Name: harvesting and disaggregation: an overlooked step in biofilm methods research
Uploaded: 2022-04-22T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Harvesting and Disaggregation: An Overlooked Step in Biofilm Methods Research at JoVE.com

ونود أن نعرب عن تقديرنا لدانييل أور غوفيا، وبلين فريتز، وجنيفر سامرز، وفاي سان لي على مساهماتهم في هذه الورقة.

1. دوامة وصوتنة
<ol><li>تنمو ناضجة P. aeruginosa ATCC 15442 البيوفيلم نمت وفقا لمعيار ASTM E25622.</li>
	<li>في نهاية فترة النمو 48 ساعة ، استعد لمعالجة البيوفيلم وكوبونات العينات وفقا لمعيار ASTM E28718
</li>
	<li>أدخل واقيات رذاذ معقمة معقمة في أنابيب مخروطية معقمة سعة 50 مل باستخدا...

<ol>
	<li>Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+microbial+life+on+surfaces.">Biofilms: microbial life on surfaces.</a> Emerging Infectious Diseases. 8 (9), 881-890 (2002).</li><li>ASTM International. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ASTM+Standard+E2562,+2017,+Standard+Test+Method+for+Quantification+of+Pseudomonas+aeruginosa+Biofilm+Grown+with+High+Shear+and+Continuous+Flow+using+CDC+Biofilm+Reactor.">ASTM Standard E2562, 2017, Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown with High Shear and Continuous Flow using CDC Biofilm Reactor.</a> ASTM International. , (2017).</li><li>Azeredo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+review+on+biofilm+methods.">Critical review on biofilm methods.</a> Critical Reviews In Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).</li><li>Gomes, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+reactors+for+the+study+of+medical+biofilms:+a+review+of+the+principles+and+latest+modifications.">Standardized reactors for the study of medical biofilms: a review of the principles and latest modifications.</a> Critical Reviews in Biotechnology. 38 (5), 657-670 (2018).</li><li>Goeres, D. M., et al., Simoes, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+fabrication+of+biofilm+reactors.">Design and fabrication of biofilm reactors.</a> Recent Trends in Biofilm Sciences and Technology. , 71-88 (2020).</li><li>Goeres, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+growing+a+biofilm+under+low+shear+at+the+air-liquid+interface+using+the+drip+flow+biofilm+reactor.">A method for growing a biofilm under low shear at the air-liquid interface using the drip flow biofilm reactor.</a> Nature Protocols. 4 (5), 783-788 (2009).</li><li>ASTM International. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ASTM+Standard+E2871,+Standard+Test+Method+for+Determining+Disinfectant+Efficacy+Against+Biofilm+Grown+in+the+CDC+Biofilm+Reactor+Using+the+Single+Tube+Method.">ASTM Standard E2871, Standard Test Method for Determining Disinfectant Efficacy Against Biofilm Grown in the CDC Biofilm Reactor Using the Single Tube Method.</a> ASTM International. , (2019).</li><li>Goeres, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+Biofilm+Efficacy+Test:+The+Single+Tube+Method.">Validation of a Biofilm Efficacy Test: The Single Tube Method.</a> Journal of Microbiological Methods. , (2019).</li><li>The development and validation of a standard in vitro method to evaluate the efficacy of surface modified urinary catheters. Theses and Dissertations at Montana State University Available from: <a target="_blank" href="https://scholarworks.montana.edu/xmlui/handle/1/15149">https://scholarworks.montana.edu/xmlui/handle/1/15149</a> (2019)</li><li>Hamilton, M. A., Buckingham-Meyer, K., Goeres, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Checking+the+Validity+of+the+harvesting+and+Disaggregating+Steps+in+Laboratory+Tests+of+Surface+Disinfectants.">Checking the Validity of the harvesting and Disaggregating Steps in Laboratory Tests of Surface Disinfectants.</a> Journal of AOAC International. 92 (6), 1755-1762 (2009).</li><li>Conlon, B. P., Rowe, S. E., Lewis, K., Donelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persister+Cells+in+Biofilm+Associated+Infections.">Persister Cells in Biofilm Associated Infections.</a> Biofilm-based Healthcare-associated Infections. , (2015).</li><li>ASTM International. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ASTM+Standard+E2647,+Standard+Test+Method+for+Quantification+of+Pseudomonas+aeruginosa+Biofilm+Grown+Using+Drip+Flow+Biofilm+Reactor+with+Low+Shear+and+Continuous+Flow.">ASTM Standard E2647, Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown Using Drip Flow Biofilm Reactor with Low Shear and Continuous Flow.</a> ASTM International. , (2020).</li><li>Rosenberg, M., Azevedo, N., Ivask, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propidium+iodide+staining+underestimates+viability+of+adherent+bacterial+cells.">Propidium iodide staining underestimates viability of adherent bacterial cells.</a> Scientific Reports. , (2019).</li><li>Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Manuira-Weber, K., Ren, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+aspects+of+using+bacterial+cell+viability+assays+with+the+fluorophores+SYTO9+and+propidium+iodide.">Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide.</a> BMC Microbiology. , (2015).</li><li>Kobayashi, N., Bauer, T. W., Tuohy, M. J., Fujishiro, T., Procop, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+Ultrasonication+Improves+Detection+of+Biofilm-formative+Bacteria+Around+a+Metal+Implant.">Brief Ultrasonication Improves Detection of Biofilm-formative Bacteria Around a Metal Implant.</a> Clinical Orthopaedics and Related Research. 457, 210-213 (2007).</li><li>Lourenco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimum+information+about+a+biofilm+experiment+(MIABiE),+standards+for+reporting+experiments+and+data+on+sessile+microbial+communities+living+at+interfaces.">Minimum information about a biofilm experiment (MIABiE), standards for reporting experiments and data on sessile microbial communities living at interfaces.</a> Pathogens and Disease. , 1-7 (2014).</li><li>Nascentes, C. C., Korn, M., Sousa, C. S., Arruda, M. A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Ultrasonic+Baths+for+Analytical+Applications:+A+New+Approach+for+Optimisation+Conditions.">Use of Ultrasonic Baths for Analytical Applications: A New Approach for Optimisation Conditions.</a> Journal of Brazilian Chemical Society. 12 (1), 57-63 (2001).</li><li>Elma GmbH &amp; Co. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KG+TI-H+Ultrasonic+Cleaning+Units:+Operating+Instructions.">KG TI-H Ultrasonic Cleaning Units: Operating Instructions.</a> Elma GmbH &amp; Co. , (2009).</li><li>Stamper, D. M., Holm, E. R., Brizzolara, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+times+and+energy+densities+for+ultrasonic+disinfection+of+Escherichia+coli,+Pseudomonas+aeruginosa,+Enterococcus+avium+and+sewage.">Exposure times and energy densities for ultrasonic disinfection of Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus avium and sewage.</a> Journal of Environmental Engineering and Science. 7 (2), 139-146 (2008).</li><li>Suslick, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonochemistry.">Sonochemistry.</a> Science. 247 (4949), (1990).</li></ol>

الحد الأدنى من المعلومات لطرق الحصاد والتصنيف لإنشاء بيانات بيوفيلم قابلة للتكرار عبر المجتمع العلمي ، من الضروري أن يدرج المؤلفون أكبر قدر ممكن من التفاصيل فيما يتعلق بكل خطوة من خطوات النمو والمعالجة وأخذ العينات والتحليل لطريقة البيوفيلم. وقد ساعد توحيد أساليب البيوفيلم ف?...

وقد تطور تعريف الأغشية الحيوية على مدى العقود القليلة الماضية ويشمل الارتباط الميكروبي مع مجموعة متنوعة من الأسطح البيولوجية و/أو غير البيولوجية، وإدراج المكونات غير الخلوية1 التي تظهر نموا مختلفا وتعبيرا جينيا2 داخل مصفوفة. يوفر البيوفيلم الحماية من الضغوط البيئية مثل التجفيف وقد يجعل عمل المطهرات الكيميائية أقل فعالية مما يؤدي إلى بقاء الميكروبات. يمكن للناجين داخل الفيلم الحيوي أن يوفروا مصدرا للكائنات الحية الدقيقة المسببة للأمراض التي تشكل مصدر قلق للصحة العامة3.
تتكون طرق الأغشية الحيوية من أربع خطوات ، النمو ، العلاج ، أخذ العينات (الحصاد والتصنيف) ، والتحليل. النمو ، الخطوة الأولى ، حيث يحدد المستخدم ظروف نمو الكائن الحي ، ودرجة الحرارة ، والوسائط ، وما إلى ذلك ، هو الأكثر مراعاة والإبلاغ عنه في أدبيات البيوفيلم4،5،6،7. تقوم خطوة العلاج بتقييم مضادات الميكروبات (مثل المطهرات) لتحديد فعاليتها إما ضد الأغشية الحيوية الناضجة3،8،9 أو يمكن دمج مضادات الميكروبات في السطح لتحديد قدرة المنتج على منع أو تقليل نمو الأغشية الحيوية10. تتضمن الخطوة الثالثة ، أخذ العينات ، خطوات لحصاد البيوفيلم من السطح الذي كان ينمو عليه وتصنيف الكتل التي تمت إزالتها3،8،11. قد تتضمن الخطوة الرابعة ، التحليل ، تعداد الخلايا القابلة للحياة ، والفحص المجهري ، وقياسات التألق ، والنتائج الجزيئية ، و / أو تقييم مكون المصفوفة8,9. يوفر تقييم البيانات معلومات حول نتائج التجربة. ومن بين الخطوات الأربعة، غالبا ما يكون أخذ العينات هو الخطوة الأكثر تجاهلا لأنه يفترض أن تقنية حصاد الأغشية الحيوية المختارة و/أو تصنيفها فعالة بنسبة 100٪، وغالبا ما تكون دون تحقق11.
تتطلب المعلقات العوالق للبكتيريا ، التي غالبا ما تعتبر متجانسة ، دوامة بسيطة قبل التحليل. ومع ذلك، فإن الأغشية الحيوية هي مجتمعات معقدة تتكون من الكائنات الحية الدقيقة (بدائية النواة و/أو حقيقية النواة)، والسكريات الخارجية، والبروتينات، والدهون، والحمض النووي خارج الخلية، والخلايا المضيفة12. هناك حاجة إلى خطوات تتجاوز طرق الاستزراع الميكروبيولوجي التقليدية للعوالق من أجل حصاد الأغشية الحيوية بشكل كاف من سطح ما ثم تقسيمها إلى تعليق متجانس للخلية الواحدة. أظهر استعراض واسع النطاق للأدبيات (معلومات غير مدرجة في هذا المنشور) أن اختيار تقنية الإزالة والتصنيف يعتمد على عدد من العوامل ، بما في ذلك الأنواع الموجودة في البيوفيلم ، والسطح الذي يرتبط به البيوفيلم (غير مسامي أو مسامي) ، وإمكانية الوصول إلى أسطح النمو (قسيمة قابلة للإزالة بسهولة أو تدمير مادي للجهاز الذي ينمو فيه البيوفيلم) ، هندسة السطح (المساحة والشكل) ، وكثافة الأغشية الحيوية على أسطح النمو ، والمعدات المختبرية المتاحة.
عندما يتم حصاد البيوفيلم من سطح ، يكون تعليق الخلية الناتج غير متجانس. وإذا أريد تعداد هذا التعليق غير المنتظم بدقة، فيجب تصنيفه إلى خلايا فردية. تفترض أعداد الصفائح القابلة للحياة أن وحدة تشكيل المستعمرة تنشأ من بكتيريا واحدة. إذا تم وضع مجاميع من البيوفيلم على وسط النمو ، فمن المستحيل التمييز بين الخلايا الفردية التي يمكن أن تؤدي إلى تقديرات غير دقيقة. على سبيل المثال ، أثناء اختبار فعالية المطهر ، إذا كان العلاج يزيل الأغشية الحيوية بشكل فعال للغاية من سطح مقارنة بالتحكم ، فقد يظهر تقليل السجل كبيرا بشكل مصطنع مقارنة بالتحكم. من ناحية أخرى، يبدو أن المطهر الكيميائي الذي يثبت الأغشية الحيوية على سطح مقارنة بعنصر التحكم لديه انخفاض أقل في السجل11. يمكن أن يؤدي هذا النوع من السيناريوهات إلى تفسير متحيز للبيانات التجريبية.
واستعدادا للنشر، خلص استعراض للأدبيات إلى أن النهج الشائعة لحصاد الأغشية الحيوية وتصنيفها تشمل الكشط أو المسح أو الصوتنة أو الدوامة أو مزيج من هذه النهج. يعرف الكشط بأنه الإزالة الفيزيائية للفيلم الحيوي من الأسطح باستخدام عصا معقمة أو ملعقة أو أداة أخرى. يشير المسح إلى إزالة البيوفيلم من الأسطح باستخدام عصا قطنية مائلة أو غيرها من المواد الماصة الثابتة. يشير الصوتنة إلى تعطيل الأغشية الحيوية من الأسطح عبر الموجات فوق الصوتية الموزعة عبر الماء. يشير الدوامة إلى استخدام خلاط لتحقيق دوامة سائلة للعينة داخل أنبوب. يستخدم التجانس شفرات دوارة لقص كتل الأغشية الحيوية التي يتم حصادها في تعليق خلية واحدة. في هذه الورقة ، نقدم ثلاث طرق للحصاد والتصنيف لنوعين مختلفين من الأسطح ، صلبة / غير مسامية ومسامية.
يتم توفير قائمة بالحد الأدنى من المعلومات الموصى بها التي يجب على الباحثين تضمينها في أقسام الأساليب في المنشورات. نأمل أن يؤدي تضمين هذه المعلومات إلى تمكين الباحثين الآخرين من إعادة إنتاج عملهم. لا توجد طريقة مثالية للحصاد والتصنيف ، لذلك ، يتم أيضا تقديم توصيات حول كيفية التحقق من هذه التقنية.
يتم توضيح ثلاث طرق شائعة لحصاد وتصنيف الأغشية الحيوية من أسطح النمو الشائعة في هذه المقالة. ستمكن هذه المعلومات الباحثين من فهم الدقة والتحيز بشكل عام لطريقة اختبار الأغشية الحيوية بشكل أفضل. الطرق الموصوفة هي كما يلي: (1) يتم حصاد وتصنيف الأغشية الحيوية Pseudomonas aeruginosa المزروعة على كوبونات البولي كربونات (سطح صلب غير مسامي) تحت قص عالي السوائل في مفاعل البيوفيلم CDC وتصنيفها بعد مزيج من خمس خطوات من الدوامة والصوتنة لتحقيق حصاد الأغشية الحيوية وتصنيفها (2) A P. aeruginosa يتم حصاد الأغشية الحيوية المزروعة على كوبونات زجاجية البورسليكات (سطح صلب غير مسامي) في مفاعل التدفق بالتنقيط تحت قص منخفض السوائل وتصنيفها باستخدام الكشط والتجانس (3) يتم حصاد الأغشية الحيوية الإشريكية القولونية المزروعة في أنابيب السيليكون (سطح مسامي) وتصنيفها باستخدام الكشط ، تليها الصوتنة والدوامة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>50 mL conical vials</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL glass beakers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB102100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-12D</td>
			<td>For adding treatment to vials containing coupons.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL serological pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-14C</td>
			<td>For adding neutralizer to vials at the end of treatment contact time.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applicator sticks</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostats</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal spatula</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE policemen</td>
			<td>Saint-Gobain</td>
			<td>06369-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S 10 N - 10 G - ST Dispersing tool</td>
			<td>IKA</td>
			<td>4446700</td>
			<td>For homogenization of biofilm samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-951-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Foley catheter, size 16 French</td>
			<td>Medline Industries</td>
			<td>DYND11502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing, size 16</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW96400-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Splash Guards</td>
			<td>BioSurface Technologies, Inc.</td>
			<td>CBR 2232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T 10 basic ULTRA-TURRAX Disperser</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3737001</td>
			<td>For homogenization of biofilm samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing connectors</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW02023-86</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Elma</td>
			<td>TI-H15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2 Vertical 50 mL Tube Holder</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-V506</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

harvesting and disaggregation: an overlooked step in biofilm methods research

تتكون طرق البيوفيلم من أربع خطوات متميزة: زراعة البيوفيلم في نموذج ذي صلة ، ومعالجة البيوفيلم الناضج ، وحصاد البيوفيلم من السطح وتصنيف الكتل ، وتحليل العينة. من بين الخطوات الأربع ، يعد الحصاد والتصنيف الأقل دراسة ولكنه مع ذلك حاسم عند النظر في إمكانية التحيز في الاختبار. توضح هذه المقالة تقنيات الحصاد والتصنيف الشائعة الاستخدام للأغشية الحيوية المزروعة على ثلاثة أسطح مختلفة. وتشمل تقنيات حصاد وتصنيف الأغشية الحيوية الثلاثة، المستقاة من مراجعة واسعة النطاق للأدبيات، الدوامة والصوتنة، والكشط والتجانس، والكشط والدوامة والصوتنة. يتم النظر في نوعين من الأسطح: الصلبة غير المسامية (زجاج البولي والبورسليكات) والمسامية (السيليكون). بالإضافة إلى ذلك ، نقدم توصيات للحد الأدنى من المعلومات التي يجب تضمينها عند الإبلاغ عن تقنية الحصاد المتبعة وطريقة مصاحبة للتحقق من التحيز.

التحقق من صحة / تأكيد طريقة الحصاد فحصت العديد من الدراسات التي أجريت في مختبرنا قدرة الدوامة والصوتنة على حصاد الأغشية الحيوية المزروعة في مفاعل الأغشية الحيوية (ASTM E2562)2 بشكل فعال باستخدام طريقة الأنبوب الواحد (ASTM E2871)8.
تم زراعة البيو?...

Watch this Scientific Journal Video about Harvesting and Disaggregation: An Overlooked Step in Biofilm Methods Research at JoVE.com

Harvesting and Disaggregation: An Overlooked Step in Biofilm Methods Research

تفصل هذه الورقة الطرق التي توضح ثلاث تقنيات شائعة لحصاد الأغشية الحيوية وتصنيفها على نوعين من الأسطح ، واختبار الصلابة لطريقة الحصاد والحد الأدنى من المعلومات التي يجب مراعاتها عند اختيار وتحسين تقنيات الحصاد والتصنيف لزيادة قابلية التكاثر.

الحصاد والتصنيف: خطوة مهملة في أبحاث أساليب البيوفيلم

Biofilm methods consist of four distinct steps: growing the biofilm in a relevant model, treating the mature biofilm, harvesting the biofilm from the ...

الهدف العام لهذه الإجراءات هو حصاد وتصنيف الأغشية الحيوية بالطريقة المثلى من أجل زيادة قابلية التكاثر. سيتم عرض ثلاث تقنيات في هذا الفيديو ، يركز كل منها على الحصاد والتصنيف من نوع سطح مختلف. سيوضح هذا الفيديو التقنيات المناسبة لواحد ، دوامة وصوتنة البيوفيلم من سطح صلب غير مسامي مثل قسيمة البولي كربونات من مفاعل البيوفيلم CDC.ثانيا، كشط وتجانس الأغشية الحيوية من سطح زجاج البورسليكات الصلب غير المسامي الموجود عادة في مفاعل التدفق بالتنقيط. وثالثا ، كشط ، دوامة ، وصوتنة البيوفيلم من سطح أنابيب السيليكون المسامية الموجودة عادة في نموذج القسطرة. مرحبا ، اسمي كيلي باكنغهام ماير هنا في مختبر أساليب البيوفيلم الموحد.في مختبرنا ، نقوم بتقسيم طرق البيوفيلم إلى أربعة مكونات: النمو والعلاج وأخذ العينات والتحليل. في الأدبيات التي تمت مراجعتها من قبل النظراء ، عادة ما تكون تفاصيل كيفية أخذ عينات من الأغشية الحيوية أو حصادها وتصنيفها من سطح ما متفرقة. هذا هو السبب في هذا الفيديو.نظرا لأن مختبرنا يقوم بتطوير واختبار طرق البيوفيلم الموحدة ، فقد أجرينا مراجعة شاملة للأدبيات حيث تم تحديد طرق حصاد وتصنيف الأغشية الحيوية الثلاثة الأكثر شيوعا. هذه الطرق هي دوامة وصوتنة البيوفيلم من قسيمة البولي كربونات ، وكشط وتجانس البيوفيلم من قسيمة زجاجية البورسليكات ، وكشط ، دوامة ، وصوتنة البيوفيلم من أنابيب السيليكون. على الرغم من أن الأساليب المكتوبة على الورق قوية ، إلا أننا نأمل أن يكون الفيديو الذي يحتوي على التفاصيل الفنية التي قدمتها زميلتي في العمل ليندسي ميلر وأنا مفيدا.للبدء ، تنمو البيوفيلم الكاذب الزنجاري الناضج 15442 وفقا لمعيار ASTM E2562 ، طريقة الاختبار القياسية لتحديد كمية الزائفة الزنجارية Biofilm المزروعة مع القص العالي والتدفق المستمر باستخدام مفاعل البيوفيلم CDC. في نهاية فترة النمو التي تستغرق 48 ساعة ، استعد لمعالجة وأخذ عينات من القسائم وفقا لمعيار ASTM E2871 ، وهو طريقة الاختبار القياسية لتحديد فعالية المطهر ضد الأغشية الحيوية المزروعة في مفاعل الأغشية الحيوية CDC باستخدام طريقة الأنبوب الواحد. ثم أدخل واقيات رذاذ معقمة معقمة في أنابيب مخروطية معقمة سعة 50 ملليلتر باستخدام ملقط معقم باللهب.كرر ذلك لجميع الأنابيب التي ستتلقى العلاج. لا تحتاج أنابيب كوبونات التحكم إلى واقي من الرذاذ. قم بإزالة قضيب من مفاعل الأغشية الحيوية CDC وشطفه في 30 ملليلتر من ماء التخفيف المعقم.سيؤدي ذلك إلى إزالة الخلايا المرفقة بشكل فضفاض من البيوفيلم. أمسك القضيب بالتوازي مع أعلى المقعد فوق أنابيب العينة مع واقيات الرذاذ. باستخدام وجع ألين معقم باللهب ، قم بفك البراغي المحددة لإسقاط قسيمة مغلفة بالأغشية الحيوية في الأنبوب.كرر ذلك للعدد المطلوب من القسائم. قم بإزالة واقيات الرذاذ ووضع واقيات الرذاذ في حاوية منفصلة للتعقيم. باستخدام ماصة مصلية سعة خمسة ملليلترات ، قم ببطء بماصة أربعة ملليلترات من العلاج أو التحكم في الأنابيب بحيث يتدفق السائل إلى داخل جدار الأنبوب.قم بتدوير الجزء السفلي من الأنبوب بلطف بحيث يتم تشريد أي فقاعات هواء تحت القسيمة. اسمح لمدة 30 إلى 60 ثانية بين كل إضافة. في نهاية وقت التلامس المحدد ، ماصة 36 ملليلتر من المحايد في الأنابيب بنفس الترتيب الذي تم به تطبيق العلاج أو التحكم.دوامة كل أنبوب على أعلى إعداد لمدة 30 زائد أو ناقص خمس ثوان وتأكد من تحقيق دوامة كاملة. ضع الأنابيب في رف الأنبوب معلقة في سونيكتور منزوع الغاز بحيث يكون مستوى الماء في الحمام مساويا لمستوى الماء في الأنابيب. قم بضبط العينات عند 45 كيلوهرتز ، وقوة 100٪ ، ووظيفة طبيعية لمدة 30 زائد أو ناقص خمس ثوان.كرر دورات الدوامة والصوتنة وانتهى بدوامة نهائية ، لما مجموعه خمس دورات. أخيرا ، قم بتخفيف العينة بشكل متسلسل ، وقم بلوحة التخفيف على أجار R2A واحتضن الألواح لمدة 24 ساعة عند 36 درجة مئوية. عد المستعمرات حسب الاقتضاء لطريقة الطلاء وسجل البيانات.هذه التقنية التالية لحصاد الأغشية الحيوية وتصنيفها مفيدة للقسائم الصلبة غير المسامية التي تعد المعيار في مفاعل التدفق بالتنقيط. تنمو البيوفيلم البيوفيلم الكاذب الزنجاري الناضج 15442 وفقا لمعيار ASTM E2647 طريقة الاختبار القياسية لتحديد كمية البيوفيلم البيوغرافي الزائف الزنجاري المزروع باستخدام مفاعل الأغشية الحيوية بالتنقيط مع القص المنخفض والتدفق المستمر. قم بإعداد محطة أخذ العينات لتشمل لوحة أخذ العينات ، والإيثانول بنسبة 95٪ في الكأس ، وموقد الكحول ، ومرقئ ، وأداة إزالة القسيمة ، والأكواب مع مياه تخفيف معقمة ، وأنابيب تخفيف لشطف القسائم.قم بإيقاف تشغيل المضخة ، وإزالة غطاء القناة واستخدام أداة إزالة القسيمة المعقمة ومرقئ لإزالة القسيمة ، مع الحرص على عدم إزعاج البيوفيلم. شطف القسيمة عن طريق غمرها بلطف مع حركة سائلة في 45 ملليلتر من مياه التخفيف المعقمة الموجودة في أنبوب الطرد المركزي 50 ملليلتر. عكس الحركة على الفور لإزالة القسيمة.ضع القسيمة في كوب يحتوي على 45 ملليلتر من ماء التخفيف المعقم. كشط سطح القسيمة المغطى بالأغشية الحيوية في اتجاه هبوطي لمدة 15 ثانية تقريبا باستخدام ملعقة أو مكشطة معقمة. شطف ملعقة أو مكشطة عن طريق تحريكها في دورق.كرر عملية الكشط والشطف ثلاث إلى أربع مرات لضمان التغطية الكاملة لسطح القسيمة. شطف القسيمة عن طريق الاحتفاظ بها بزاوية 60 درجة فوق الكأس المعقمة وسحب ملليلتر واحد من ماء التخفيف المعقم على سطح القسيمة. كرر ذلك لما مجموعه خمس غسلات.الحجم النهائي في الكأس هو الآن 50 ملليلتر. العمل في خزانة السلامة الأحيائية ، تجانس عينة الأغشية الحيوية المكشطة. قم بإرفاق مسبار مجانس معقم بالمجانس.ضع طرف المسبار في السائل وقم بتشغيل المجانس وقم بمنحدر يصل إلى 20،500 دورة في الدقيقة. تجانس العينة لمدة 30 ثانية. اخفض عدد الدورات في الدقيقة وأوقف تشغيل المجانس.قم بتعقيم المسبار بين عينات الأغشية الحيوية عن طريق التجانس في تسعة ملليلتر تخفيف معقم فارغ عند 20،500 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية كما هو موضح أعلاه. تجانس أنبوب تسعة ملليلتر من 70٪ من الإيثانول لمدة 30 ثانية وافصل المسبار واتركه يقف في أنبوب الإيثانول لمدة دقيقة واحدة. تجانس فراغين إضافيين للتخفيف.أيضا ، يمكن استخدام مسبار مجانس معقم يمكن التخلص منه لكل عينة. قم بتخفيف العينة المتجانسة بشكل متسلسل ، وقم بلوحة التخفيفات على R2A باستخدام طريقة الطلاء المناسبة ، واحتضن الألواح لمدة 24 ساعة عند 36 درجة مئوية. عد المستعمرات وسجل البيانات.هذه التقنية النهائية لحصاد الأغشية الحيوية وتصنيفها مفيدة للفيلم الحيوي المزروع في أنابيب مسامية مثل أنابيب السيليكون المستخدمة في نموذج القسطرة. لبدء هذا الإجراء ، قم بزراعة البيوفيلم E.coli 53498 الناضج في أنابيب قسطرة السيليكون. تحضير مواد أخذ العينات: أنابيب مغسولة ، أنبوب طرد مركزي معقم ، طبق بتري معقم فارغ ، مرقئ من الفولاذ المقاوم للصدأ معقم باللهب ، مقص ، مؤقت ، ومسطرة.مع إيقاف المضخة مؤقتا ، استخدم 70٪ من الإيثانول لتنظيف الجزء الخارجي من الأنابيب. قم بقياس سنتيمترين من النهاية ، وتجنب المنطقة المتصلة بالموصل ، ووضع علامة على الأنابيب لتحديد مواقع القطع. باستخدام مقص معقم باللهب ، اقطع الأنابيب على علامة السنتيمترين.شطف جزء الأنابيب لإزالة الخلايا العوالق. باستخدام ملقط معقم باللهب ، اغمر مقطع الأنابيب بلطف في 20 ملليلتر من ماء التخفيف المعقم ، ثم أزله على الفور. ضع الجزء في 10 ملليلتر من المحايد.باستخدام ملقط معقم باللهب ، أمسك جزء الأنابيب وكشطه بعصا قضيب خشبية معقمة حتى يتم كشط جميع المناطق الداخلية للأنابيب. في بعض الأحيان شطف العصا في 10 ملليلتر من المعادل ووضع الجزء مرة أخرى في أنبوب العينة. جزء الأنابيب المكشطة هو الآن 10 إلى الصفر أو التخفيف الصفري.دوامة كل أنبوب على أعلى إعداد لمدة 30 زائد أو ناقص خمس ثوان. ضع الأنابيب في رف الأنبوب المعلق في حمام سونيكتور ، بحيث يكون مستوى الماء في الحمام مساويا لمستوى السائل في الأنابيب. سونيكات عند 45 كيلوهرتز ، قوة 100٪ ، ووظيفة طبيعية لمدة 30 زائد أو ناقص خمس ثوان.كرر هذه الدوامة ودورة الصوتنة ، ثم تنتهي بالدوامة النهائية. قم بتخفيف العينات بشكل متسلسل في الماء العازل. طبق على أجار الصويا التربتيك باستخدام طريقة الطلاء المناسبة ثم احتضن الأنابيب عند 36 زائد أو ناقص درجتين مئويتين لمدة 24 ساعة.عد المستعمرات حسب الاقتضاء لطريقة الطلاء المستخدمة وسجل البيانات لحساب المتوسط الحسابي. تساعد هذه الصور الأربع التي التقطتها دانييل أور وبلين فريتز على توضيح أهمية إجراء الحصاد والتصنيف هذا. تم تلطيخ جميع هذه القسائم الأربعة باللون البنفسجي البلوري للمساعدة في تصور كمية البيوفيلم Pseudomonas aeruginosa الموجود على القسائم قبل وبعد الدوامة وعملية الصوتنة.القسيمة A مغطاة بالكامل في البيوفيلم ، في حين أن القسائم B و C و D تحتوي جميعها على فيلم حيوي أقل بكثير على سطحها. خضعت جميع القسائم B و C و D لعملية الدوامة والصوتنة الموضحة سابقا. هاتان الصورتان اللتان التقطتهما ليندسي ميلر على مجهر متحد البؤرة عند تكبير 12.5X تصور فيلما حيويا من Pseudomonas aeruginosa تمت معالجته ببقعة حية / ميتة في الضوء الخلفي.تم صوتنة الصورة على اليسار عند 45 كيلوهرتز و 10٪ من الطاقة ، في حين أن الصورة على اليمين كانت صوتية عند 45 كيلوهرتز و 100٪ من الطاقة. من الواضح أن القسيمة الموجودة على اليسار لديها المزيد من البيوفيلم المتبقي على سطحها مقارنة بالقسيمة الموجودة على اليمين. يعرض هذا الشكل النهائي كيف يؤثر التلاعب بمعلمات الصوتنة المختلفة على كمية البيوفيلم Pseudomonas aeruginosa الذي تمت إزالته من سطح القسيمة.تم تشغيل جميع هذه القسائم بسرعة 45 كيلوهرتز ، وقوة 100٪ ، وفي الإعداد العادي لمدة 30 ثانية زائد أو ناقص خمس ثوان. تم التقاط هذه الصور بتكبير 12.5X بواسطة Lindsey Miller. تم صوتنة القسائم في الصف الأول في ماء التخفيف ، في حين تم صوتنة القسائم في الصف الثاني في مرق تحييد DE.يبدو أن هناك كمية أقل من البيوفيلم المتبقي على القسائم التي تم صوتها في مرق DE الذي يحتوي على خافض للتوتر السطحي مقارنة بالماء المخفف. تم صوتنة جميع القسائم A و B و E و F بحجم 10 ملليلتر ، في حين تم صوتنة القسائم C و D و G و H في 40 ملليلتر من المحلول. من الواضح أن هناك كمية أقل من البيوفيلم على القسائم التي تم صوتها في الأحجام الأصغر.تم صوتنة القسائم A و C و E و G في الحمام بثلاثة أنابيب في وقت واحد ، في حين تم صوتنة القسائم B و D و F و H في حمام مع 12 أنبوبا في وقت واحد. يبدو أن العينات الصوتية مع عدد أقل من الأنابيب أظهرت حصادا متفوقا للأغشية الحيوية. في نهاية المطاف ، يبدو أن تقليل الحجم في الأنابيب ، وتقليل عدد الأنابيب الصوتية في وقت واحد ، واستخدام مرق تحييد DE ، كلها تساهم في تعزيز حصاد الأغشية الحيوية.لا توجد طريقة مثالية لحصاد وتصنيف الأغشية الحيوية ، ولكن بعض الأساليب أفضل للأسطح و / أو التطبيقات المختلفة. التقنيات الموضحة في هذا الفيديو هي الطرق الثلاث الأكثر شيوعا وفقا لمراجعة الأدبيات. هذه التقنيات الثلاث يمكن أن توفر نقطة انطلاق للباحثين.من المهم أن تأخذ الوقت الكافي للتحقق من صحة طريقة الحصاد والتصنيف المختارة. تختلف جميع المعدات قليلا ، لذلك حتى لو تم توحيد الطريقة ، فلا يزال من الحكمة تأكيد عملية المعدات المستخدمة. أظهرت الأبحاث أن الخيارات غير الصحيحة قد تؤدي إلى نتائج اختبار متحيزة.بعد مشاهدة هذا الفيديو ، نأمل أن تساعد هذه المعلومات الباحثين على اتخاذ قرارات أكثر استنارة بشأن الطريقة التي يجب استخدامها وتقديم إرشادات حول تحسين قابلية التكاثر لأنواع الأسطح الثلاثة وتقنيات الحصاد والتصنيف المجانية.

Research

JoVE Journal

Biology

Harvesting Sperm and Artificial Insemination of Mice

حصاد الحيوانات المنوية والتلقيح الاصطناعي من الفئران

Rodents of the genus Peromyscus (deer mice) are the most prevalent native North American mammals.  Peromyscus species are used in a wide range of research ...

A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles

A أسلوب الخطوة بخطوة لإعادة تشكيل ناقلة الى جزيئات الدهون ABC Nanodisc

The nanodisc is a discoidal particle (~ 10-12 nm large) that trap membrane proteins into a small patch of phospholipid bilayer. The nanodisc is a ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

الأساسية<em&gt; Caenorhabditis ايليجانس</em&gt; طرق: التزامن والمراقبة

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

في المختبر إعادة تشكيل مجمعات خفيفة حصاد النباتات والطحالب الخضراء

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls ...

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

كفاءة الثدييات التعبير خلية وخطوة واحدة خارج الخلية تنقية البروتينات السكرية لبلورة

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...

An In Vitro Model to Study the Effect of 5-Aminolevulinic Acid-mediated Photodynamic Therapy on Staphylococcus aureus Biofilm

An In Vitro Model to Study the Effect of 5-Aminolevulinic Acid-mediated Photodynamic Therapy on Staphylococcus aureus Biofilm

نموذج في المختبر لدراسة أثر "العلاج الضوئي" 5-Aminolevulinic حمض-بوساطة على بيوفيلم العنقوديات الذهبية

Staphylococcus aureus (S. aureus) is a common human pathogen, which causes pyogenic and systemic infections. S. aureus infections are difficult to ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

تحليل الكائنات المجهرية باستخدام ثنائي الخطوة PCR والجيل التالي من 16S rRNA التسلسل الجيني

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

A Step-by-Step Guide to Mosquito Electroantennography

دليل خطوة بخطوة لتخطيط كهربية البعوض

Female mosquitoes are the deadliest animals on earth, claiming the lives of more than 1 million people every year due to pathogens they transmit when ...

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

بروتوكولات تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمية لقطرات النسخ العكسي المكونة من خطوتين للكشف عن SARS-CoV-2 وقياسه

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...

A Step-By-Step Method to Detect Neutralizing Antibodies Against AAV using a Colorimetric Cell-Based Assay

طريقة خطوة بخطوة للكشف عن الأجسام المضادة المحايدة ضد AAV باستخدام فحص قائم على الخلايا اللونية

Recombinant adeno-associated viruses (rAAV) have proven to be a safe and successful vector for transferring genetic material to treat various health ...