>NA 1.2, WD 0.2 mm, water imm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrocellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N8267</td>
			<td>0.45 pore size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentyl acetate solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>46022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pure Ethanol</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>2860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QPDs</td>
			<td>UDT</td>
			<td>DLS-20</td>
			<td>D Position Detecto</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine BSA</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A23016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine Phalloidin</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>P1951</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica beads</td>
			<td>Bangslabs</td>
			<td>SS04N</td>
			<td>1.21 mm, 10% solids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin protein</td>
			<td>&#160;Sigma</td>
			<td>189730</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissecting mechanoenzymatic properties of processive myosins with ultrafast force-clamp spectroscopy

Ultra hızlı kuvvet-kelepçe spektroskopisi (UFFCS), lazer cımbızına dayanan tek moleküllü bir tekniktir ve yük altındaki hem geleneksel hem de konvansiyonel olmayan miyosinlerin kemomekaniğinin benzeri görülmemiş bir zaman çözünürlüğü ile araştırılmasını sağlar. Özellikle, aktin-miyozin bağ oluşumundan hemen sonra sabit kuvvet altında miyozin motorlarının araştırılması olasılığı, kuvvet geri bildiriminin yüksek oranı (200 kHz) ile birlikte, UFFCS'nin miyozin çalışma inmesi gibi hızlı dinamiklerin yük bağımlılığını incelemek için değerli bir araç olduğunu göstermiştir. Ayrıca, UFFCS, prosesif ve prosesif olmayan miyosin-aktin etkileşimlerinin uygulanan kuvvetin yoğunluğu ve yönünden nasıl etkilendiğinin incelenmesini sağlar.
Bu protokolü izleyerek, prosesif miyosin-5 motorlarında ve çeşitli geleneksel olmayan miyosinlerde ultra hızlı kuvvet kelepçesi deneyleri yapmak mümkün olacaktır. Bazı ayarlamalarla, protokol kinesinler ve dineinler gibi diğer proses motor sınıflarının incelenmesine de kolayca genişletilebilir. Protokol, deney cihazının kurulumundan numune hazırlamaya, kalibrasyon prosedürlerine, veri toplama ve analize kadar gerekli tüm adımları içerir.

Temsili veriler, Şekil 4'te gösterildiği gibi zaman içindeki pozisyon kayıtlarından oluşur. Konum kaydında iki tür yer değiştirme görülebilir. İlk olarak, miyozin motoru aktin filamenti ile etkileşime girmediğinde, sıkışmış boncuklar, çözücünün viskoz sürükleme kuvvetine karşı sabit bir hızda hareket eder ve operatör tarafından üçgen bir dalga3'te ayarlanan salınım aralığında salınan doğrusal bir yer değiştirmeyi gösterir (...

Watch this Scientific Journal Video about Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy at JoVE.com

Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy

Burada, prosesif miyosin-5 motorları üzerinde ultra hızlı kuvvet kelepçesi deneyleri gerçekleştirmek için kapsamlı bir protokol sunulmaktadır ve bu, diğer proses motor sınıflarının çalışmasına kolayca genişletilebilir. Protokol, deney cihazının kurulumundan numune hazırlama, veri toplama ve analize kadar gerekli tüm adımları detaylandırır.

İşlemsel Miyosinlerin Mekanoenzimatik Özelliklerinin Ultra Hızlı Kuvvet-Kelepçe Spektroskopisi ile Diseksiyonu

Ultrafast force-clamp spectroscopy (UFFCS) is a single molecule technique based on laser tweezers that allows the investigation of the chemomechanics of ...

Ultra hızlı kuvvet-kelepçe spektroskopisi, lazer cımbızına dayanan tek moleküllü bir tekniktir ve yük altındaki miyozin motorlarının kemomekaniğini en yüksek zaman çözünürlüğü ile araştırmayı mümkün kılar. Bu teknik, kuvvet yönü üzerinde tam kontrol ile motor etkileşiminin her aşamasında kuvveti sabit tutarak kuvvet üretiminde çok hızlı olayların araştırılmasını sağlar. Uygun ayarlamalar yapılarak, bu protokol, düzenlemeyi zorla ortaya çıkarmak için kinezinler ve dineinler de dahil olmak üzere diğer tür işlemsel motorlara kolayca uygulanabilir.Bir dizi akusto-optik deflektörü doğrusal bir çeviriciye monte ettikten sonra, bir iris alın ve diyaframını objektif arka diyafram açıklığı boyutuna uyacak şekilde ayarlayın. Hedefi dişli objektif muhafazası üzerinde ortalanmış iris ile değiştirin. Piezo kristali tarafından bloke edilen ışının iristen sonra görülebilen kısmı görünene kadar çeviriciyi lazer ışınına doğru hareket ettirin ve ışın iris açıklığını tamamen doldurana kadar çevirmeni hafifçe geriye doğru çevirin.Pentil asetat içinde silika boncuklar hazırlamak için, önce vorteks ve 30 saniyelik sonikasyon ile 1-1.5 mililitre aseton içinde 20 mikrolitre 1.2 mikron% 10 katı silika boncuk seyreltin. Sonikleştikten sonra, boncukları santrifüjleme ile toplayın ve boncuk peletini ikinci bir yıkama için 1 mililitre taze asetonda yeniden askıya alın. İkinci aseton yıkamadan sonra, boncukları aynı santrifüj koşulları altında yıkama başına 1 mililitre taze pentil asetat içinde üç kez yıkayın ve peleti 100 mikrolitre% 1 nitroselüloz ve 900 mikrolitre pentil asetat içinde yeniden askıya alın.Daha sonra, camı doğrudan etanol içinde durulamak için temiz cımbız kullanmadan ve kapak kaymasının yumuşak azot akışı altında kurumasına izin vermeden önce 24 x 24 milimetrelik bir cam kapak kapağını dikkatlice silmek için saf bir etanol ıslatılmış laboratuvar mendili parçası kullanın. Vorteks ve hazırlanan silika boncuk stoğunu 30 saniye boyunca sonikleştirin ve 2 mikrolitre silika boncuk çözeltisini daha küçük kapak kaymasının yüzeyine bulaştırmak için etanolle temizlenmiş 24 x 60 milimetrelik bir kapak kayması kullanın. Boncuklar kururken, gösterildiği gibi 26 x 76 milimetrelik bir sürgüyü temizleyin ve kızağın uzun kenarlarına bantlanmış 3 milimetre çift taraflı iki adet 60-100 mikron kalınlığında çizgi yerleştirin.Temiz cımbız kullanarak, boncuk kaplı kapak kayışını, boncuklar sürgülü odanın içine bakacak şekilde bant üzerine yerleştirin ve odayı 15 milimolar fosfat tamponu ve yüzer polistiren boncuk çözeltisi ile doldurun. Ardından, odayı silikon gres ile kapatın. Parlak alan kamerasının piksel-nanometre oranını kalibre etmek için, görüş alanının merkezinden yaklaşık 5 mikron uzaktaki kapak kayması yüzeyinde bir silika boncuğun ilk görüntüsünü elde edin.Boncuğu 10 mikron görüş alanının merkezine doğru değiştirmek için sahne alanını hareket ettirin ve ikinci bir görüntü alın. Boncuğun iki konumu arasındaki piksel mesafesini ölçerek kamera kalibrasyon sabitini hesaplayın. Tuzak konumunu kalibre etmek için, tek bir yüzen parçacığı bir tuzakta yakalayın ve akusto-optik deflektörleri 0.2 megahertz adımlarında hareket ettirin, parçacığın bir görüntüsünü ve her adım için deflektörlerin karşılık gelen frekansını elde edin.Ardından, ikinci tuzak için kalibrasyonu aynı şekilde tekrarlayın. Tuzak gücünü ve sertliğini kalibre etmek için, her tuzakta tek bir parçacığı yakalayın ve akusto-optik deflektörleri kullanarak her iki tuzağı da 0.2 megahertz adımlarla yerinden oynatın, Kadran Fotodiyot Dedektörleri ile her iki tuzakta parçacığın Brownian hareketini ve akusto-optik deflektörlerin karşılık gelen frekansını kaydedin. Bir Lorentzian fonksiyonunu kaydedilen Brownian hareketinin güç spektrumuna takarak kalibrasyon sabitleri elde edin.Ölçüm için bir numuneyi bir araya getirmek için, kapak kayma yüzeyinde silika boncukları bulunan yeni bir odaya mililitre biyotinile BSA başına 1 miligram ekleyin. 5 dakika sonra, odayı AB tamponu ile yıkayın ve odaya mililitre streptavidin başına 1 miligram ekleyin. 5 dakika sonra, odayı gösterildiği gibi yıkayın ve 2 mikromolar Kalmodulin ile desteklenmiş M5B tamponuna 3 nanomolar biyotinile Miyosin-5B ağır meromiyozin ekleyin.5 dakika sonra, odayı AB tamponunda 2 mikromolar Kalmodulin ile desteklenmiş mililitre başına 1 miligram biyotinillenmiş BSA ile üç kez yıkayın ve son yıkamadan sonra 3 dakika bekleyin. Reaksiyon karışımını akıtın ve odayı silikon gres ile kapatın. Numuneyi ölçmek için, odayı mikroskop aşamasına yerleştirin ve yüzen alfa-aktinin boncukları odaklanana kadar hedefi hareket ettirin.Bir tuzağı açın ve bir boncuğu yakalayın. İlk tuzak işgal edildikten sonra, birden fazla boncuğun yakalanmasını önlemek için sıkışmış boncuğu kapak kayması yüzeyine yakın konumlandırmak için çevirmeni hareket ettirin ve ikinci tuzağa bir boncuk yakalayın. Çözelti içinde en az 5 mikron uzunluğundaki aktin filamentlerini bulmak için numuneyi uzun menzilli çevirmenler aracılığıyla değiştirin.Bir filament tespit edildiğinde, sıkışmış bir boncuğun filamentin bir ucuna yaklaşmasına izin vermek için numuneyi hareket ettirin. Filament bağlandıktan sonra, boncuğun mesafesini yaklaşık filament uzunluğuna ayarlayın ve bağlanmamış boncuk yönünde bir akış oluşturmak için sahneyi hareket ettirin. Filament akış tarafından gerilecek ve sonunda ikinci boncuğa bağlanacaktır.Elde edilen komplekse dambıl denir"Aktin-miyozin teması kurmak için, iki tuzağı nazikçe ayırın ve filamenti yaklaşık 3 pikonewtona kadar ön gerilme seviyelerine ayarlayın. Dambılın sertliğini araştırmak için, bir akusto-optik deflektörün frekansını değiştirerek ve hareketin konum sinyali aracılığıyla takip eden boncuğa iletimini doğrulayarak üçgen bir dalgada bir tuzak salınımı yapın. Dambılın kaideli bir silika boncuğun yakınına yerleştirmek için sahneyi hareket ettirin ve dambılın yüksekliğini, aktin filamentinin silika boncuk yüzeyi ile temas etmesi için ayarlayın.Bu temsili konum kaydında gözlemlendiği gibi, miyozin motoru aktin filamenti ile etkileşime girmediğinde, sıkışmış boncuklar çözeltinin viskoz sürükleme kuvvetine karşı sabit bir hızda hareket eder. Miyozin motoru filament ile etkileşime girmeye başladığında, hareketli filament tarafından taşınan kuvvet çok hızlı bir şekilde proteine aktarılır ve sistem hızı sıfıra düşer, adım atma olayları koşunun sonuna kadar sabit kuvvet altında gerçekleşir. Kuvvet, boncuk kullanıcı tarafından ayarlanan salınım aralığının kenarına ulaştığında kuvvet yönünü değiştiren geri besleme sistemi tarafından pozitiften negatif yöne geçirilir.Miyozin filamenti pozitif yöne doğru bağladığında ve yerinden oynattığında, boncuğu salınım aralığının üst kenarına doğru iter. Bu yardımcı kuvvet altında gerçekleşirse, miyozin çalışması, salınım kenarındaki kuvvet yönü tersine çevrilmesi ile kesintiye uğrayacak ve koşunun uzunluğunu dambıl salınımının genliği ile sınırlayacaktır. Optik sistemin hassas hizalaması, optimum mekansal ve zamansal çözünürlüğü elde etmek için gereklidir, uygulanan kuvvetlerin değerlerini tam olarak belirlemek için doğru bir kalibrasyon gereklidir.Bu teknik, DNA'daki transkripsiyon faktörlerinin kayan ve hedeflenen araştırmasının yanı sıra mikrotübül filamentleri üzerinde indüklenen mekanotransdüksiyon proteinleri arasındaki dinamik etkileşimleri incelemek için uyarlanmıştır.

Research

JoVE Journal

Biology

Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction

C. Elegans Nöromüsküler Kavşağı Diseksiyon ve kayıt

Neurotransmission is the process by which neurons transfer information via chemical signals to their post-synaptic targets, on a rapid time scale.   This ...

Dissecting the Non-human Primate Brain in Stereotaxic Space

Sigara insan Stereotaksik Uzay Primate Beyin Diseksiyon

The use of non-human primates provides an excellent translational model for our understanding of developmental and aging processes in humans1-6. In ...

The Gateway to the Brain: Dissecting the Primate Eye

Beyin Ağ Geçidi: Primate Göz Diseksiyon

The visual system in humans is considered the  gateway  to the world and plays a principal role in the plethora of sensory, perceptual and cognitive ...

Exploring Cognitive Functions in Babies, Children &amp; Adults with Near Infrared Spectroscopy

Exploring Cognitive Functions in Babies, Children & Adults with Near Infrared Spectroscopy

Yakın Kızılötesi Spektroskopisi ile bebekler, Çocuk ve Yetişkin Bilişsel Fonksiyonları keşfetmek

An explosion of functional Near Infrared Spectroscopy (fNIRS) studies investigating cortical activation in relation to higher cognitive processes, such as ...

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

Kraniofasial Geliştirme sırasında Ektodermal Epiteli Sinyal Özellikleri değerlendirilmesi

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue ...

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Procedures for Rat in situ Skeletal Muscle Contractile Properties

Rat Prosedürleri<em&gt; In situ</em&gt; İskelet Kası Kontraktil Özellikleri

There are many circumstances where it is desirable to obtain the contractile response of skeletal muscle under physiological circumstances: normal ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

Protein-DNA Etkileşiminin Çalışmaları Tek molekül Manipülasyon ve Görüntüleme birleştiren

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase (ERK) Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase ERK Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Femtosecond lazer tarafından fotostimulasyon hedef hücrelerde Ekstrelüler-sinyal düzenlenmiş kinaz (ERK) sinyalizasyon veya mitokondriyal olayları etkinleştirir

Direct control of cellular defined molecular events is important to life science. Recently, studies have demonstrated that femtosecond laser stimulation ...

Quantification of Cellular Densities and Antigenic Properties using Magnetic Levitation

Manyetik Levitasyon Kullanılarak Hücresel Yoğunlukların ve Antijenik Özelliklerin Nicelleştirilmesi

The described method was developed based on the principles of magnetic levitation, which separates cells and particles based on their density and magnetic ...

Detection of Protein Aggregation using Fluorescence Correlation Spectroscopy

Floresan Korelasyon Spektroskopisi Kullanılarak Protein Toplamanın Tespiti

Protein aggregation is a hallmark of neurodegenerative disorders such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Alzheimer's disease (AD), Parkinson's ...