Name: harvesting and disaggregation: an overlooked step in biofilm methods research
Uploaded: 2022-04-22T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Harvesting and Disaggregation: An Overlooked Step in Biofilm Methods Research at JoVE.com

Vi vil gerne anerkende Danielle Orr Goveia, Blaine Fritz, Jennifer Summers og Fei San Lee for deres bidrag til denne artikel.

1. Hvirvel og sonikering
<ol><li>Dyrk en moden P. aeruginosa ATCC 15442 biofilm dyrket i henhold til ASTM Standard E25622.</li>
	<li>Ved udgangen af vækstperioden på 48 timer skal du forberede dig på at behandle biofilmen og prøvekuponerne i henhold til ASTM-standard E28718
</li>
	<li>Aseptisk indsæt autoklavede stænkskærme i sterile 50 ml koniske rør ved hjælp af flammesteriliserede tang. Gentag for alle rør, der vil modtage behandling...

<ol>
	<li>Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+microbial+life+on+surfaces.">Biofilms: microbial life on surfaces.</a> Emerging Infectious Diseases. 8 (9), 881-890 (2002).</li><li>ASTM International. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ASTM+Standard+E2562,+2017,+Standard+Test+Method+for+Quantification+of+Pseudomonas+aeruginosa+Biofilm+Grown+with+High+Shear+and+Continuous+Flow+using+CDC+Biofilm+Reactor.">ASTM Standard E2562, 2017, Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown with High Shear and Continuous Flow using CDC Biofilm Reactor.</a> ASTM International. , (2017).</li><li>Azeredo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+review+on+biofilm+methods.">Critical review on biofilm methods.</a> Critical Reviews In Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).</li><li>Gomes, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+reactors+for+the+study+of+medical+biofilms:+a+review+of+the+principles+and+latest+modifications.">Standardized reactors for the study of medical biofilms: a review of the principles and latest modifications.</a> Critical Reviews in Biotechnology. 38 (5), 657-670 (2018).</li><li>Goeres, D. M., et al., Simoes, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+fabrication+of+biofilm+reactors.">Design and fabrication of biofilm reactors.</a> Recent Trends in Biofilm Sciences and Technology. , 71-88 (2020).</li><li>Goeres, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+growing+a+biofilm+under+low+shear+at+the+air-liquid+interface+using+the+drip+flow+biofilm+reactor.">A method for growing a biofilm under low shear at the air-liquid interface using the drip flow biofilm reactor.</a> Nature Protocols. 4 (5), 783-788 (2009).</li><li>ASTM International. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ASTM+Standard+E2871,+Standard+Test+Method+for+Determining+Disinfectant+Efficacy+Against+Biofilm+Grown+in+the+CDC+Biofilm+Reactor+Using+the+Single+Tube+Method.">ASTM Standard E2871, Standard Test Method for Determining Disinfectant Efficacy Against Biofilm Grown in the CDC Biofilm Reactor Using the Single Tube Method.</a> ASTM International. , (2019).</li><li>Goeres, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+Biofilm+Efficacy+Test:+The+Single+Tube+Method.">Validation of a Biofilm Efficacy Test: The Single Tube Method.</a> Journal of Microbiological Methods. , (2019).</li><li>The development and validation of a standard in vitro method to evaluate the efficacy of surface modified urinary catheters. Theses and Dissertations at Montana State University Available from: <a target="_blank" href="https://scholarworks.montana.edu/xmlui/handle/1/15149">https://scholarworks.montana.edu/xmlui/handle/1/15149</a> (2019)</li><li>Hamilton, M. A., Buckingham-Meyer, K., Goeres, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Checking+the+Validity+of+the+harvesting+and+Disaggregating+Steps+in+Laboratory+Tests+of+Surface+Disinfectants.">Checking the Validity of the harvesting and Disaggregating Steps in Laboratory Tests of Surface Disinfectants.</a> Journal of AOAC International. 92 (6), 1755-1762 (2009).</li><li>Conlon, B. P., Rowe, S. E., Lewis, K., Donelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persister+Cells+in+Biofilm+Associated+Infections.">Persister Cells in Biofilm Associated Infections.</a> Biofilm-based Healthcare-associated Infections. , (2015).</li><li>ASTM International. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ASTM+Standard+E2647,+Standard+Test+Method+for+Quantification+of+Pseudomonas+aeruginosa+Biofilm+Grown+Using+Drip+Flow+Biofilm+Reactor+with+Low+Shear+and+Continuous+Flow.">ASTM Standard E2647, Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown Using Drip Flow Biofilm Reactor with Low Shear and Continuous Flow.</a> ASTM International. , (2020).</li><li>Rosenberg, M., Azevedo, N., Ivask, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propidium+iodide+staining+underestimates+viability+of+adherent+bacterial+cells.">Propidium iodide staining underestimates viability of adherent bacterial cells.</a> Scientific Reports. , (2019).</li><li>Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Manuira-Weber, K., Ren, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+aspects+of+using+bacterial+cell+viability+assays+with+the+fluorophores+SYTO9+and+propidium+iodide.">Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide.</a> BMC Microbiology. , (2015).</li><li>Kobayashi, N., Bauer, T. W., Tuohy, M. J., Fujishiro, T., Procop, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+Ultrasonication+Improves+Detection+of+Biofilm-formative+Bacteria+Around+a+Metal+Implant.">Brief Ultrasonication Improves Detection of Biofilm-formative Bacteria Around a Metal Implant.</a> Clinical Orthopaedics and Related Research. 457, 210-213 (2007).</li><li>Lourenco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimum+information+about+a+biofilm+experiment+(MIABiE),+standards+for+reporting+experiments+and+data+on+sessile+microbial+communities+living+at+interfaces.">Minimum information about a biofilm experiment (MIABiE), standards for reporting experiments and data on sessile microbial communities living at interfaces.</a> Pathogens and Disease. , 1-7 (2014).</li><li>Nascentes, C. C., Korn, M., Sousa, C. S., Arruda, M. A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Ultrasonic+Baths+for+Analytical+Applications:+A+New+Approach+for+Optimisation+Conditions.">Use of Ultrasonic Baths for Analytical Applications: A New Approach for Optimisation Conditions.</a> Journal of Brazilian Chemical Society. 12 (1), 57-63 (2001).</li><li>Elma GmbH &amp; Co. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KG+TI-H+Ultrasonic+Cleaning+Units:+Operating+Instructions.">KG TI-H Ultrasonic Cleaning Units: Operating Instructions.</a> Elma GmbH &amp; Co. , (2009).</li><li>Stamper, D. M., Holm, E. R., Brizzolara, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+times+and+energy+densities+for+ultrasonic+disinfection+of+Escherichia+coli,+Pseudomonas+aeruginosa,+Enterococcus+avium+and+sewage.">Exposure times and energy densities for ultrasonic disinfection of Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus avium and sewage.</a> Journal of Environmental Engineering and Science. 7 (2), 139-146 (2008).</li><li>Suslick, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonochemistry.">Sonochemistry.</a> Science. 247 (4949), (1990).</li></ol>

Minimumsoplysninger for høst- og opdelingsmetoder For at skabe reproducerbare biofilmdata på tværs af det videnskabelige samfund er det bydende nødvendigt, at forfattere inkluderer så mange detaljer som muligt om hvert af vækst-, behandlings-, prøveudtagnings- og analysetrinnene i en biofilmmetode. Standardiseringen af biofilmmetoder har hjulpet i denne bestræbelse, da det giver forskeren mulighed for at henvise til en bestemt metode og eventuelle relevante ændringer. Imidlertid indeholder ma...

Definitionen af biofilm har udviklet sig i løbet af de sidste par årtier og omfatter mikrobiel tilknytning til en række biologiske og/eller ikke-biologiske overflader, herunder ikke-cellulære komponenter1, der viser forskellig vækst og genetisk ekspression2 inden for en matrix. Biofilm giver beskyttelse mod miljøbelastninger såsom tørring og kan gøre virkningen af kemiske desinfektionsmidler mindre effektiv, hvilket resulterer i mikrobernes overlevelse. De overlevende i en biofilm kan potentielt udgøre en kilde til patogene mikroorganismer, der er et folkesundhedsproblem3.
Biofilmmetoder består af fire trin, vækst, behandling, prøveudtagning (høst og opdeling) og analyse. Vækst, det første trin, hvor brugeren bestemmer organismens vækstbetingelser, temperatur, medier osv., Er det mest overvejede og rapporterede i biofilmlitteraturen4,5,6,7. Behandlingstrinnet evaluerer antimikrobielle stoffer (f.eks. desinfektionsmidler) for at bestemme deres virkning enten mod en moden biofilm3,8,9, eller det antimikrobielle stof kan inkorporeres i overfladen for at bestemme produktets evne til at forebygge eller reducere biofilmvækst10. Det tredje trin, prøveudtagning, omfatter trin til at høste biofilmen fra den overflade, hvorpå den voksede, og til at opdele de fjernede klumper3,8,11. Det fjerde trin, analysen, kan omfatte levedygtige celletal, mikroskopi, fluorescensmålinger, molekylære resultater og/eller en matrixkomponentvurdering8,9. Vurdering af data giver information om resultatet af et eksperiment. Af de fire er prøveudtagning ofte det mest oversete trin, fordi det forudsætter, at den valgte biofilmhøstnings- og/eller opdelingsteknik er 100 % effektiv, ofte uden verifikation11.
Planktoniske suspensioner af bakterier, der ofte anses for at være homogene, kræver simpel hvirvel før analyse. Biofilm er imidlertid komplekse samfund sammensat af mikroorganismer (prokaryote og / eller eukaryote), exopolysaccharider, proteiner, lipider, ekstracellulært DNA og værtsceller12. Der er behov for skridt ud over traditionelle planktoniske mikrobiologiske dyrkningsmetoder for i tilstrækkelig grad at høste biofilm fra en overflade og derefter opdele den i en homogen enkeltcellesuspension. En omfattende litteraturgennemgang (oplysninger, der ikke er medtaget i denne publikation) viste, at valget af fjernelses- og opdelingsteknik afhænger af en række faktorer, herunder arter, der er til stede i biofilmen, overflade, som biofilmen er fastgjort til (ikke-porøs eller porøs), tilgængelighed til vækstoverflader (let aftagelig kupon eller fysisk ødelæggelse af apparater, hvor biofilmen vokser), overfladegeometri (areal og form), tæthed af biofilm på vækstoverflader og tilgængeligt laboratorieudstyr.
Når biofilm høstes fra en overflade, er den resulterende cellesuspension heterogen. Hvis denne uensartede suspension skal opregnes nøjagtigt, skal den opdeles i individuelle celler. Levedygtige pladetællinger antager, at en kolonidannende enhed stammer fra en bakterie. Hvis der placeres aggregater af biofilm på vækstmediet, er det umuligt at skelne mellem individuelle celler, hvilket kan føre til unøjagtige skøn. For eksempel, under desinfektionsmiddeleffektivitetstest, hvis en behandling fjerner biofilm meget effektivt fra en overflade sammenlignet med kontrollen, kan logreduktionen forekomme kunstigt stor sammenlignet med kontrollen. På den anden side vil et kemisk desinfektionsmiddel, der fastgør biofilm på en overflade sammenlignet med kontrollen, synes at have en lavere logreduktion11. Denne type scenarie kan føre til forudindtaget fortolkning af eksperimentelle data.
Som forberedelse til offentliggørelsen fastslog en gennemgang af litteraturen, at fælles tilgange til høst og opdeling af biofilm omfatter skrabning, podning, sonikering, hvirvel eller en kombination af disse. Skrabning defineres som fysisk fjernelse af biofilm fra overflader med en steril pind, spatel eller andet værktøj. Swabbing refererer til fjernelse af biofilm fra overflader med en bomuldstippe eller andet fast absorberende materiale. Sonikering refererer til forstyrrelse af biofilm fra overflader via ultralydbølger fordelt gennem vand. Vortexing refererer til brugen af en mixer for at opnå en flydende hvirvel af prøven inde i et rør. Homogenisering bruger roterende knive til at forskyde høstede biofilmklumper i en enkeltcellesuspension. I denne artikel præsenterer vi tre høst- og opdelingsmetoder for to forskellige overfladetyper, hårde/ikke-porøse og porøse.
Der findes en liste over anbefalede minimumsoplysninger, som forskere bør medtage i publikationens metodeafsnit. Vi håber, at inddragelse af disse oplysninger gør det muligt for andre forskere at reproducere deres arbejde. Der er ingen perfekt høst- og opdelingsmetode, derfor gives der også anbefalinger til, hvordan man kontrollerer teknikken.
Tre almindelige metoder til høst og opdeling af biofilm fra almindelige vækstoverflader er demonstreret i denne artikel. Disse oplysninger vil gøre det muligt for forskere bedre at forstå den overordnede præcision og bias af en biofilm testmetode. Beskrevne metoder er som følger: (1) En Pseudomonas aeruginosa biofilm dyrket på polycarbonatkuponer (hård ikke-porøs overflade) under høj væskeforskydning i CDC Biofilm Reactor høstes og opdeles efter en femtrins kombination af hvirvel og sonikering for at opnå biofilmhøst og opdeling (2) A P. aeruginosa biofilm dyrket på borosilikatglaskuponer (hård ikke-porøs overflade) i drypstrømsreaktoren under lav væskeforskydning høstes og opdeles ved hjælp af skrabning og homogenisering (3) En Escherichia coli biofilm dyrket i silikonerør (porøs overflade) høstes og opdeles ved hjælp af skrabning efterfulgt af sonikering og hvirvel.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>50 mL conical vials</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL glass beakers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB102100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-12D</td>
			<td>For adding treatment to vials containing coupons.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL serological pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-14C</td>
			<td>For adding neutralizer to vials at the end of treatment contact time.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applicator sticks</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostats</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal spatula</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE policemen</td>
			<td>Saint-Gobain</td>
			<td>06369-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S 10 N - 10 G - ST Dispersing tool</td>
			<td>IKA</td>
			<td>4446700</td>
			<td>For homogenization of biofilm samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-951-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Foley catheter, size 16 French</td>
			<td>Medline Industries</td>
			<td>DYND11502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing, size 16</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW96400-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Splash Guards</td>
			<td>BioSurface Technologies, Inc.</td>
			<td>CBR 2232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T 10 basic ULTRA-TURRAX Disperser</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3737001</td>
			<td>For homogenization of biofilm samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing connectors</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW02023-86</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Elma</td>
			<td>TI-H15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2 Vertical 50 mL Tube Holder</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-V506</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

harvesting and disaggregation: an overlooked step in biofilm methods research

Biofilmmetoder består af fire forskellige trin: dyrkning af biofilmen i en relevant model, behandling af den modne biofilm, høst af biofilmen fra overfladen og opdeling af klumperne og analyse af prøven. Af de fire trin er høst og opdeling de mindst undersøgte, men ikke desto mindre kritiske, når man overvejer potentialet for testbias. Denne artikel viser almindeligt anvendte høst- og opdelingsteknikker til biofilm dyrket på tre forskellige overflader. De tre biofilm høst og opdeling teknikker, hentet fra en omfattende litteratur gennemgang, omfatter hvirvel og sonikering, skrabning og homogenisering, og skrabning, hvirvel og sonikering. To overfladetyper overvejes: hårdt ikke-porøst (polycarbonat og borosilikatglas) og porøst (silikone). Derudover giver vi anbefalinger til de minimumsoplysninger, der skal medtages, når den anvendte høstteknik rapporteres, og en ledsagende metode til at kontrollere for bias.

Validering/bekræftelse af en høstmetode Flere undersøgelser, der blev udført i vores laboratorium, undersøgte evnen til hvirvel og sonikering til effektivt at høste biofilm dyrket i biofilmreaktoren (ASTM E2562)2 ved hjælp af Single Tube Method (ASTM E2871)8.
En P. aeruginosa ATCC 15442 biofilm blev dyrket i henhold til ASTM E25622 på borosilikatglaskuponer. Efter 48 timer blev fire kup...

Watch this Scientific Journal Video about Harvesting and Disaggregation: An Overlooked Step in Biofilm Methods Research at JoVE.com

Harvesting and Disaggregation: An Overlooked Step in Biofilm Methods Research

Dette papir beskriver metoder, der demonstrerer tre almindelige biofilmhøstnings- og opdelingsteknikker på to overfladetyper, robusthedstest af en høstmetode og minimumsinformation, der skal overvejes, når man vælger og optimerer høst- og opdelingsteknikker for at øge reproducerbarheden.

Høst og opdeling: Et overset trin i forskning i biofilmmetoder

Biofilm methods consist of four distinct steps: growing the biofilm in a relevant model, treating the mature biofilm, harvesting the biofilm from the ...

Det overordnede mål med disse procedurer er at høste og opdele biofilm på den optimale måde for at øge reproducerbarheden. Tre teknikker vil blive demonstreret i denne video, der hver især fokuserer på høst og opdeling fra en anden overfladetype. Denne video vil demonstrere de rette teknikker til en, hvirvlende og sonikerende biofilm ud af en hård ikke-porøs overflade, såsom en polycarbonatkupon fra CDC-biofilmreaktoren.For det andet skrabningen og homogeniseringen af biofilmen ud af den hårde ikke-porøse borosilikatglasoverflade, der almindeligvis findes i drypstrømsreaktoren. Og tre, skrabning, hvirvel og sonikering af biofilm fra en porøs silikonerøroverflade, der almindeligvis findes i katetermodellen. Hej, jeg hedder Kelly Buckingham-Meyer her på Standardized Biofilm Methods Lab.I vores laboratorium opdeler vi biofilmmetoder i fire komponenter: vækst, behandling, prøveudtagning og analyse. I den peer-reviewed litteratur er detaljerne om, hvordan biofilm udtages prøver eller høstes og opdeles fra en overflade, typisk sparsomme. Dette er grunden til denne video.Da vores laboratorium udvikler og tester standardiserede biofilmmetoder, gennemførte vi en omfattende litteraturgennemgang, hvor de tre mest almindelige biofilmhøstnings- og opdelingsmetoder blev identificeret. Disse metoder er vortexing og sonikering biofilm fra en polycarbonat kupon, skrabe og homogeniserende biofilm fra en borosilikat glas kupon, og skrabning, hvirvel og sonikering biofilm fra silikone slanger. Mens metoder skrevet på papir er kraftfulde, håber vi, at videoen med de tekniske detaljer, der præsenteres af min kollega Lindsey Miller og jeg, vil være nyttig.Til at begynde med skal du dyrke moden Pseudomonas aeruginosa 15442 biofilm i henhold til ASTM-standarden E2562, standardtestmetoden til kvantificering af Pseudomonas aeruginosa Biofilm dyrket med høj forskydning og kontinuerlig strømning ved hjælp af CDC Biofilm Reactor. Ved udgangen af den 48-timers vækstperiode skal du forberede dig på at behandle og prøvekuponer i henhold til ASTM-standarden E2871, standardtestmetoden til bestemmelse af desinfektionsmiddeleffektivitet mod biofilm dyrket i CDC-biofilmreaktoren ved hjælp af enkeltrørsmetoden. Indsæt derefter aseptisk autoklavede stænkskærme i sterile 50 ml koniske rør ved hjælp af flammesteriliserede tang.Gentag for alle rør, der vil modtage behandling. Rør til kontrolkuponer behøver ikke en stænkskærm. Fjern aseptisk en stang fra CDC-biofilmreaktoren og skyl den i 30 ml sterilt fortyndingsvand.Dette vil fjerne de løst fastgjorte celler fra biofilmen. Hold stangen parallelt med bordpladen over prøverørene med stænkafskærmninger. Brug en flammesteriliseret unbrakonøgle til at løsne de indstillede skruer for at slippe en biofilmbelagt kupon i røret.Gentag for det ønskede antal kuponer. Fjern stænkafskærmningerne, og læg stænkafskærmningerne i en separat beholder til sterilisering. Ved hjælp af en serologisk pipette på fem milliliter pipetteres langsomt fire milliliter behandling eller kontrol i rørene, så væsken strømmer ned ad indersiden af rørets væg.Hvirvl forsigtigt bunden af røret, så eventuelle luftbobler under kuponen forskydes. Tillad 30 til 60 sekunder mellem hver tilføjelse. Ved afslutningen af den angivne kontakttid pipetter 36 ml neutralisator i rørene i samme rækkefølge, som behandlingen eller kontrollen blev påført.Vortex hvert rør på den højeste indstilling i 30 plus eller minus fem sekunder og sørg for, at der opnås en komplet hvirvel. Placer rør i rørstativet suspenderet i den afgassede sonikator, således at vandstanden i badet er lig med vandstanden i rørene. Sonikere prøverne ved 45 kilohertz, 100% effekt og normal funktion i 30 plus eller minus fem sekunder.Gentag hvirvel- og sonikeringscyklusserne og afslut med en endelig hvirvel i alt fem cyklusser. Til sidst fortyndes prøven serielt, fortyndes fortyndingen på R2A-agar og inkuberes pladerne i 24 timer ved 36 grader Celsius. Tæl kolonierne efter behov for pletteringsmetoden, og registrer dataene.Denne næste biofilmhøstnings- og opdelingsteknik er nyttig til hårde ikke-porøse kuponer, der er standarden i drypstrømsreaktoren. Dyrk en moden Pseudomonas aeruginosa 15442 biofilm i henhold til ASTM-standarden E2647 standardtestmetoden til kvantificering af Pseudomonas aeruginosa Biofilm dyrket ved hjælp af drypflowbiofilmreaktor med lav forskydning og kontinuerlig strømning. Opsæt prøveudtagningsstationen til at omfatte et prøvetagningskort, 95% ethanol i et bægerglas, en alkoholbrænder, hæmostater, et værktøj til fjernelse af kuponer, bægerglas med sterilt fortyndingsvand og fortyndingsrør til skylning af kuponerne.Sluk for pumpen, fjern kanaldækslet, og brug sterilt værktøj til fjernelse af kuponer og hæmostater til at fjerne kuponen, og pas på ikke at forstyrre biofilmen. Skyl kuponen ved forsigtigt at nedsænke med en væskebevægelse i 45 ml sterilt fortyndingsvand indeholdt i et 50 ml centrifugerør. Vend straks bevægelsen om for at fjerne kuponen.Anbring kuponen i et bægerglas, der indeholder 45 ml sterilt fortyndingsvand. Skrab den biofilmdækkede kuponoverflade i nedadgående retning i ca. 15 sekunder ved hjælp af en steril spatel eller skraber. Skyl spatlen eller skraberen ved at røre den i bægerglasset.Gentag skrabnings- og skylleprocessen tre til fire gange for at sikre fuld dækning af kuponoverfladen. Skyl kuponen ved at holde den i en 60 graders vinkel over det sterile bægerglas og pipettere en milliliter sterilt fortyndingsvand over kuponens overflade. Gentag for i alt fem skylninger.Det endelige volumen i bægerglasset er nu 50 ml. Arbejder i biosikkerhedsskabet, homogenisere den skrabede biofilmprøve. Fastgør en steril homogenisatorsonde til homogenisatoren.Placer sondespidsen i væsken, og tænd homogenisatoren og rampe op til 20.500 o / min. Homogeniser prøven i 30 sekunder. Skru ned for omdrejningstallet, og sluk for homogenisatoren.Rens sonden mellem biofilmprøver ved at homogenisere i ni milliliter steril fortyndingsemne ved 20.500 RPM i 30 sekunder som beskrevet ovenfor. Homogeniser et ni milliliter rør med 70% ethanol i 30 sekunder og fjern sonden og lad den stå i ethanolrøret i et minut. Homogeniser to yderligere fortyndingsemner.Der kan også anvendes en steril engangshomogenisatorsonde til hver prøve. Fortynd serielt den homogeniserede prøve, plade fortyndingerne på R2A ved hjælp af den passende pletteringsmetode, og inkuber pladerne i 24 timer ved 36 grader Celsius. Tæl kolonierne og registrer dataene.Denne endelige biofilmhøstnings- og opdelingsteknik er nyttig til biofilm dyrket i porøse slanger som silikoneslangen, der anvendes i katetermodellen. For at starte denne procedure skal du dyrke en moden E.coli 53498 biofilm i silikonekateterrør. Forbered prøveudtagningsmaterialerne: skyllede rør, et sterilt centrifugerør, en tom steril petriskål, flammesteriliseret hæmostater i rustfrit stål, saks, timer og en lineal.Når pumpen er sat på pause, skal du bruge 70% ethanol til at rengøre ydersiden af slangen. Mål to centimeter fra enden, undgå det område, der er fastgjort til stikket, og markér slangen for at bestemme skæreplaceringer. Skær slangen på to centimeter mærket med flammesteriliseret saks.Skyl slangesegmentet for at fjerne planktoniske celler. Med flammesteriliserede tang nedsænkes forsigtigt slangesegmentet i 20 ml sterilt fortyndingsvand og fjernes derefter straks. Placer segmentet i 10 ml neutralisator.Med flammesteriliserede tang skal du holde slangesegmentet og skrabe med en steril træapplikatorpind, indtil alle indvendige områder af slangen er skrabet. Skyl lejlighedsvis pinden i de 10 ml neutralisator, og anbring segmentet tilbage i prøverøret. Det skrabede slangesegment er nu 10 til nul eller nul fortynding.Vortex hvert rør på den højeste indstilling i 30 plus eller minus fem sekunder. Placer rørene i rørstativet suspenderet i sonikatorbadet, således at vandstanden i badet er lig med væskeniveauet i rørene. Sonikat ved 45 kilohertz, 100% effekt og normal funktion i 30 plus eller minus fem sekunder.Gentag denne hvirvel- og sonikeringscyklus, og afslut derefter med den endelige hvirvel. Fortynd prøverne serielt i bufferet vand. Plade på tryptisk sojaar ved hjælp af den passende pletteringsmetode og derefter inkubere rørene ved 36 plus eller minus to grader Celsius i 24 timer.Tæl kolonierne efter behov i forhold til den anvendte belægningsmetode, og registrer dataene for at beregne det aritmetiske gennemsnit. Disse fire billeder taget af Danielle Or og Blaine Fritz er alle med til at illustrere vigtigheden af denne høst- og opdelingsprocedure. Alle fire af disse kuponer blev farvet med krystalviolet for at hjælpe med at visualisere mængden af Pseudomonas aeruginosa biofilm til stede på kuponerne før og efter hvirvel- og sonikeringsprocessen.Kupon A er helt dækket af biofilm, mens kuponer B, C og D alle har væsentligt mindre biofilm på deres overflade. Kuponer B, C og D blev alle udsat for hvirvel- og sonikeringsprocessen beskrevet tidligere. Disse to billeder taget af Lindsey Miller på et konfokalmikroskop ved 12,5X forstørrelse viser en Pseudomonas aeruginosa biofilm, der blev behandlet med baggrundslyset levende / død plet.Billedet til venstre blev sonikeret ved 45 kilohertz og 10% effekt, mens billedet til højre blev sonikeret ved 45 kilohertz og 100% effekt. Det er klart, at kuponen til venstre har meget mere biofilm tilbage på overfladen sammenlignet med kuponen til højre. Denne endelige figur viser, hvordan manipulationen af forskellige sonikeringsparametre påvirker mængden af Pseudomonas aeruginosa biofilm fjernet fra kuponoverfladen.Alle disse kuponer blev sonikeret ved 45 kilohertz, 100% effekt og ved normal indstilling i 30 plus eller minus fem sekunder. Disse billeder blev taget ved 12,5X forstørrelse af Lindsey Miller. Kuponer i række et blev sonikeret i fortyndingsvand, mens kuponerne i række to blev sonikeret i DE-neutraliserende bouillon.Det ser ud til, at der er mindre biofilm tilbage på kuponerne, der blev sonikeret i DE bouillon, som indeholder et overfladeaktivt stof sammenlignet med fortyndingsvandet. Kuponer A, B, E og F blev alle sonikeret i et volumen på 10 milliliter, mens kuponer C, D, G og H blev sonikeret i 40 ml opløsning. Der er klart mindre biofilm på kuponerne, der blev sonikeret i de mindre mængder.Kuponer A, C, E og G blev sonikeret i badet med tre rør på én gang, mens kuponer B, D, F og H blev sonikeret i et bad med 12 rør på én gang. Det ser ud til, at prøverne sonikeret med færre rør udviste overlegen biofilm høst. I sidste ende minimerer volumenet i rørene, reducerer antallet af rør, der sonikeres på én gang, og brug af DE neutraliserende bouillon synes alle at bidrage til forbedret biofilmhøstning.Der er ingen perfekt metode til at høste og opdele biofilmen, men nogle tilgange er bedre til forskellige overflader og / eller applikationer. De teknikker, der demonstreres i denne video, er de tre mest almindelige metoder ifølge en litteraturgennemgang. Disse tre teknikker kan danne udgangspunkt for forskere.Det er vigtigt at tage sig tid til at validere den valgte høst- og opdelingsmetode. Alt udstyr er lidt anderledes, så selvom metoden er blevet standardiseret, er det stadig klogt at bekræfte processen for det anvendte udstyr. Forskning har vist, at forkerte valg kan føre til forudindtagede testresultater.Efter at have set denne video vil disse oplysninger forhåbentlig hjælpe forskere med at træffe mere informerede beslutninger om, hvilken metode der skal bruges, og give vejledning om forbedring af reproducerbarheden for de tre overfladetyper og gratis høst- og opdelingsteknikker.

Research

JoVE Journal

Biology

Harvesting Sperm and Artificial Insemination of Mice

Rodents of the genus Peromyscus (deer mice) are the most prevalent native North American mammals.  Peromyscus species are used in a wide range of research ...

A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles

En trin-for-trin metode til at rekonstituere en ABC Transporter ind i Nanodisc lipidpartikler

The nanodisc is a discoidal particle (~ 10-12 nm large) that trap membrane proteins into a small patch of phospholipid bilayer. The nanodisc is a ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Grundlæggende<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Metoder: Synkronisering og Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

In vitro Rekonstituering af lys-høst komplekser af planter og grønne alger

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls ...

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

Effektiv pattedyrscelleekspression og Single-trins Oprensning af ekstracellulært glycoproteiner til krystallisation

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...

An In Vitro Model to Study the Effect of 5-Aminolevulinic Acid-mediated Photodynamic Therapy on Staphylococcus aureus Biofilm

An In Vitro Model to Study the Effect of 5-Aminolevulinic Acid-mediated Photodynamic Therapy on Staphylococcus aureus Biofilm

En In Vitro Model til at studere effekten af 5-aminolaevulinsyre-medieret Fotodynamisk terapi på Staphylococcus aureus Biofilm

Staphylococcus aureus (S. aureus) is a common human pathogen, which causes pyogenic and systemic infections. S. aureus infections are difficult to ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

Mikrobiota-analyse ved hjælp af to-trins PCR og næste generations 16S rRNA-Gensekvensering

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

A Step-by-Step Guide to Mosquito Electroantennography

En trin-for-trin guide til myg elektroantennografi

Female mosquitoes are the deadliest animals on earth, claiming the lives of more than 1 million people every year due to pathogens they transmit when ...

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

To-trins omvendt transkriptionsdråbe digitale PCR-protokoller til SARS-CoV-2-detektion og kvantificering

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...

A Step-By-Step Method to Detect Neutralizing Antibodies Against AAV using a Colorimetric Cell-Based Assay

En trinvis metode til at detektere neutraliserende antistoffer mod AAV ved hjælp af et kolorimetrisk cellebaseret assay

Recombinant adeno-associated viruses (rAAV) have proven to be a safe and successful vector for transferring genetic material to treat various health ...