Name: harvesting and disaggregation: an overlooked step in biofilm methods research
Uploaded: 2022-04-22T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Harvesting and Disaggregation: An Overlooked Step in Biofilm Methods Research at JoVE.com

We willen Danielle Orr Goveia, Blaine Fritz, Jennifer Summers en Fei San Lee bedanken voor hun bijdragen aan deze krant.

1. Vortexing en ultrasoonapparaat
<ol><li>Kweek een volwassen P. aeruginosa ATCC 15442 biofilm gekweekt volgens ASTM Standaard E25622.</li>
	<li>Bereid je aan het einde van de groeiperiode van 48 uur voor op de behandeling van de biofilm en monstercoupons volgens ASTM Standard E28718
</li>
	<li>Plaats aseptisch geautoclaveerde spatschermen in steriele conische buizen van 50 ml met behulp van een vlamsteriliseerde tang. Herhaal dit voor alle buize...

<ol>
	<li>Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+microbial+life+on+surfaces.">Biofilms: microbial life on surfaces.</a> Emerging Infectious Diseases. 8 (9), 881-890 (2002).</li><li>ASTM International. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ASTM+Standard+E2562,+2017,+Standard+Test+Method+for+Quantification+of+Pseudomonas+aeruginosa+Biofilm+Grown+with+High+Shear+and+Continuous+Flow+using+CDC+Biofilm+Reactor.">ASTM Standard E2562, 2017, Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown with High Shear and Continuous Flow using CDC Biofilm Reactor.</a> ASTM International. , (2017).</li><li>Azeredo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+review+on+biofilm+methods.">Critical review on biofilm methods.</a> Critical Reviews In Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).</li><li>Gomes, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+reactors+for+the+study+of+medical+biofilms:+a+review+of+the+principles+and+latest+modifications.">Standardized reactors for the study of medical biofilms: a review of the principles and latest modifications.</a> Critical Reviews in Biotechnology. 38 (5), 657-670 (2018).</li><li>Goeres, D. M., et al., Simoes, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+fabrication+of+biofilm+reactors.">Design and fabrication of biofilm reactors.</a> Recent Trends in Biofilm Sciences and Technology. , 71-88 (2020).</li><li>Goeres, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+growing+a+biofilm+under+low+shear+at+the+air-liquid+interface+using+the+drip+flow+biofilm+reactor.">A method for growing a biofilm under low shear at the air-liquid interface using the drip flow biofilm reactor.</a> Nature Protocols. 4 (5), 783-788 (2009).</li><li>ASTM International. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ASTM+Standard+E2871,+Standard+Test+Method+for+Determining+Disinfectant+Efficacy+Against+Biofilm+Grown+in+the+CDC+Biofilm+Reactor+Using+the+Single+Tube+Method.">ASTM Standard E2871, Standard Test Method for Determining Disinfectant Efficacy Against Biofilm Grown in the CDC Biofilm Reactor Using the Single Tube Method.</a> ASTM International. , (2019).</li><li>Goeres, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+Biofilm+Efficacy+Test:+The+Single+Tube+Method.">Validation of a Biofilm Efficacy Test: The Single Tube Method.</a> Journal of Microbiological Methods. , (2019).</li><li>The development and validation of a standard in vitro method to evaluate the efficacy of surface modified urinary catheters. Theses and Dissertations at Montana State University Available from: <a target="_blank" href="https://scholarworks.montana.edu/xmlui/handle/1/15149">https://scholarworks.montana.edu/xmlui/handle/1/15149</a> (2019)</li><li>Hamilton, M. A., Buckingham-Meyer, K., Goeres, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Checking+the+Validity+of+the+harvesting+and+Disaggregating+Steps+in+Laboratory+Tests+of+Surface+Disinfectants.">Checking the Validity of the harvesting and Disaggregating Steps in Laboratory Tests of Surface Disinfectants.</a> Journal of AOAC International. 92 (6), 1755-1762 (2009).</li><li>Conlon, B. P., Rowe, S. E., Lewis, K., Donelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persister+Cells+in+Biofilm+Associated+Infections.">Persister Cells in Biofilm Associated Infections.</a> Biofilm-based Healthcare-associated Infections. , (2015).</li><li>ASTM International. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ASTM+Standard+E2647,+Standard+Test+Method+for+Quantification+of+Pseudomonas+aeruginosa+Biofilm+Grown+Using+Drip+Flow+Biofilm+Reactor+with+Low+Shear+and+Continuous+Flow.">ASTM Standard E2647, Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown Using Drip Flow Biofilm Reactor with Low Shear and Continuous Flow.</a> ASTM International. , (2020).</li><li>Rosenberg, M., Azevedo, N., Ivask, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propidium+iodide+staining+underestimates+viability+of+adherent+bacterial+cells.">Propidium iodide staining underestimates viability of adherent bacterial cells.</a> Scientific Reports. , (2019).</li><li>Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Manuira-Weber, K., Ren, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+aspects+of+using+bacterial+cell+viability+assays+with+the+fluorophores+SYTO9+and+propidium+iodide.">Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide.</a> BMC Microbiology. , (2015).</li><li>Kobayashi, N., Bauer, T. W., Tuohy, M. J., Fujishiro, T., Procop, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+Ultrasonication+Improves+Detection+of+Biofilm-formative+Bacteria+Around+a+Metal+Implant.">Brief Ultrasonication Improves Detection of Biofilm-formative Bacteria Around a Metal Implant.</a> Clinical Orthopaedics and Related Research. 457, 210-213 (2007).</li><li>Lourenco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimum+information+about+a+biofilm+experiment+(MIABiE),+standards+for+reporting+experiments+and+data+on+sessile+microbial+communities+living+at+interfaces.">Minimum information about a biofilm experiment (MIABiE), standards for reporting experiments and data on sessile microbial communities living at interfaces.</a> Pathogens and Disease. , 1-7 (2014).</li><li>Nascentes, C. C., Korn, M., Sousa, C. S., Arruda, M. A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Ultrasonic+Baths+for+Analytical+Applications:+A+New+Approach+for+Optimisation+Conditions.">Use of Ultrasonic Baths for Analytical Applications: A New Approach for Optimisation Conditions.</a> Journal of Brazilian Chemical Society. 12 (1), 57-63 (2001).</li><li>Elma GmbH &amp; Co. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KG+TI-H+Ultrasonic+Cleaning+Units:+Operating+Instructions.">KG TI-H Ultrasonic Cleaning Units: Operating Instructions.</a> Elma GmbH &amp; Co. , (2009).</li><li>Stamper, D. M., Holm, E. R., Brizzolara, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+times+and+energy+densities+for+ultrasonic+disinfection+of+Escherichia+coli,+Pseudomonas+aeruginosa,+Enterococcus+avium+and+sewage.">Exposure times and energy densities for ultrasonic disinfection of Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus avium and sewage.</a> Journal of Environmental Engineering and Science. 7 (2), 139-146 (2008).</li><li>Suslick, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonochemistry.">Sonochemistry.</a> Science. 247 (4949), (1990).</li></ol>

Minimale informatie voor oogst- en desaggregatiemethoden Om reproduceerbare biofilmgegevens in de wetenschappelijke gemeenschap te creëren, is het noodzakelijk dat auteurs zoveel mogelijk details opnemen over elk van de groei-, behandelings-, bemonsterings- en analysestappen van een biofilmmethode. De standaardisatie van biofilmmethoden heeft geholpen bij dit streven, omdat het de onderzoeker in staat stelt om naar een specifieke methode en eventuele relevante wijzigingen te verwijzen. Veel artikelen...

De definitie van biofilm is de afgelopen decennia geëvolueerd en omvat microbiële associatie met een verscheidenheid aan biologische en / of niet-biologische oppervlakken, inclusief niet-cellulaire componenten1 die verschillende groei en genetische expressie vertonen2 binnen een matrix. Biofilm biedt bescherming tegen omgevingsstress zoals drogen en kan de werking van chemische desinfectiemiddelen minder effectief maken, wat resulteert in het overleven van microben. De overlevenden in een biofilm kunnen mogelijk een bron van pathogene micro-organismen vormen die een probleem voor de volksgezondheid zijn3.
Biofilmmethoden bestaan uit vier stappen, groei, behandeling, bemonstering (oogsten en uitsplitsen) en analyse. Groei, de eerste stap, waarbij de gebruiker de groeiomstandigheden van het organisme, temperatuur, media, enz. bepaalt, is de meest overwogen en gerapporteerde in de biofilmliteratuur4,5,6,7. De behandelingsstap evalueert antimicrobiële stoffen (bijv. ontsmettingsmiddelen) om hun werkzaamheid te bepalen, hetzij tegen een volwassen biofilm3,8,9, hetzij de antimicrobiële stof kan in het oppervlak worden opgenomen om het vermogen van het product om biofilmgroei te voorkomen of te verminderen te bepalen10. De derde stap, bemonstering, omvat stappen om de biofilm te oogsten van het oppervlak waarop deze groeide en om de verwijderde klonten uit te splitsen3,8,11. De vierde stap, analyse, kan levensvatbare celtellingen, microscopie, fluorescentiemetingen, moleculaire uitkomsten en/of een matrixcomponentbeoordeling8,9 omvatten. Beoordeling van gegevens geeft informatie over de uitkomst van een experiment. Van de vier is bemonstering vaak de meest over het hoofd geziene stap omdat het veronderstelt dat de gekozen biofilmoogst- en / of desaggregatietechniek 100% effectief is, vaak zonder verificatie11.
Planktonische suspensies van bacteriën, vaak beschouwd als homogeen, vereisen eenvoudige vortexing voorafgaand aan de analyse. Biofilms zijn echter complexe gemeenschappen die bestaan uit micro-organismen (prokaryote en/of eukaryote), exopolysacchariden, eiwitten, lipiden, extracellulair DNA en gastheercellen12. Stappen verder dan traditionele planktonische microbiologische kweekmethoden zijn nodig om biofilm adequaat van een oppervlak te oogsten en vervolgens uit te splitsen in een homogene eencellige suspensie. Een uitgebreid literatuuronderzoek (informatie die niet in deze publicatie is opgenomen) toonde aan dat de keuze van de verwijderings- en desaggregatietechniek afhankelijk is van een aantal factoren, waaronder soorten die aanwezig zijn in de biofilm, oppervlak waaraan de biofilm is bevestigd (niet-poreus of poreus), toegankelijkheid tot groeioppervlakken (gemakkelijk verwijderbare coupon of fysieke vernietiging van apparaten waarin de biofilm groeit), oppervlaktegeometrie (oppervlakte en vorm), dichtheid van biofilm op groeioppervlakken en beschikbare laboratoriumapparatuur.
Wanneer biofilm van een oppervlak wordt geoogst, is de resulterende celsuspensie heterogeen. Om deze niet-uniforme suspensie nauwkeurig te kunnen opsommen, moet deze worden opgesplitst in individuele cellen. Levensvatbare plaattellingen gaan ervan uit dat een kolonievormende eenheid afkomstig is van één bacterie. Als aggregaten van biofilm op het groeimedium worden geplaatst, is het onmogelijk om individuele cellen te onderscheiden, wat tot onnauwkeurige schattingen kan leiden. Bijvoorbeeld, tijdens het testen van de werkzaamheid van desinfectiemiddelen, als een behandeling biofilm zeer effectief van een oppervlak verwijdert in vergelijking met de controle, kan de logreductie kunstmatig groot lijken in vergelijking met de controle. Aan de andere kant zal een chemisch ontsmettingsmiddel dat biofilm op een oppervlak fixeert in vergelijking met de controle een lagere logreductie lijken te hebben11. Dit type scenario kan leiden tot een bevooroordeelde interpretatie van experimentele gegevens.
Ter voorbereiding op de publicatie heeft een literatuuroverzicht vastgesteld dat veel voorkomende benaderingen voor het oogsten en uitsplitsen van biofilm schrapen, swabben, ultrasoonapparaat, vortexing of een combinatie hiervan omvatten. Schrapen wordt gedefinieerd als fysieke verwijdering van biofilm van oppervlakken met een steriele stok, spatel of ander gereedschap. Swabbing verwijst naar het verwijderen van biofilm van oppervlakken met een wattenstokje of ander vast absorberend materiaal. Sonicatie verwijst naar verstoring van biofilm van oppervlakken via ultrasone golven die door water worden verspreid. Vortexing verwijst naar het gebruik van een mixer om een vloeibare vortex van het monster in een buis te bereiken. Homogenisatie maakt gebruik van roterende messen om geoogste biofilmklonten in een eencellige suspensie te scheren. In dit artikel presenteren we drie oogst- en desaggregatiemethoden voor twee verschillende oppervlaktetypen, hard/niet-poreus en poreus.
Er wordt een lijst met aanbevolen minimuminformatie verstrekt die onderzoekers moeten opnemen in de secties methoden van publicaties. We hopen dat het opnemen van deze informatie andere onderzoekers in staat stelt hun werk te reproduceren. Er is geen perfecte oogst- en uitsplitsingsmethode, daarom worden er ook aanbevelingen gegeven voor het controleren van de techniek.
Drie veelgebruikte methoden om biofilm van gemeenschappelijke groeioppervlakken te oogsten en af te splitsen, worden in dit artikel gedemonstreerd. Deze informatie zal onderzoekers in staat stellen om de algehele precisie en vooringenomenheid van een biofilmtestmethode beter te begrijpen. Beschreven methoden zijn als volgt: (1) Een Pseudomonas aeruginosa biofilm gekweekt op polycarbonaatcoupons (hard niet-poreus oppervlak) onder hoge vloeistofafschuiving in de CDC Biofilm Reactor wordt geoogst en uitgesplitst na een vijfstappencombinatie van vortexing en ultrasoonapparaat om biofilmoogst en -desaggregatie te bereiken (2) A P. aeruginosa biofilm gekweekt op borosilicaatglascoupons (hard niet-poreus oppervlak) in de druppelstroomreactor onder lage vloeistofafschuiving wordt geoogst en uitgesplitst met behulp van schrapen en homogenisatie (3) Een Escherichia coli-biofilm gekweekt in siliconenbuizen (poreus oppervlak) wordt geoogst en uitgesplitst met behulp van schrapen, gevolgd door ultrasoonapparaat en vortexing.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>50 mL conical vials</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL glass beakers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB102100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-12D</td>
			<td>For adding treatment to vials containing coupons.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL serological pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-14C</td>
			<td>For adding neutralizer to vials at the end of treatment contact time.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applicator sticks</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostats</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal spatula</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE policemen</td>
			<td>Saint-Gobain</td>
			<td>06369-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S 10 N - 10 G - ST Dispersing tool</td>
			<td>IKA</td>
			<td>4446700</td>
			<td>For homogenization of biofilm samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-951-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Foley catheter, size 16 French</td>
			<td>Medline Industries</td>
			<td>DYND11502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing, size 16</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW96400-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Splash Guards</td>
			<td>BioSurface Technologies, Inc.</td>
			<td>CBR 2232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T 10 basic ULTRA-TURRAX Disperser</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3737001</td>
			<td>For homogenization of biofilm samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing connectors</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW02023-86</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Elma</td>
			<td>TI-H15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2 Vertical 50 mL Tube Holder</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-V506</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

harvesting and disaggregation: an overlooked step in biofilm methods research

Biofilmmethoden bestaan uit vier verschillende stappen: het kweken van de biofilm in een relevant model, het behandelen van de volwassen biofilm, het oogsten van de biofilm van het oppervlak en het uitsplitsen van de klonten en het analyseren van het monster. Van de vier stappen zijn oogsten en uitsplitsen het minst bestudeerd, maar niettemin kritisch bij het overwegen van het potentieel voor testbias. Dit artikel demonstreert veelgebruikte oogst- en desaggregatietechnieken voor biofilm die op drie verschillende oppervlakken wordt gekweekt. De drie biofilmoogst- en desaggregatietechnieken, verzameld uit een uitgebreid literatuuronderzoek, omvatten vortexing en ultrasoonapparaat, schrapen en homogeniseren, en schrapen, vortexen en ultrasoonapparaat. Twee oppervlaktetypen worden overwogen: hard niet-poreus (polycarbonaat en borosilicaatglas) en poreus (siliconen). Daarnaast geven we aanbevelingen voor de minimale informatie die moet worden opgenomen bij het rapporteren van de gevolgde oogsttechniek en een bijbehorende methode om te controleren op vertekening.

Validatie/bevestiging van een oogstmethode Verschillende studies die in ons laboratorium werden uitgevoerd, onderzochten het vermogen van vortexing en ultrasoonapparaat om biofilm gekweekt in de biofilmreactor (ASTM E2562)2 effectief te oogsten met behulp van de Single Tube Method (ASTM E2871)8.
Een P. aeruginosa ATCC 15442 biofilm werd gekweekt volgens ASTM E25622 op borosilicaatglascoupons. N...

Watch this Scientific Journal Video about Harvesting and Disaggregation: An Overlooked Step in Biofilm Methods Research at JoVE.com

Harvesting and Disaggregation: An Overlooked Step in Biofilm Methods Research

Dit artikel beschrijft methoden die drie gangbare biofilmoogst- en desaggregatietechnieken op twee oppervlaktetypen demonstreren, robuustheidstests van een oogstmethode en minimale informatie om te overwegen bij het kiezen en optimaliseren van oogst- en desaggregatietechnieken om de reproduceerbaarheid te vergroten.

Oogsten en uitsplitsen: een over het hoofd geziene stap in onderzoek naar biofilmmethoden

Biofilm methods consist of four distinct steps: growing the biofilm in a relevant model, treating the mature biofilm, harvesting the biofilm from the ...

Het algemene doel van deze procedures is om biofilms op de optimale manier te oogsten en uit te splitsen om de reproduceerbaarheid te vergroten. In deze video worden drie technieken gedemonstreerd, elk gericht op het oogsten en uitsplitsen van een ander oppervlaktetype. Deze video demonstreert de juiste technieken voor één, vortexing en sonicerende biofilm van een hard niet-poreus oppervlak, zoals een polycarbonaatcoupon van de CDC-biofilmreactor.Twee, het schrapen en homogeniseren van de biofilm van het harde niet-poreuze borosilicaatglasoppervlak dat vaak wordt aangetroffen in de druppelstroomreactor. En drie, het schrapen, vortexen en soniceren van biofilm van een poreus siliconen slangoppervlak dat vaak wordt aangetroffen in het kathetermodel. Hallo, mijn naam is Kelly Buckingham-Meyer hier bij het Standardized Biofilm Methods Lab.In ons lab splitsen we biofilmmethoden op in vier componenten: groei, behandeling, bemonstering en analyse. In de peer-reviewed literatuur zijn details over hoe biofilms worden bemonsterd of geoogst en uitgesplitst van een oppervlak meestal schaars. Dit is de reden voor deze video.Omdat ons laboratorium gestandaardiseerde biofilmmethoden ontwikkelt en test, hebben we een uitgebreid literatuuronderzoek uitgevoerd waarin de drie meest voorkomende methoden voor het oogsten en uitsplitsen van biofilms werden geïdentificeerd. Die methoden zijn vortexing en sonicating biofilm van een polycarbonaatcoupon, schrapen en homogeniseren van biofilm van een borosilicaatglascoupon en schrapen, vortexen en soniceren van biofilm uit siliconenbuizen. Hoewel methoden op papier krachtig zijn, hopen we dat de video met de technische details gepresenteerd door mijn collega Lindsey Miller en ik nuttig zal zijn.Om te beginnen, kweek volwassen Pseudomonas aeruginosa 15442 biofilm volgens de ASTM-standaard E2562, de standaardtestmethode voor kwantificering van Pseudomonas aeruginosa Biofilm gekweekt met hoge afschuiving en continue stroom met behulp van de CDC Biofilm Reactor. Bereid je aan het einde van de groeiperiode van 48 uur voor op het behandelen en bemonsteren van coupons volgens de ASTM-standaard E2871, de standaardtestmethode voor het bepalen van desinfecterende werkzaamheid tegen biofilm gekweekt in de CDC-biofilmreactor met behulp van de single tube-methode. Plaats vervolgens aseptisch geautoclaveerde spatschermen in steriele conische buizen van 50 milliliter met behulp van een vlamgesteriliseerde tang.Herhaal dit voor alle buizen die een behandeling krijgen. Buizen voor bedieningscoupons hebben geen spatscherm nodig. Verwijder aseptisch een staaf uit de CDC-biofilmreactor en spoel deze in 30 milliliter steriel verdunningswater.Dit zal de losjes gehechte cellen uit de biofilm verwijderen. Houd de staaf evenwijdig aan het tafelblad over de monsterbuizen met spatschermen. Gebruik een vlamgesteriliseerde inbussleutel om de stelschroeven los te draaien om een met biofilm gecoate coupon in de buis te laten vallen.Herhaal dit voor het gewenste aantal kortingsbonnen. Verwijder de spatschermen en plaats de spatschermen in een aparte container voor sterilisatie. Pipetteer met behulp van een serologische pipet van vijf milliliter langzaam vier milliliter behandeling of controle in de buizen, zodat de vloeistof langs de binnenkant van de wand van de buis stroomt.Draai voorzichtig de onderkant van de buis zodat eventuele luchtbellen onder de coupon worden verplaatst. Houd rekening met 30 tot 60 seconden tussen elke toevoeging. Pipetteer aan het einde van de opgegeven contacttijd 36 milliliter neutralisator in de buizen in dezelfde volgorde als waarin de behandeling of controle werd toegepast.Vortex elke buis op de hoogste stand gedurende 30 plus of min vijf seconden en zorg ervoor dat een volledige vortex wordt bereikt. Plaats buizen in het buizenrek dat in de ontgaste sonicator is opgehangen, zodat het waterniveau in het bad gelijk is aan het waterniveau in de buizen. Soniceer de monsters met 45 kilohertz, 100% vermogen en normale functie gedurende 30 plus of min vijf seconden.Herhaal de vortex- en ultrasoonapparaatcycli en eindig met een laatste vortex, voor een totaal van vijf cycli. Verdun ten slotte het monster serieel, plaats de verdunning op R2A-agar en incubeer de platen gedurende 24 uur bij 36 graden Celsius. Tel de kolonies zoals geschikt voor de beplatingsmethode en noteer de gegevens.Deze volgende biofilmoogst- en desaggregatietechniek is nuttig voor harde niet-poreuze coupons die de standaard zijn in de druppelstroomreactor. Kweek een volwassen Pseudomonas aeruginosa 15442 biofilm volgens de ASTM-standaard E2647 de standaard testmethode voor kwantificering van Pseudomonas aeruginosa Biofilm gekweekt met behulp van drip flow biofilm reactor met lage schuif en continue stroom. Stel het bemonsteringsstation in met een bemonsteringsbord, 95% ethanol in een bekerglas, een alcoholbrander, hemostaten, een gereedschap voor het verwijderen van coupons, bekers met steriel verdunningswater en verdunningsbuizen voor het spoelen van de coupons.Schakel de pomp uit, verwijder de kanaalafdekking en gebruik steriele couponverwijderingstool en hemostaten om de coupon te verwijderen, waarbij u voorzichtig bent om de biofilm niet te verstoren. Spoel de coupon door voorzichtig met een vloeistofbeweging onder te dompelen in 45 milliliter steriel verdunningswater in een centrifugebuis van 50 milliliter. Draai de motie om de coupon te verwijderen onmiddellijk terug.Plaats de coupon in een bekerglas met 45 milliliter steriel verdunningswater. Schraap het met biofilm bedekte couponoppervlak gedurende ongeveer 15 seconden in neerwaartse richting met behulp van een steriele spatel of schraper. Spoel de spatel of schraper af door deze in het bekerglas te roeren.Herhaal het schraap- en spoelproces drie tot vier keer en zorg voor volledige dekking van het couponoppervlak. Spoel de coupon af door deze in een hoek van 60 graden boven het steriele bekerglas te houden en een milliliter steriel verdunningswater over het oppervlak van de coupon te pipetteren. Herhaal dit voor een totaal van vijf spoelingen.Het uiteindelijke volume in het bekerglas is nu 50 milliliter. Werk in de bioveiligheidskast en homogeniseer het geschraapte biofilmmonster. Bevestig een steriele homogenisatorsonde aan de homogenisator.Plaats de sondepunt in de vloeistof en zet de homogenisator aan en voer op tot 20.500 RPM. Homogeniseer het monster gedurende 30 seconden. Zet het toerental lager en schakel de homogenisator uit.Ontsmet de sonde tussen biofilmmonsters door te homogeniseren in negen milliliter steriele verdunning blanco bij 20, 500 RPM gedurende 30 seconden zoals hierboven beschreven. Homogeniseer een buis van negen milliliter van 70% ethanol gedurende 30 seconden en maak de sonde los en laat deze één minuut in de ethanolbuis staan. Homogeniseer twee extra verdunningslekken.Ook kan voor elk monster een steriele wegwerphomogenisatorsonde worden gebruikt. Verdun het gehomogeniseerde monster serieel, plaats de verdunningen op R2A met behulp van de juiste beplatingsmethode en incubeer de platen gedurende 24 uur bij 36 graden Celsius. Tel de kolonies en noteer de gegevens.Deze laatste biofilmoogst- en desaggregatietechniek is nuttig voor biofilm die in poreuze slangen wordt gekweekt, zoals de siliconenslang die in het kathetermodel wordt gebruikt. Om deze procedure te starten, kweekt u een volwassen E.coli 53498 biofilm in siliconenkatheterbuizen. Bereid de bemonsteringsmaterialen voor: gespoelde buizen, een steriele centrifugebuis, een lege steriele petrischaal, vlamsteriliseerde roestvrijstalen hemostaten, een schaar, een timer en een liniaal.Gebruik, terwijl de pomp is gepauzeerd, 70% ethanol om de buitenkant van de slang te reinigen. Meet twee centimeter van het uiteinde, vermijd het gebied dat aan de connector is bevestigd en markeer buizen om snijlocaties te bepalen. Knip met een vlamsteriliseerde schaar de slang op de markering van twee centimeter.Spoel het slangsegment af om planktoncellen te verwijderen. Met vlamsteriliseerde tang dompelt u het slangsegment voorzichtig onder in 20 milliliter steriel verdunningswater en verwijdert u het onmiddellijk. Plaats het segment in 10 milliliter neutralisator.Houd met een vlamsteriliseerde tang het slangsegment vast en schraap met een steriele houten applicatorstok totdat alle binnenste delen van de buis zijn geschraapt. Spoel de stok af en toe in de 10 milliliter neutralisator en plaats het segment terug in de monsterbuis. Het geschraapte buizensegment is nu de 10 tot de nul of de nulverdunning.Vortex elke buis op de hoogste stand gedurende 30 plus of min vijf seconden. Plaats de buizen in het buizenrek dat in het sonicatorbad hangt, zodat het waterniveau in het bad gelijk is aan het vloeistofniveau in de buizen. Soniceer bij 45 kilohertz, 100% vermogen en normale functie gedurende 30 plus of min vijf seconden.Herhaal deze vortex- en ultrasoonapparaatcyclus en eindig vervolgens met de laatste vortex. Verdun de monsters serieel in gebufferd water. Plaat op tryptische soja-agar met behulp van de juiste platingmethode en incubeer vervolgens de buizen bij 36 plus of min twee graden Celsius gedurende 24 uur.Tel de kolonies zoals passend bij de gebruikte beplatingsmethode en noteer de gegevens om het rekenkundig gemiddelde te berekenen. Deze vier foto's gemaakt door Danielle Or en Blaine Fritz helpen allemaal om het belang van deze oogst- en desaggregatieprocedure te illustreren. Alle vier deze coupons waren gekleurd met kristalviolet om de hoeveelheid Pseudomonas aeruginosa biofilm op de coupons voor en na het vortex- en ultrasoonapparaatproces te visualiseren.Coupon A is volledig bedekt met biofilm, terwijl coupons B, C en D allemaal aanzienlijk minder biofilm op hun oppervlak hebben. Coupons B, C en D werden allemaal onderworpen aan het vortex- en ultrasoonapparaatproces dat eerder werd beschreven. Deze twee foto's gemaakt door Lindsey Miller op een confocale microscoop met een vergroting van 12,5X tonen een Pseudomonas aeruginosa biofilm die werd behandeld met de live / dode vlek van het achtergrondlicht.Het beeld aan de linkerkant werd gesoniseerd op 45 kilohertz en 10% vermogen, terwijl het beeld aan de rechterkant werd gesoniseerd op 45 kilohertz en 100% vermogen. Het is duidelijk dat de coupon aan de linkerkant veel meer biofilm op zijn oppervlak heeft in vergelijking met de coupon aan de rechterkant. Deze laatste figuur laat zien hoe de manipulatie van verschillende ultrasoonapparaatparameters van invloed is op de hoeveelheid Pseudomonas aeruginosa biofilm die van het couponoppervlak wordt verwijderd.Al deze coupons werden gesoniseerd op 45 kilohertz, 100% vermogen en op normale instelling gedurende 30 plus of min vijf seconden. Deze foto's zijn gemaakt met een vergroting van 12,5x door Lindsey Miller. Coupons in rij één werden gesoniseerd in verdunningswater, terwijl de coupons in rij twee werden gesoniseerd in DE-neutraliserende bouillon.Het lijkt erop dat er minder biofilm overblijft op de coupons die werden gesoniseerd in DE-bouillon die een oppervlakteactieve stof bevat in vergelijking met het verdunningswater. Coupons A, B, E en F werden allemaal gesoniseerd in een volume van 10 milliliter, terwijl coupons C, D, G en H werden gesoniseerd in 40 milliliter oplossing. Er staat duidelijk minder biofilm op de coupons die in de kleinere volumes werden gesoniseerd.Coupons A, C, E en G werden in het bad gesoniseerd met drie buizen tegelijk, terwijl coupons B, D, F en H werden gesoniseerd in een bad met 12 buizen tegelijk. Het lijkt erop dat de monsters met minder buizen superieure biofilmoogst vertoonden. Uiteindelijk lijken het minimaliseren van het volume in de buizen, het verminderen van het aantal buizen dat in één keer wordt gesoniseerd en het gebruik van DE-neutraliserende bouillon allemaal bij te dragen aan een verbeterde biofilmoogst.Er is geen perfecte methode om de biofilm te oogsten en uit te splitsen, maar sommige benaderingen zijn beter voor verschillende oppervlakken en / of toepassingen. De technieken die in deze video worden gedemonstreerd, zijn de drie meest voorkomende methoden volgens een literatuuronderzoek. Deze drie technieken kunnen een startpunt bieden voor onderzoekers.Het is belangrijk om de tijd te nemen om de gekozen oogst- en uitsplitsingsmethode te valideren. Alle apparatuur is iets anders, dus zelfs als de methode is gestandaardiseerd, is het nog steeds verstandig om het proces voor de gebruikte apparatuur te bevestigen. Onderzoek heeft aangetoond dat onjuiste keuzes kunnen leiden tot bevooroordeelde testresultaten.Na het bekijken van deze video zal deze informatie onderzoekers hopelijk helpen beter geïnformeerde beslissingen te nemen over welke methode ze moeten gebruiken en richtlijnen bieden voor het verbeteren van de reproduceerbaarheid voor de drie oppervlaktetypen en aanvullende oogst- en desaggregatietechnieken.

Research

JoVE Journal

Biology

Harvesting Sperm and Artificial Insemination of Mice

Oogsten Sperma en kunstmatige inseminatie van Muizen

Rodents of the genus Peromyscus (deer mice) are the most prevalent native North American mammals.  Peromyscus species are used in a wide range of research ...

A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles

Een stap-voor-stap methode voor de Reconstructie van een ABC-transporter in nanodisc lipide deeltjes

The nanodisc is a discoidal particle (~ 10-12 nm large) that trap membrane proteins into a small patch of phospholipid bilayer. The nanodisc is a ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basis-<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Methoden: Synchronisatie-en-

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

In Vitro Reconstructie van Licht-oogsten Complexen van planten en groene algen

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls ...

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

Efficiënte zoogdiercelexpressie en Single-step Zuivering van extracellulaire Glycoproteïnen voor kristallisatie

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...

An In Vitro Model to Study the Effect of 5-Aminolevulinic Acid-mediated Photodynamic Therapy on Staphylococcus aureus Biofilm

An In Vitro Model to Study the Effect of 5-Aminolevulinic Acid-mediated Photodynamic Therapy on Staphylococcus aureus Biofilm

Een In Vitro Model voor het bestuderen van het Effect van Fotodynamische therapie 5-Aminolevulinic Zuur-gemedieerde op Staphylococcus aureus Biofilm

Staphylococcus aureus (S. aureus) is a common human pathogen, which causes pyogenic and systemic infections. S. aureus infections are difficult to ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

Microbiota-analyse met behulp van twee-stap PCR en de volgende generatie 16S rRNA Gensequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

A Step-by-Step Guide to Mosquito Electroantennography

Een stapsgewijze handleiding voor muggenelektroantennografie

Female mosquitoes are the deadliest animals on earth, claiming the lives of more than 1 million people every year due to pathogens they transmit when ...

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

Tweestaps omgekeerde transcriptiedruppel digitale PCR-protocollen voor SARS-CoV-2-detectie en kwantificering

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...

A Step-By-Step Method to Detect Neutralizing Antibodies Against AAV using a Colorimetric Cell-Based Assay

Een stapsgewijze methode om neutraliserende antilichamen tegen AAV te detecteren met behulp van een colorimetrische celgebaseerde test

Recombinant adeno-associated viruses (rAAV) have proven to be a safe and successful vector for transferring genetic material to treat various health ...