Name: harvesting and disaggregation: an overlooked step in biofilm methods research
Uploaded: 2022-04-22T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Harvesting and Disaggregation: An Overlooked Step in Biofilm Methods Research at JoVE.com

אנו מבקשים להודות לדניאל אור גוביה, בליין פריץ, ג'ניפר סאמרס ופיי סן לי על תרומתם לעיתון זה.

1. מערבולת ו sonication
<ol><li>לגדל ביופילם בוגר P. aeruginosa ATCC 15442 הגדל על פי תקן ASTM E25622.</li>
	<li>בסוף תקופת הצמיחה של 48 שעות, היכונו לטיפול בביופילם ובקופונים לדוגמה על פי תקן ASTM E28718
</li>
	<li>הכנס באופן אספטי שומרי התזה משועבדים אוטומטית לצינורות חרוטיים סטריליים ש?...

<ol>
	<li>Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+microbial+life+on+surfaces.">Biofilms: microbial life on surfaces.</a> Emerging Infectious Diseases. 8 (9), 881-890 (2002).</li><li>ASTM International. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ASTM+Standard+E2562,+2017,+Standard+Test+Method+for+Quantification+of+Pseudomonas+aeruginosa+Biofilm+Grown+with+High+Shear+and+Continuous+Flow+using+CDC+Biofilm+Reactor.">ASTM Standard E2562, 2017, Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown with High Shear and Continuous Flow using CDC Biofilm Reactor.</a> ASTM International. , (2017).</li><li>Azeredo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+review+on+biofilm+methods.">Critical review on biofilm methods.</a> Critical Reviews In Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).</li><li>Gomes, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+reactors+for+the+study+of+medical+biofilms:+a+review+of+the+principles+and+latest+modifications.">Standardized reactors for the study of medical biofilms: a review of the principles and latest modifications.</a> Critical Reviews in Biotechnology. 38 (5), 657-670 (2018).</li><li>Goeres, D. M., et al., Simoes, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+fabrication+of+biofilm+reactors.">Design and fabrication of biofilm reactors.</a> Recent Trends in Biofilm Sciences and Technology. , 71-88 (2020).</li><li>Goeres, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+growing+a+biofilm+under+low+shear+at+the+air-liquid+interface+using+the+drip+flow+biofilm+reactor.">A method for growing a biofilm under low shear at the air-liquid interface using the drip flow biofilm reactor.</a> Nature Protocols. 4 (5), 783-788 (2009).</li><li>ASTM International. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ASTM+Standard+E2871,+Standard+Test+Method+for+Determining+Disinfectant+Efficacy+Against+Biofilm+Grown+in+the+CDC+Biofilm+Reactor+Using+the+Single+Tube+Method.">ASTM Standard E2871, Standard Test Method for Determining Disinfectant Efficacy Against Biofilm Grown in the CDC Biofilm Reactor Using the Single Tube Method.</a> ASTM International. , (2019).</li><li>Goeres, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+Biofilm+Efficacy+Test:+The+Single+Tube+Method.">Validation of a Biofilm Efficacy Test: The Single Tube Method.</a> Journal of Microbiological Methods. , (2019).</li><li>The development and validation of a standard in vitro method to evaluate the efficacy of surface modified urinary catheters. Theses and Dissertations at Montana State University Available from: <a target="_blank" href="https://scholarworks.montana.edu/xmlui/handle/1/15149">https://scholarworks.montana.edu/xmlui/handle/1/15149</a> (2019)</li><li>Hamilton, M. A., Buckingham-Meyer, K., Goeres, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Checking+the+Validity+of+the+harvesting+and+Disaggregating+Steps+in+Laboratory+Tests+of+Surface+Disinfectants.">Checking the Validity of the harvesting and Disaggregating Steps in Laboratory Tests of Surface Disinfectants.</a> Journal of AOAC International. 92 (6), 1755-1762 (2009).</li><li>Conlon, B. P., Rowe, S. E., Lewis, K., Donelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persister+Cells+in+Biofilm+Associated+Infections.">Persister Cells in Biofilm Associated Infections.</a> Biofilm-based Healthcare-associated Infections. , (2015).</li><li>ASTM International. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ASTM+Standard+E2647,+Standard+Test+Method+for+Quantification+of+Pseudomonas+aeruginosa+Biofilm+Grown+Using+Drip+Flow+Biofilm+Reactor+with+Low+Shear+and+Continuous+Flow.">ASTM Standard E2647, Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown Using Drip Flow Biofilm Reactor with Low Shear and Continuous Flow.</a> ASTM International. , (2020).</li><li>Rosenberg, M., Azevedo, N., Ivask, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propidium+iodide+staining+underestimates+viability+of+adherent+bacterial+cells.">Propidium iodide staining underestimates viability of adherent bacterial cells.</a> Scientific Reports. , (2019).</li><li>Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Manuira-Weber, K., Ren, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+aspects+of+using+bacterial+cell+viability+assays+with+the+fluorophores+SYTO9+and+propidium+iodide.">Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide.</a> BMC Microbiology. , (2015).</li><li>Kobayashi, N., Bauer, T. W., Tuohy, M. J., Fujishiro, T., Procop, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+Ultrasonication+Improves+Detection+of+Biofilm-formative+Bacteria+Around+a+Metal+Implant.">Brief Ultrasonication Improves Detection of Biofilm-formative Bacteria Around a Metal Implant.</a> Clinical Orthopaedics and Related Research. 457, 210-213 (2007).</li><li>Lourenco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimum+information+about+a+biofilm+experiment+(MIABiE),+standards+for+reporting+experiments+and+data+on+sessile+microbial+communities+living+at+interfaces.">Minimum information about a biofilm experiment (MIABiE), standards for reporting experiments and data on sessile microbial communities living at interfaces.</a> Pathogens and Disease. , 1-7 (2014).</li><li>Nascentes, C. C., Korn, M., Sousa, C. S., Arruda, M. A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Ultrasonic+Baths+for+Analytical+Applications:+A+New+Approach+for+Optimisation+Conditions.">Use of Ultrasonic Baths for Analytical Applications: A New Approach for Optimisation Conditions.</a> Journal of Brazilian Chemical Society. 12 (1), 57-63 (2001).</li><li>Elma GmbH &amp; Co. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KG+TI-H+Ultrasonic+Cleaning+Units:+Operating+Instructions.">KG TI-H Ultrasonic Cleaning Units: Operating Instructions.</a> Elma GmbH &amp; Co. , (2009).</li><li>Stamper, D. M., Holm, E. R., Brizzolara, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+times+and+energy+densities+for+ultrasonic+disinfection+of+Escherichia+coli,+Pseudomonas+aeruginosa,+Enterococcus+avium+and+sewage.">Exposure times and energy densities for ultrasonic disinfection of Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus avium and sewage.</a> Journal of Environmental Engineering and Science. 7 (2), 139-146 (2008).</li><li>Suslick, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonochemistry.">Sonochemistry.</a> Science. 247 (4949), (1990).</li></ol>

מידע מינימלי לשיטות קצירה ופיזור כדי ליצור נתוני ביופילם הניתנים לשחזור ברחבי הקהילה המדעית, חובה על המחברים לכלול כמה שיותר פרטים לגבי כל אחד משלבי הצמיחה, הטיפול, הדגימה והניתוח של שיטת ביופילם. התקינה של שיטות ביופילם סייעה במאמץ זה שכן היא מאפשרת לחוקר להתייחס לשיטה ספציפי?...

ההגדרה של ביופילם התפתחה בעשורים האחרונים וכוללת קשר מיקרוביאלי עם מגוון משטחים ביולוגיים ו/או לא ביולוגיים, הכללת רכיבים נוצרליים1 המציגים צמיחה שונה וביטוי גנטי2 בתוך מטריצה. Biofilm מספק הגנה מפני לחצים סביבתיים כגון ייבוש ועשוי להפוך את הפעולה של חומרי חיטוי כימיים פחות יעיל וכתוצאה מכך ההישרדות של חיידקים. הניצולים בתוך ביופילם יכולים לספק מקור למיקרואורגניזמים פתוגניים המהווים דאגה לבריאות הציבור3.
שיטות הביופילם מורכבות מארבעה שלבים, צמיחה, טיפול, דגימה (קצירה ופירוק) וניתוח. צמיחה, הצעד הראשון, שבו המשתמש קובע את תנאי הצמיחה האורגניזם, טמפרטורה, מדיה, וכו ', הוא הנחשב ביותר ודווח על בספרות biofilm4,5,6,7. שלב הטיפול מעריך מיקרוביאלים (למשל, חומרי חיטוי) כדי לקבוע את יעילותם או נגד biofilm בוגר3,8,9 או מיקרוביאלית עשוי להיות משולב לתוך פני השטח כדי לקבוע את היכולת של המוצר למנוע או להפחית את הצמיחה biofilm10. השלב השלישי, דגימה, כולל צעדים לקצור את הביופילם מפני השטח שעליהם הוא גדל ולפרק את הגושים שהוסרו 3,8,11. השלב הרביעי, ניתוח, עשוי לכלול ספירת תאים בת קיימא, מיקרוסקופיה, מדידות פלואורסצנטיות, תוצאות מולקולריות ו/או הערכת רכיב מטריצה8,9. הערכת נתונים מספקת מידע על התוצאה של ניסוי. מבין הארבעה, דגימה היא לעתים קרובות הצעד המתעלמים ביותר מכיוון שהיא מניחה שטכניקת קצירת הביופילם ו/או הפירוק הנבחרת יעילה ב-100%, לעתים קרובות ללא אימות11.
השעיות פלנקטוניות של חיידקים, הנחשבות לעתים קרובות הומוגניות, דורשות מערבולת פשוטה לפני הניתוח. ביופילמים, לעומת זאת, הם קהילות מורכבות המורכבות ממיקרואורגניזמים (פרוקריוטים ו/או אואוקריוטים), אקסופוליסכרידים, חלבונים, שומנים, דנ"א חוץ-תאי ותאים מארחים12. צעדים מעבר לשיטות התרבות המיקרוביולוגיות הפלנקטוניות המסורתיות נדרשים על מנת לקצור כראוי ביופילם מפני השטח ולאחר מכן לפרק אותו לתוך השעיה הומוגנית של תא יחיד. סקירת ספרות מקיפה (מידע שאינו כלול בפרסום זה) הראתה כי הבחירה בטכניקת ההסרה וההתפרקות תלויה במספר גורמים, כולל מינים הנמצאים בביופילם, משטח שהביופילם מחובר אליו (לא נקבובי או נקבובי), נגישות למשטחי צמיחה (קופון נשלף בקלות או הרס פיזי של המנגנון שבו הביופילם גדל), גיאומטריה על פני השטח (שטח וצורה), צפיפות של ביופילם על משטחי צמיחה, וציוד מעבדה זמין.
כאשר ביופילם נקצר מפני השטח, ההשעיה התאית המתקבלת היא הטרוגנית. אם יש לספור במדויק את ההשעיה הלא-יוניפורמית הזו, יש לפרק אותה לתאים בודדים. ספירת לוחות קיימא מניחה שיחידת הרכבת מושבה מקורה בחיידק אחד. אם אגרגטים של ביופילם ממוקמים על מדיום הצמיחה, אי אפשר להבחין בין תאים בודדים אשר יכול להוביל להערכות לא מדויקות. לדוגמה, במהלך בדיקות יעילות חיטוי, אם טיפול מסיר biofilm ביעילות רבה מפני השטח לעומת הפקד, הפחתת יומן יכול להיראות גדול באופן מלאכותי לעומת הפקד. מצד שני, חומר חיטוי כימי שמתקן ביופילם על משטח בהשוואה לבקרה ייראה כבעל הפחתת יומן נמוכה יותר11. סוג זה של תרחיש יכול להוביל לפרשנות מוטה של נתונים ניסיוניים.
לקראת הפרסום, סקירה של הספרות קבעה כי גישות נפוצות לקטיף ופירוק ביופילם כוללות גירוד, ניקוי, sonication, מערבולת או שילוב של אלה. גירוד מוגדר כהסרה פיזית של ביופילם ממשטחים עם מקל סטרילי, מרית או כלי אחר. ניקוי מתייחס להסרת ביופילם ממשטחים עם מוט כותנה או חומר סופג קבוע אחר. Sonication מתייחס שיבוש של biofilm מפני משטחים באמצעות גלים קוליים מופצים דרך מים. מערבולת מתייחסת לשימוש במיקסר כדי להשיג מערבולת נוזלית של המדגם בתוך צינור. הומוגניזציה משתמשת בלהבים מסתובבים כדי להטות גושי ביופילם שנקטפו לתוך השעיה של תא יחיד. במאמר זה, אנו מציגים שלוש שיטות קציר ופירוק עבור שני סוגי משטח שונים, קשה / לא נקבובי ונקבובי.
רשימה של מידע מינימלי מומלץ שהחוקרים צריכים לכלול בסעיפי השיטות של הפרסומים מסופקת. אנו מקווים כי הכללת מידע זה תאפשר לחוקרים אחרים לשחזר את עבודתם. אין שיטת קציר ופירוק מושלמת, ולכן, המלצות כיצד לבדוק את הטכניקה מסופקים גם.
שלוש שיטות נפוצות לקצור ולפרק ביופילם ממשטחי גדילה נפוצים מודגמות במאמר זה. מידע זה יאפשר לחוקרים להבין טוב יותר את הדיוק וההטיה הכוללים של שיטת בדיקת ביופילם. השיטות המתוארות הן כדלקמן: (1) ביופילם פסאודומונס aeruginosa הגדל על קופונים פוליקרבונט (משטח קשה שאינו נקבובי) תחת גזירה נוזלית גבוהה בכור Biofilm CDC נקטף ומפוזר בעקבות שילוב של חמישה שלבים של מערבולת ו sonication כדי להשיג קציר ביופילם ופירוק (2) A P. aeruginosa ביופילם שגדל על קופונים זכוכית borosilicate (משטח קשה לא נקבובי) בכור זרימת טפטוף תחת גזירה נוזלית נמוכה נקטף ומנוטרל באמצעות גירוד והומוגניזציה (3) ביופילם קולי Escherichia גדל בצינורות סיליקון (משטח נקבובי) הוא נקצר ומפוזר באמצעות גירוד, ואחריו sonication ו מערבולת.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>50 mL conical vials</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL glass beakers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB102100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-12D</td>
			<td>For adding treatment to vials containing coupons.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL serological pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-14C</td>
			<td>For adding neutralizer to vials at the end of treatment contact time.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applicator sticks</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostats</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal spatula</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE policemen</td>
			<td>Saint-Gobain</td>
			<td>06369-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S 10 N - 10 G - ST Dispersing tool</td>
			<td>IKA</td>
			<td>4446700</td>
			<td>For homogenization of biofilm samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-951-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Foley catheter, size 16 French</td>
			<td>Medline Industries</td>
			<td>DYND11502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing, size 16</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW96400-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Splash Guards</td>
			<td>BioSurface Technologies, Inc.</td>
			<td>CBR 2232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T 10 basic ULTRA-TURRAX Disperser</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3737001</td>
			<td>For homogenization of biofilm samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing connectors</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW02023-86</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Elma</td>
			<td>TI-H15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2 Vertical 50 mL Tube Holder</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-V506</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

harvesting and disaggregation: an overlooked step in biofilm methods research

שיטות הביופילם מורכבות מארבעה שלבים נפרדים: גידול הביופילם במודל רלוונטי, טיפול בביופילם הבוגר, קצירת הביופילם מפני השטח ופירוק הגושים וניתוח המדגם. מבין ארבעת השלבים, קצירה ופירוק הם הפחות נחקרים אך בכל זאת קריטיים כאשר בוחנים את הפוטנציאל להטיית מבחן. מאמר זה מדגים טכניקות קציר ופירוק נפוץ עבור biofilm גדל על שלושה משטחים שונים. שלוש טכניקות קצירת הביופילם והפירוק, שלקטו מסקירת ספרות נרחבת, כוללות מערבולת ו sonication, גירוד והומוגניזציה, ושפשוף, מערבולת ו sonication. שני סוגי משטח נחשבים: קשה לא נקבובי (פוליקרבונט וזכוכית borosilicate) ונקבובי (סיליקון). בנוסף, אנו מספקים המלצות למידע המינימלי שיש לכלול בעת דיווח על טכניקת הקציר ואחריה ושיטה נלווית לבדיקת הטיה.

אימות/אישור של שיטת קציר מספר מחקרים שנערכו במעבדה שלנו בחנו את היכולת של מערבולת ו sonication לקצור ביעילות ביופילם גדל בכור biofilm (ASTM E2562)2 באמצעות שיטת צינור יחיד (ASTM E2871)8.
P. aeruginosa ATCC 15442 ביופילם גדל על פי ASTM E25622 על קופונים זכו?...

Watch this Scientific Journal Video about Harvesting and Disaggregation: An Overlooked Step in Biofilm Methods Research at JoVE.com

Harvesting and Disaggregation: An Overlooked Step in Biofilm Methods Research

מאמר זה מפרט שיטות הממחישות שלוש טכניקות נפוצות של קצירת ביופילם ופירוק חומרים על שני סוגי משטחים, בדיקות מחוספסות של שיטת קציר ומידע מינימלי שיש לקחת בחשבון בעת בחירה ואופטימיזציה של טכניקות קצירה ופירוק כדי להגביר את הרבייה.

קציר ופיזור: צעד מתעלם במחקר שיטות ביופילם

Biofilm methods consist of four distinct steps: growing the biofilm in a relevant model, treating the mature biofilm, harvesting the biofilm from the ...

המטרה הכוללת של הליכים אלה היא לקצור ולפרק ביופילמים בצורה האופטימלית כדי להגביר את הרבייה. שלוש טכניקות יודגמו בסרטון זה, שכל אחת מהן מתמקדת בקציר ובפירוק מסוג משטח אחר. וידאו זה ידגים את הטכניקות הנכונות עבור אחד, מערבולת ו sonicating biofilm את משטח קשה לא נקבובי כגון קופון פוליקרבונט מכור biofilm CDC.שתיים, גירוד והומוגניזציה של הביופילם מעל משטח הזכוכית הקשה והלא נקבובי שנמצא בדרך כלל בכור זרימת הטפטוף. ושלוש, גירוד, מערבולת, ו sonicating של biofilm ממשטח צינורות סיליקון נקבובי נמצא בדרך כלל במודל קטטר. היי, שמי קלי בקינגהאם-מאייר כאן במעבדה לשיטות ביופילם מתוקננות.במעבדה שלנו, אנו מפרקים שיטות ביופילם לארבעה מרכיבים: צמיחה, טיפול, דגימה וניתוח. בספרות ביקורת העמיתים, פרטים על האופן שבו נדגמים או נקטפים ביופילמים ומפורקים ממשטח הם בדרך כלל דלילים. זו הסיבה לסרטון הזה.מכיוון שהמעבדה שלנו מפתחת ובודקת שיטות ביופילם סטנדרטיות, ערכנו סקירה ספרותית מקיפה שבה זוהו שלוש שיטות הקציר והפירוק הנפוצות ביותר של ביופילם. שיטות אלה הן מערבולת ו sonicating biofilm מקופון פוליקרבונט, גירוד הומוגניזציה biofilm מקופון זכוכית borosilicate, ו גירוד, מערבולת, ו sonicating biofilm מצינורות סיליקון. בעוד שיטות שנכתבו על נייר הן חזקות, אנו מקווים כי הווידאו עם הפרטים הטכניים שהוצגו על ידי עמיתתי לעבודה לינדזי מילר ואני יהיה מועיל.כדי להתחיל, לגדול בוגר פסאודומונס aeruginosa 15442 ביופילם על פי תקן ASTM E2562, שיטת הבדיקה הסטנדרטית לכימות של פסאודומונס aeruginosa Biofilm גדל עם גזירה גבוהה וזרימה רציפה באמצעות כור ביופילם CDC. בסוף תקופת הצמיחה של 48 שעות, היכונו לטפל ולדגום קופונים על פי תקן ASTM E2871, שיטת הבדיקה הסטנדרטית לקביעת יעילות חיטוי נגד ביופילם שגדל בכור הביופילם של ה- CDC באמצעות שיטת צינור יחיד. לאחר מכן הכנס באופן אספטי שומרי התזה משועבדים אוטומטית לצינורות חרוטיים סטריליים של 50 מיליליטר באמצעות מלקחיים מעוקרים.חזור על הפעולה עבור כל הצינורות שיקבלו טיפול. צינורות עבור תלושי בקרה לא צריך מגן התזה. הסר באופן אספטי מוט מכור הביופילם של ה-CDC ושטוף אותו ב-30 מיליליטר של מי דילול סטריליים.זה יסיר את התאים המחוברים באופן רופף מהביופילם. החזק את המוט במקביל לספסל העליון מעל צינורות מדגם עם שומרי התזה. באמצעות מפתח ברגים אלן מעוקר להבה, לשחרר את הברגים להגדיר כדי להפיל קופון מצופה biofilm לתוך הצינור.חזור על הפעולה עבור מספר הקופונים הרצוי. מוציאים את שומרי ההתזה ומניחים את שומרי ההתזה במיכל נפרד לעיקור. באמצעות פיפטה סרולוגית חמישה מיליליטר, לאט פיפטה ארבעה מיליליטר של טיפול או שליטה לתוך הצינורות, כך הנוזל זורם במורד החלק הפנימי של הקיר של הצינור.מערבבים בעדינות את החלק התחתון של הצינור, כך שכל בועות אוויר מתחת לקופון נעקרו. אפשר 30 עד 60 שניות בין כל תוספת. בסוף זמן המגע שצוין, פיפטה 36 מיליליטר של מנטרל לתוך הצינורות באותו סדר שבו הטיפול או השליטה הוחלו.מערבולת כל צינור על ההגדרה הגבוהה ביותר עבור 30 פלוס או מינוס חמש שניות ולהבטיח כי מערבולת מלאה מושגת. מניחים צינורות במתלה הצינורות התלויים בסוניאטור המנוטרל כך שמפלס המים באמבטיה שווה למפלס המים בצינורות. Sonicate הדגימות ב 45 קילוהרץ, 100% כוח, ותפקוד רגיל במשך 30 פלוס או מינוס חמש שניות.חזור על מערבולת ומחזורי sonication ולסיים עם מערבולת סופית, במשך חמישה מחזורים בסך הכל. לבסוף, לדלל באופן סדרתי את המדגם, צלחת הדילול על אגר R2A ודגור הצלחות במשך 24 שעות ב 36 מעלות צלזיוס. ספור את המושבות בהתאם לשיטת הציפוי ורשום את הנתונים.זה הבא biofilm קציר וטכניקה פירוק שימושי עבור קופונים קשים שאינם נקבובי כי הם הסטנדרט בכור זרימת טפטוף. לגדול בוגר פסאודומונס aeruginosa 15442 ביופילם על פי תקן ASTM E2647 שיטת הבדיקה הסטנדרטית לכימות של פסאודומונס aeruginosa Biofilm גדל באמצעות כור ביופילם זרימה טפטוף עם גזירה נמוכה וזרימה רציפה. הקימו את תחנת הדגימה כך שתכלול לוח דגימה, 95% אתנול בכוס, מבער אלכוהול, המוסטטים, כלי להסרת קופונים, כוסות עם מי דילול סטריליים וצינורות דילול לשטיפת הקופונים.לכבות את המשאבה, להסיר את כיסוי הערוץ ולהשתמש בכלי להסרת קופונים סטריליים hemostats כדי להסיר את הקופון, נזהר לא להפריע biofilm. לשטוף את הקופון על ידי טבילה עדינה עם תנועת נוזלים ב 45 מיליליטר של מי דילול סטרילי הכלולים צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר. מיד להפוך את התנועה כדי להסיר את הקופון.מניחים את הקופון לתוך המכילה 45 מיליליטר של מי דילול סטריליים. לגרד את משטח הקופון מכוסה biofilm בכיוון כלפי מטה במשך כ 15 שניות באמצעות מרית סטרילית או מגרד. יש לשטוף את המרית או המגרדת על ידי ערבוב בכוס.חזור על תהליך גירוד ושטיפה שלוש עד ארבע פעמים להבטיח כיסוי מלא של משטח הקופון. לשטוף את הקופון על ידי החזקתו בזווית של 60 מעלות על הכוס סטרילית וצינורות מיליליטר אחד של מי דילול סטריליים על פני השטח של הקופון. יש לחזור על הפעולה במשך חמש שטיפות בסך הכל.הכרך האחרון בכוס הוא עכשיו 50 מיליליטר. עבודה בארון בטיחות ביולוגית, הומוגניזציה מדגם biofilm שרוט. צרף בדיקה הומוגנית סטרילית להומוגניזר.מניחים את קצה הבדיקה בנוזל ומפעילים את ההומוגניזר ומשדרגים עד 20, 500 סל"ד. הומוגניזציה המדגם במשך 30 שניות. תנמיך את הסל"ד ותכבה את ההומוגניזר.לחטא את הבדיקה בין דגימות ביופילם על ידי הומוגניזציה בדילול סטרילי תשעה מיליליטר ריק ב 20, 500 סל"ד במשך 30 שניות כמתואר לעיל. הומוגניזציה צינור תשעה מיליליטר של 70% אתנול במשך 30 שניות ולנתק את הגשוש ולתת לו לעמוד בצינור האתנול במשך דקה אחת. הומוגניזציה שני כדורי דילול נוספים.כמו כן, בדיקה הומוגניזר חד פעמית סטרילית עשויה לשמש עבור כל דגימה. לדלל באופן סדרתי את המדגם הומוגני, צלחת את הדילול על R2A באמצעות שיטת הציפוי המתאימה, ודגור את הצלחות במשך 24 שעות ב 36 מעלות צלזיוס. לספור את המושבות ולתעד את הנתונים.טכניקת קצירה ופירוק ביופילם סופית זו שימושית לביופילם הגדל בצינורות נקבוביים כמו צינורות הסיליקון המשמשים במודל הצנתר. כדי להתחיל הליך זה, לגדל biofilm E.coli בוגר 53498 בצנרת קטטר סיליקון. הכינו את חומרי הדגימה: צינורות שטופים, צינור צנטריפוגה סטרילי, צלחת פטרי סטרילית ריקה, המוסטטים מפלדת אל חלד מעוקרת להבה, מספריים, טיימר וסרגל.עם המשאבה מושהית, השתמש 70% אתנול כדי לנקות את החלק החיצוני של הצינורות. מדוד שני סנטימטרים מהסוף, הימנעות מהשטח המחובר למחבר וסמן צינורות כדי לקבוע מיקומי חיתוך. עם מספריים מעוקרים להבה, לחתוך את הצינורות על סימן שני סנטימטרים.יש לשטוף את מקטע הצינורות כדי להסיר תאים פלנקטוניים. עם מלקחיים מעוקרים בלהבות, יש לטבול בעדינות את מקטע הצינורות ב-20 מיליליטר של מי דילול סטריליים, ולאחר מכן להסיר מיד. מניחים את המקטע לתוך 10 מיליליטר של מנטרל.עם מלקחיים מעוקרים להבה, להחזיק את קטע הצינורות ולגרד עם מקל אפליקטור עץ סטרילי עד שכל האזורים הפנימיים של הצינורות כבר גירדו. מדי פעם לשטוף את המקל ב 10 מיליליטר של מנטרל ולהניח את הקטע בחזרה לתוך צינור מדגם. קטע הצינורות המגרדים הוא כעת 10 בחזקת אפס או אפס דילול.מערבולת כל צינור על ההגדרה הגבוהה ביותר במשך 30 פלוס או מינוס חמש שניות. מניחים את הצינורות במתלה הצינורות התלויים באמבט sonicator, כך שמפלס המים באמבטיה שווה לרמת הנוזלים בצינורות. Sonicate ב 45 קילוהרץ, 100% כוח, ותפקוד רגיל במשך 30 פלוס או מינוס חמש שניות.חזור על מערבולת זו ומחזור sonication, ולאחר מכן לסיים עם המערבולת הסופית. לדלל באופן סדרתי את הדגימות במים חוצצים. צלחת על אגר סויה טריפטי באמצעות שיטת ציפוי מתאימה ולאחר מכן לדגור על הצינורות ב 36 פלוס או מינוס שתי מעלות צלזיוס במשך 24 שעות.ספור את המושבות בהתאם לשיטת הציפוי שבה נעשה שימוש ורשום את הנתונים כדי לחשב את הממוצע האריתמטי. ארבע התמונות שצולמו על ידי דניאל אור ובליין פריץ עוזרות להמחיש את החשיבות של הליך הקציר והפירוק הזה. כל ארבעת הקופונים האלה היו מוכתמים עם סגול קריסטל כדי לעזור לדמיין את כמות ביופילם פסאודומונס aeruginosa נוכח על הקופונים לפני ואחרי תהליך המערבולת sonication.קופון A מכוסה לחלוטין ביופילם, בעוד קופונים B, C, ו- D כל יש הרבה פחות biofilm על פני השטח שלהם. קופונים B, C, ו- D היו כולם כפופים למערבולת ותהליך sonication שתואר בעבר. שתי התמונות שצולמו על ידי לינדסי מילר על מיקרוסקופ קונפוקלי בהגדלה של פי 12.5 מתארות ביופילם פסאודומונס אירוגינוזה שטופל בכתם חי/מת באור האחורי.התמונה משמאל הייתה sonicated ב 45 קילוהרץ ו 10% כוח, בעוד התמונה בצד ימין היה sonicated ב 45 קילוהרץ ו 100% כוח. ברור, הקופון בצד שמאל יש הרבה יותר biofilm נשאר על פני השטח שלה לעומת הקופון בצד ימין. נתון סופי זה מציג כיצד מניפולציה של פרמטרים שונים sonication משפיע על כמות ביופילם פסאודומונס aeruginosa הוסר מפני השטח קופון.כל הקופונים האלה היו sonicated ב 45 קילוהרץ, 100% כוח, ועל הגדרה רגילה במשך 30 פלוס או מינוס חמש שניות. תמונות אלה צולמו בהגדלה פי 12.5 על ידי לינדסי מילר. קופונים בשורה אחת היו sonicated במי דילול, בעוד הקופונים בשורה השנייה היו sonicated במרק מנטרל DE.נראה כי יש פחות biofilm שנותר על הקופונים שהיו sonicated במרק DE אשר מכיל פעילי שטח לעומת מי דילול. קופונים A, B, E, ו- F היו כל sonicated בנפח 10 מיליליטר, בעוד קופונים C, D, G ו- H היו sonicated ב 40 מיליליטר של פתרון. ברור שיש פחות biofilm על הקופונים אשר היו sonicated בכרכים הקטנים יותר.קופונים A, C, E, ו- G היו sonicated באמבטיה עם שלושה צינורות בבת אחת, בעוד קופונים B, D, F, ו- H היו sonicated באמבטיה עם 12 צינורות בבת אחת. נראה כי הדגימות sonicated עם פחות צינורות הציגו קציר ביופילם מעולה. בסופו של דבר, מזעור הנפח בצינורות, הפחתת מספר הצינורות sonicated בבת אחת, ושימוש DE מנטרל מרק כל נראה לתרום קציר ביופילם משופרת.אין שיטה מושלמת לקצור ולפרק את הביופילם, אבל כמה גישות טובות יותר עבור משטחים שונים ו / או יישומים. הטכניקות המודגמות בסרטון זה הן שלוש השיטות הנפוצות ביותר על פי סקירת ספרות. שלוש טכניקות אלה יכולות לספק נקודת התחלה לחוקרים.חשוב לקחת את הזמן כדי לאמת את שיטת הקציר והפירוק שנבחרה. כל הציוד שונה במקצת, כך שגם אם השיטה תוקנה, עדיין זה נבון לאשר את התהליך עבור הציוד המשמש. מחקרים הוכיחו כי בחירות לא נכונות עלולות להוביל לתוצאות בדיקה מוטות.לאחר צפייה בסרטון זה, מידע זה יסייע בתקווה לחוקרים לקבל החלטות מושכלות יותר באיזו שיטה להשתמש ולספק הדרכה על שיפור רבייה עבור שלושת סוגי פני השטח וטכניקות קציר ופירוק חינם.

Research

JoVE Journal

Biology

Harvesting Sperm and Artificial Insemination of Mice

קצירת הזרע והזרעה מלאכותית של עכברים

Rodents of the genus Peromyscus (deer mice) are the most prevalent native North American mammals.  Peromyscus species are used in a wide range of research ...

A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles

שיטת צעד אחר צעד לכינונה מחדש של טרנספורטר ABC לחלקיקי ליפידים Nanodisc

The nanodisc is a discoidal particle (~ 10-12 nm large) that trap membrane proteins into a small patch of phospholipid bilayer. The nanodisc is a ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

בסיסי<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; שיטות: סנכרון תצפית

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

במבחנת כינונה מחדש של מכלולי אור קציר של צמחים ואצות ירוקות

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls ...

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

ביטוי יעיל יונקים ניידים וטיהור חד צעד של תאי גליקופרוטאינים להתגבשות

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...

An In Vitro Model to Study the Effect of 5-Aminolevulinic Acid-mediated Photodynamic Therapy on Staphylococcus aureus Biofilm

An In Vitro Model to Study the Effect of 5-Aminolevulinic Acid-mediated Photodynamic Therapy on Staphylococcus aureus Biofilm

מודל ב חוץ גופית כדי לחקור את ההשפעה של טיפול פוטודינמי 5-Aminolevulinic חומצה-מתווכת על Staphylococcus aureus Biofilm

Staphylococcus aureus (S. aureus) is a common human pathogen, which causes pyogenic and systemic infections. S. aureus infections are difficult to ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

אנליזה microbiota באמצעות שני שלבים PCR ו-הדור הבא של 16 rRNA גן רצף

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

A Step-by-Step Guide to Mosquito Electroantennography

מדריך שלב אחר שלב לאלקטרואנטנוגרפיה של יתושים

Female mosquitoes are the deadliest animals on earth, claiming the lives of more than 1 million people every year due to pathogens they transmit when ...

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

פרוטוקולי PCR דיגיטליים טיפתיים דו-שלביים של תמלול לאחור לזיהוי וכימות SARS-CoV-2

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...

A Step-By-Step Method to Detect Neutralizing Antibodies Against AAV using a Colorimetric Cell-Based Assay

שיטה שלב אחר שלב לזיהוי נוגדנים מנטרלים נגד AAV באמצעות בדיקה מבוססת תאים צבעוניים

Recombinant adeno-associated viruses (rAAV) have proven to be a safe and successful vector for transferring genetic material to treat various health ...