Name: harvesting and disaggregation: an overlooked step in biofilm methods research
Uploaded: 2022-04-22T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Harvesting and Disaggregation: An Overlooked Step in Biofilm Methods Research at JoVE.com

Queremos reconhecer Danielle Orr Goveia, Blaine Fritz, Jennifer Summers e Fei San Lee por suas contribuições para este artigo.

1. Vórtice e sônica
<ol><li>Cresça um biofilme P. aeruginosa maduro de 15442 cultivado de acordo com o ASTM Standard E25622.</li>
	<li>Ao final do período de crescimento de 48 horas, prepare-se para tratar os cupons de biofilme e amostra de acordo com o ASTM Standard E28718
</li>
	<li>Asepticamente insira protetores de respingo autoclaved em tubos cônicos estéreis de 50 mL usando fórceps esterilizados por chamas. Repita para todos os tubos...

<ol>
	<li>Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+microbial+life+on+surfaces.">Biofilms: microbial life on surfaces.</a> Emerging Infectious Diseases. 8 (9), 881-890 (2002).</li><li>ASTM International. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ASTM+Standard+E2562,+2017,+Standard+Test+Method+for+Quantification+of+Pseudomonas+aeruginosa+Biofilm+Grown+with+High+Shear+and+Continuous+Flow+using+CDC+Biofilm+Reactor.">ASTM Standard E2562, 2017, Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown with High Shear and Continuous Flow using CDC Biofilm Reactor.</a> ASTM International. , (2017).</li><li>Azeredo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+review+on+biofilm+methods.">Critical review on biofilm methods.</a> Critical Reviews In Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).</li><li>Gomes, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+reactors+for+the+study+of+medical+biofilms:+a+review+of+the+principles+and+latest+modifications.">Standardized reactors for the study of medical biofilms: a review of the principles and latest modifications.</a> Critical Reviews in Biotechnology. 38 (5), 657-670 (2018).</li><li>Goeres, D. M., et al., Simoes, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+fabrication+of+biofilm+reactors.">Design and fabrication of biofilm reactors.</a> Recent Trends in Biofilm Sciences and Technology. , 71-88 (2020).</li><li>Goeres, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+growing+a+biofilm+under+low+shear+at+the+air-liquid+interface+using+the+drip+flow+biofilm+reactor.">A method for growing a biofilm under low shear at the air-liquid interface using the drip flow biofilm reactor.</a> Nature Protocols. 4 (5), 783-788 (2009).</li><li>ASTM International. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ASTM+Standard+E2871,+Standard+Test+Method+for+Determining+Disinfectant+Efficacy+Against+Biofilm+Grown+in+the+CDC+Biofilm+Reactor+Using+the+Single+Tube+Method.">ASTM Standard E2871, Standard Test Method for Determining Disinfectant Efficacy Against Biofilm Grown in the CDC Biofilm Reactor Using the Single Tube Method.</a> ASTM International. , (2019).</li><li>Goeres, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+Biofilm+Efficacy+Test:+The+Single+Tube+Method.">Validation of a Biofilm Efficacy Test: The Single Tube Method.</a> Journal of Microbiological Methods. , (2019).</li><li>The development and validation of a standard in vitro method to evaluate the efficacy of surface modified urinary catheters. Theses and Dissertations at Montana State University Available from: <a target="_blank" href="https://scholarworks.montana.edu/xmlui/handle/1/15149">https://scholarworks.montana.edu/xmlui/handle/1/15149</a> (2019)</li><li>Hamilton, M. A., Buckingham-Meyer, K., Goeres, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Checking+the+Validity+of+the+harvesting+and+Disaggregating+Steps+in+Laboratory+Tests+of+Surface+Disinfectants.">Checking the Validity of the harvesting and Disaggregating Steps in Laboratory Tests of Surface Disinfectants.</a> Journal of AOAC International. 92 (6), 1755-1762 (2009).</li><li>Conlon, B. P., Rowe, S. E., Lewis, K., Donelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persister+Cells+in+Biofilm+Associated+Infections.">Persister Cells in Biofilm Associated Infections.</a> Biofilm-based Healthcare-associated Infections. , (2015).</li><li>ASTM International. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ASTM+Standard+E2647,+Standard+Test+Method+for+Quantification+of+Pseudomonas+aeruginosa+Biofilm+Grown+Using+Drip+Flow+Biofilm+Reactor+with+Low+Shear+and+Continuous+Flow.">ASTM Standard E2647, Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown Using Drip Flow Biofilm Reactor with Low Shear and Continuous Flow.</a> ASTM International. , (2020).</li><li>Rosenberg, M., Azevedo, N., Ivask, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propidium+iodide+staining+underestimates+viability+of+adherent+bacterial+cells.">Propidium iodide staining underestimates viability of adherent bacterial cells.</a> Scientific Reports. , (2019).</li><li>Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Manuira-Weber, K., Ren, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+aspects+of+using+bacterial+cell+viability+assays+with+the+fluorophores+SYTO9+and+propidium+iodide.">Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide.</a> BMC Microbiology. , (2015).</li><li>Kobayashi, N., Bauer, T. W., Tuohy, M. J., Fujishiro, T., Procop, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+Ultrasonication+Improves+Detection+of+Biofilm-formative+Bacteria+Around+a+Metal+Implant.">Brief Ultrasonication Improves Detection of Biofilm-formative Bacteria Around a Metal Implant.</a> Clinical Orthopaedics and Related Research. 457, 210-213 (2007).</li><li>Lourenco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimum+information+about+a+biofilm+experiment+(MIABiE),+standards+for+reporting+experiments+and+data+on+sessile+microbial+communities+living+at+interfaces.">Minimum information about a biofilm experiment (MIABiE), standards for reporting experiments and data on sessile microbial communities living at interfaces.</a> Pathogens and Disease. , 1-7 (2014).</li><li>Nascentes, C. C., Korn, M., Sousa, C. S., Arruda, M. A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Ultrasonic+Baths+for+Analytical+Applications:+A+New+Approach+for+Optimisation+Conditions.">Use of Ultrasonic Baths for Analytical Applications: A New Approach for Optimisation Conditions.</a> Journal of Brazilian Chemical Society. 12 (1), 57-63 (2001).</li><li>Elma GmbH &amp; Co. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KG+TI-H+Ultrasonic+Cleaning+Units:+Operating+Instructions.">KG TI-H Ultrasonic Cleaning Units: Operating Instructions.</a> Elma GmbH &amp; Co. , (2009).</li><li>Stamper, D. M., Holm, E. R., Brizzolara, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+times+and+energy+densities+for+ultrasonic+disinfection+of+Escherichia+coli,+Pseudomonas+aeruginosa,+Enterococcus+avium+and+sewage.">Exposure times and energy densities for ultrasonic disinfection of Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus avium and sewage.</a> Journal of Environmental Engineering and Science. 7 (2), 139-146 (2008).</li><li>Suslick, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonochemistry.">Sonochemistry.</a> Science. 247 (4949), (1990).</li></ol>

Informações mínimas para métodos de colheita e desagregação Para criar dados reprodutíveis de biofilme em toda a comunidade científica, é imprescindível que os autores incluam o máximo de detalhes possível em relação a cada uma das etapas de crescimento, tratamento, amostragem e análise de um método de biofilme. A padronização dos métodos de biofilme tem auxiliado nesse esforço, pois permite ao pesquisador referenciar um método específico e quaisquer modificações relevantes. No...

A definição de biofilme evoluiu ao longo das últimas décadas e engloba a associação microbiana com uma variedade de superfícies biológicas e/ou não biológicas, inclusão de componentes nãocelulares1 que apresentam crescimento diferente e expressão genética2 dentro de uma matriz. O biofilme fornece proteção contra estresses ambientais, como a secagem, pode tornar a ação de desinfetantes químicos menos eficaz, resultando na sobrevivência de micróbios. Os sobreviventes dentro de um biofilme podem potencialmente fornecer uma fonte de microrganismos patogênicos que são uma preocupação de saúde pública3.
Os métodos de biofilme são compostos por quatro etapas, crescimento, tratamento, amostragem (colheita e desagregação) e análise. O crescimento, o primeiro passo, onde o usuário determina as condições de crescimento do organismo, temperatura, mídia, etc., é o mais considerado e relatado na literatura de biofilme4,5,6,7. A etapa de tratamento avalia os antimicrobianos (por exemplo, desinfetantes) para determinar sua eficácia, seja contra um biofilme maduro3,8,9 ou o antimicrobiano pode ser incorporado à superfície para determinar a capacidade do produto de prevenir ou reduzir o crescimento do biofilme10. O terceiro passo, amostragem, inclui etapas para colher o biofilme da superfície em que estava crescendo e desagregar os aglomerados removidos3,8,11. A quarta etapa, análise, pode incluir contagem de células viáveis, microscopia, medidas de fluorescência, desfechos moleculares e/ou uma avaliação de componentes matricia8,9. A avaliação dos dados fornece informações sobre o resultado de um experimento. Dos quatro, a amostragem é muitas vezes o passo mais negligenciado porque presume que a técnica de colheita de biofilme e/ou desagregação escolhida é 100% eficaz, muitas vezes sem verificação11.
Suspensões planctônicas de bactérias, muitas vezes consideradas homogêneas, requerem vórtice simples antes da análise. Os biofilmes, no entanto, são comunidades complexas compostas por microrganismos (procarióticos e/ou eucarióticos), exopolysacarídeos, proteínas, lipídios, DNA extracelular e células hospedeiras12. Passos além dos métodos tradicionais de cultura microbiológica planctônica são necessários para colher adequadamente o biofilme de uma superfície e, em seguida, desagregá-lo em uma suspensão celular única homogênea. Uma extensa revisão da literatura (informações não incluídas nesta publicação) demonstrou que a escolha da técnica de remoção e desagregação depende de uma série de fatores, incluindo espécies presentes no biofilme, superfície a que o biofilme está ligado (não poroso ou poroso), acessibilidade a superfícies de crescimento (cupom facilmente removível ou destruição física de aparelhos nos quais o biofilme está crescendo), geometria da superfície (área e forma), densidade de biofilme em superfícies de crescimento e equipamentos de laboratório disponíveis.
Quando o biofilme é colhido de uma superfície, a suspensão celular resultante é heterogênea. Se essa suspensão não uniforme for enumerada com precisão, ela deve ser desagregada em células individuais. As placas viáveis assumem que uma unidade formadora de colônias se origina de uma bactéria. Se os agregados de biofilme forem colocados no meio de crescimento, é impossível distinguir células individuais que poderiam levar a estimativas imprecisas. Por exemplo, durante o teste de eficácia desinfetante, se um tratamento remover o biofilme de forma muito eficaz de uma superfície em comparação com o controle, a redução do tronco pode parecer artificialmente grande em comparação com o controle. Por outro lado, um desinfetante químico que fixa biofilme em uma superfície em comparação com o controle parecerá ter uma redução menor do tronco11. Esse tipo de cenário pode levar a uma interpretação tendenciosa dos dados experimentais.
Em preparação para a publicação, uma revisão da literatura determinou que abordagens comuns à colheita e desagregação do biofilme incluem raspagem, swabbing, sonicação, vórtice ou uma combinação destes. A raspagem é definida como remoção física de biofilme de superfícies com uma vara estéril, espátula ou outra ferramenta. Swabbing refere-se à remoção de biofilme de superfícies com uma vara de ponta de algodão ou outro material absorvente fixo. A sônica refere-se à interrupção do biofilme das superfícies através de ondas ultrassônicas distribuídas através da água. Vortexing refere-se ao uso de uma batedeira para alcançar um vórtice líquido da amostra dentro de um tubo. A homogeneização utiliza lâminas rotativas para tesourar aglomerados de biofilme colhidos em uma única suspensão celular. Neste artigo, apresentamos três métodos de colheita e desagregação para dois tipos de superfície diferentes, duros/não porosos e porosos.
Uma lista de informações mínimas recomendadas que os pesquisadores devem incluir nos métodos seções de publicações é fornecida. Esperamos que a inclusão dessas informações permita que outros pesquisadores reproduzam seu trabalho. Não há um método perfeito de colheita e desagregação, portanto, recomendações de como verificar a técnica também são fornecidas.
Três métodos comuns para colher e desagregar biofilme de superfícies comuns de crescimento são demonstrados neste artigo. Essas informações permitirão aos pesquisadores entender melhor a precisão e o viés geral de um método de teste de biofilme. Os métodos descritos são os seguintes: (1) Um biofilme pseudomonas aeruginosa cultivado em cupons de policarbonato (superfície não porosa dura) sob cisalhamento de fluidos elevados no Reator de Biofilme CDC é colhido e desagregado após uma combinação de cinco passos de vórtice e sonicação para alcançar a colheita de biofilme e desagregação (2) A Aeruginosa biofilme cultivado em cupons de vidro borossilicato (superfície não porosa dura) no reator de fluxo de gotejamento sob cisalhamento de baixo fluido é colhido e desagregado usando raspagem e homogeneização (3) Um biofilme Escherichia coli cultivado em tubos de silicone (superfície porosa) é colhido e desagregadoreg usando raspagem, seguido de sonicação e vórtice.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>50 mL conical vials</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL glass beakers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB102100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-12D</td>
			<td>For adding treatment to vials containing coupons.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL serological pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-14C</td>
			<td>For adding neutralizer to vials at the end of treatment contact time.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applicator sticks</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostats</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal spatula</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE policemen</td>
			<td>Saint-Gobain</td>
			<td>06369-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S 10 N - 10 G - ST Dispersing tool</td>
			<td>IKA</td>
			<td>4446700</td>
			<td>For homogenization of biofilm samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-951-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Foley catheter, size 16 French</td>
			<td>Medline Industries</td>
			<td>DYND11502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing, size 16</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW96400-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Splash Guards</td>
			<td>BioSurface Technologies, Inc.</td>
			<td>CBR 2232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T 10 basic ULTRA-TURRAX Disperser</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3737001</td>
			<td>For homogenization of biofilm samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing connectors</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW02023-86</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Elma</td>
			<td>TI-H15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2 Vertical 50 mL Tube Holder</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-V506</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

harvesting and disaggregation: an overlooked step in biofilm methods research

Os métodos de biofilme consistem em quatro etapas distintas: o crescimento do biofilme em um modelo relevante, o tratamento do biofilme maduro, a colheita do biofilme da superfície e a desagregação dos aglomerados e a análise da amostra. Das quatro etapas, a colheita e a desagregação são as menos estudadas, mas ainda assim críticas quando se considera o potencial de viés de teste. Este artigo demonstra técnicas de colheita e desagregação comumente utilizadas para biofilme cultivado em três superfícies diferentes. As três técnicas de coleta e desagregação de biofilmes, obtidas a partir de uma extensa revisão da literatura, incluem vórtice e sônica, raspagem e homogeneização, raspagem, vórtice e sônicação. Dois tipos de superfície são considerados: duro não poroso (policarbonato e vidro borossilicato) e poroso (silicone). Além disso, fornecemos recomendações para as informações mínimas que devem ser incluídas ao relatar a técnica de colheita seguida e um método de acompanhamento para verificar o viés.

Validação/Confirmação de um Método de Colheita Vários estudos realizados em nosso laboratório examinaram a capacidade de vórtice e sônica para colher efetivamente o biofilme cultivado no reator biofilme (ASTM E2562)2 utilizando o Método Único do Tubo (ASTM E2871)8.
Um biofilme P. aeruginosa ATCC 15442 foi cultivado de acordo com aSTM E25622 em cupons de vidro borossilicato. Após 48 ...

Watch this Scientific Journal Video about Harvesting and Disaggregation: An Overlooked Step in Biofilm Methods Research at JoVE.com

Harvesting and Disaggregation: An Overlooked Step in Biofilm Methods Research

Este artigo detalha métodos que demonstram três técnicas comuns de coleta e desagregação de biofilmes em dois tipos de superfície, testes de robustez de um método de colheita e informações mínimas a serem consideradas ao escolher e otimizar técnicas de colheita e desagregação para aumentar a reprodutibilidade.

Colheita e Desagregação: Um passo negligenciado na pesquisa de métodos de biofilme

Biofilm methods consist of four distinct steps: growing the biofilm in a relevant model, treating the mature biofilm, harvesting the biofilm from the ...

O objetivo geral desses procedimentos é colher e desagregar biofilmes da maneira ideal para aumentar a reprodutibilidade. Três técnicas serão demonstradas neste vídeo, cada uma com foco na colheita e desagregação de um tipo de superfície diferente. Este vídeo demonstrará as técnicas adequadas para um, vórtice e sonicação biofilm de uma superfície não porosa dura, como um cupom de policarbonato do reator de biofilme CDC.Segundo, a raspagem e homogeneização do biofilme da superfície de vidro borossilicato dura não porosa comumente encontrada no reator de fluxo de gotejamento. E três, a raspagem, vórtice e sonicação de biofilme de uma superfície de tubo de silicone porosa comumente encontrada no modelo de cateter. Oi, meu nome é Kelly Buckingham-Meyer aqui no Laboratório de Métodos Padronizados de Biofilm.Em nosso laboratório, dividimos os métodos de biofilme em quatro componentes: crescimento, tratamento, amostragem e análise. Na literatura revisada por pares, detalhes de como os biofilmes são amostrados ou colhidos e desagregados de uma superfície são tipicamente escassos. Esta é a razão deste vídeo.Como nosso laboratório desenvolve e testa métodos padronizados de biofilme, realizamos uma extensa revisão bibliográfica onde foram identificados os três métodos mais comuns de coleta e desagregação de biofilmes. Esses métodos são vórtices e sonicização de biofilme de um cupom de policarbonato, raspagem e homogeneização de biofilme de um cupom de vidro borossilicato, e raspagem, vórtice e biofilme sonicating de tubos de silicone. Embora os métodos escritos no papel sejam poderosos, esperamos que o vídeo com os detalhes técnicos apresentados pela minha colega lindsey Miller e eu seja útil.Para começar, cresça o biofilme pseudomonas aeruginosa aeruginosa 15442 de acordo com o ASTM Standard E2562, o Método Padrão de Teste para Quantificação de Pseudomonas aeruginosa Biofilm Cultivado com Alta Tesoura e Fluxo Contínuo usando o Reator de Biofilme CDC. Ao final do período de crescimento de 48 horas, prepare-se para tratar e provar cupons de acordo com o ASTM Standard E2871, o Método padrão de teste para determinar a eficácia de desinfetante contra o biofilme cultivado no reator de biofilme CDC usando o método do tubo único. Em seguida, asepticamente insira protetores de respingo autoclaved em tubos cônicos estéreis de 50 mililitros usando fórceps esterilizados pela chama.Repita para todos os tubos que receberão tratamento. Tubos para cupons de controle não precisam de um protetor de respingo. Remova asepticamente uma haste do reator de biofilme CDC e enxágue-a em 30 mililitros de água de diluição estéril.Isso removerá as células frouxamente ligadas do biofilme. Segure a haste paralela ao topo do banco sobre os tubos de amostra com protetores de respingo. Usando uma chave Allen esterilizada por chamas, solte os parafusos do conjunto para soltar um cupom revestido de biofilm no tubo.Repita para o número desejado de cupons. Remova os protetores de respingo e coloque os protetores de respingo em um recipiente separado para esterilização. Usando uma pipeta sorológica de cinco mililitros, pipeta lentamente quatro mililitros de tratamento ou controle nos tubos para que o líquido flua pelo interior da parede do tubo.Gire suavemente a parte inferior do tubo para que quaisquer bolhas de ar sob o cupom sejam deslocadas. Deixe por 30 a 60 segundos entre cada adição. Ao final do tempo de contato especificado, pipeta 36 mililitros de neutralizador nos tubos na mesma ordem que o tratamento ou controle foi aplicado.Vórtice de cada tubo na configuração mais alta por 30 mais ou menos cinco segundos e certifique-se de que um vórtice completo seja alcançado. Coloque tubos no rack de tubo suspensos no sonicador desgassed de tal forma que o nível de água no banho seja igual ao nível de água nos tubos. Sonicar as amostras a 45 kilohertz, 100% de potência e função normal por 30 mais ou menos cinco segundos.Repita os ciclos de vórtice e sônica e termine com um vórtice final, para um total de cinco ciclos. Por fim, dilui a amostra em série, emplaque a diluição no ágar R2A e incuba as placas por 24 horas a 36 graus Celsius. Conte as colônias conforme apropriado ao método de chapeamento e regise os dados.Esta próxima técnica de colheita e desagregação de biofilmes é útil para cupons não porosos duros que são o padrão no reator de fluxo de gotejamento. Cresça um biofilme pseudomonas aeruginosa maduro 15442 de acordo com o ASTM Standard E2647 o Método padrão de teste para quantificação de pseudomonas aeruginosa Biofilm Cultivado usando reator de biofilme de fluxo de gotejamento com cisalhamento baixo e fluxo contínuo. Configure a estação de amostragem para incluir uma placa de amostragem, 95% de etanol em um béquer, um queimador de álcool, hemostats, uma ferramenta de remoção de cupom, béquers com água de diluição estéril e tubos de diluição para enxaguar os cupons.Desligue a bomba, remova a tampa do canal e use a ferramenta de remoção de cupom estéril e hemostats para remover o cupom, tomando cuidado para não perturbar o biofilme. Enxágüe o cupom imergindo suavemente com um movimento fluido em 45 mililitros de água de diluição estéril contida em um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Inverta imediatamente o movimento para remover o cupom.Coloque o cupom em um béquer contendo 45 mililitros de água de diluição estéril. Raspe a superfície do cupom coberto de biofilme em uma direção descendente por aproximadamente 15 segundos usando uma espátula ou raspador estéril. Enxágüe a espátula ou raspadora mexendo-a no béquer.Repita o processo de raspagem e lavagem três a quatro vezes, garantindo a cobertura completa da superfície do cupom. Enxágüe o cupom segurando-o em um ângulo de 60 graus sobre o béquer estéril e tubos de um mililitro de água de diluição estéril sobre a superfície do cupom. Repita para um total de cinco enxágues.O volume final no béquer agora é de 50 mililitros. Trabalhando no armário de biossegurança, homogeneize a amostra de biofilme raspada. Conecte uma sonda homogeneizadora estéril ao homogeneizador.Coloque a ponta da sonda no líquido e ligue o homogeneizador e aumente até 20,500 RPM. Homogeneize a amostra por 30 segundos. Abaixe o RPM e desligue o homogeneizador.Higienize a sonda entre amostras de biofilme homogeneizando em nove mililitros de diluição estéril em branco a 20.500 RPM por 30 segundos como descrito acima. Homogeneize um tubo de nove mililitros de 70% de etanol por 30 segundos e desprende a sonda e deixe-a parada no tubo de etanol por um minuto. Homogeneize dois espaços adicionais de diluição.Além disso, uma sonda homogeneizadora descartável estéril pode ser usada para cada amostra. Diluir em série a amostra homogeneizada, emplacar as diluições em R2A usando o método de revestimento apropriado e incubar as placas por 24 horas a 36 graus Celsius. Conte as colônias e regissou os dados.Esta técnica final de coleta e desagregação de biofilmes é útil para o biofilme cultivado em tubos porosos como a tubulação de silicone usada no modelo do cateter. Para iniciar este procedimento, crie um biofilme E.coli 53498 maduro em tubos de cateter de silicone. Prepare os materiais de amostragem: tubos enxaguados, um tubo de centrífuga estéril, uma placa de Petri estéril vazia, hemostats de aço inoxidável esterilizado por chamas, tesoura, temporizador e uma régua.Com a bomba pausada, use 70% de etanol para limpar a parte externa da tubulação. Meça dois centímetros a partir do final, evitando a área anexada ao conector e marque tubos para determinar locais de corte. Com uma tesoura esterilizada pela chama, corte o tubo na marca de dois centímetros.Enxágüe o segmento de tubos para remover células planctônicas. Com fórceps esterilizados por chamas, mergulhe suavemente o segmento de tubos em 20 mililitros de água de diluição estéril e, em seguida, remova imediatamente. Coloque o segmento em 10 mililitros de neutralizador.Com fórceps esterilizados por chamas, segure o segmento de tubos e raspe com uma vara aplicadora de madeira estéril até que todas as áreas internas do tubo tenham sido raspadas. Ocasionalmente enxágue a vara nos 10 mililitros de neutralizador e coloque o segmento de volta no tubo de amostra. O segmento de tubulação raspada é agora o 10 para o zero ou a diluição zero.Vórtice cada tubo na configuração mais alta por 30 mais ou menos cinco segundos. Coloque os tubos no rack de tubo suspensos no banho do sonicator, de talto que o nível de água no banho seja igual ao nível líquido nos tubos. Sonicate a 45 kilohertz, 100% de potência, e função normal por 30 mais ou menos cinco segundos.Repita este vórtice e ciclo de sônica, em seguida, termine com o vórtice final. Diluir as amostras em água tamponada. Placa no ágar de soja tripptic usando o método de revestimento apropriado e, em seguida, incubar os tubos a 36 mais ou menos dois graus Celsius por 24 horas.Conte as colônias conforme apropriado ao método de chapeamento utilizado e regise os dados para calcular a média aritmética. Estas quatro imagens tiradas por Danielle Or e Blaine Fritz ajudam a ilustrar a importância deste procedimento de colheita e desagregação. Todos esses quatro cupons foram manchados com violeta cristalina para ajudar a visualizar a quantidade de pseudomonas aeruginosa biofilm presente nos cupons antes e depois do vórtice e processo de sônica.O cupom A é completamente coberto em biofilme, enquanto os cupons B, C e D têm substancialmente menos biofilme em sua superfície. Os cupons B, C e D foram todos submetidos ao vórtice e processo de sônica descrito anteriormente. Estas duas imagens tiradas por Lindsey Miller em um microscópio confocal em 12,5X de ampliação retrata um biofilme Pseudomonas aeruginosa que foi tratado com a luz traseira viva/morta mancha.A imagem à esquerda foi sônica a 45 kilohertz e 10% de potência, enquanto a imagem à direita foi sônica a 45 kilohertz e 100% de potência. Claramente, o cupom à esquerda tem muito mais biofilmes remanescentes em sua superfície em comparação com o cupom à direita. Esta figura final mostra como a manipulação de diferentes parâmetros de sônica afeta a quantidade de pseudomonas aeruginosa biofilm removido da superfície do cupom.Todos esses cupons foram sonicados a 45 kilohertz, 100% de potência, e na configuração normal por 30 mais ou menos cinco segundos. Estas imagens foram tiradas em 12,5X de ampliação por Lindsey Miller. Os cupons na primeira fila foram sonicados em água de diluição, enquanto os cupons da linha dois foram sonicados em caldo neutralizante DE.Parece que há menos biofilme remanescente nos cupons que foram sonicados no caldo DE que contém um surfactante em comparação com a água de diluição. Os cupons A, B, E e F foram todos sonicados em um volume de 10 mililitros, enquanto os cupons C, D, G e H foram sonicados em 40 mililitros de solução. Há claramente menos biofilm nos cupons que foram sonicados nos volumes menores.Os cupons A, C, E e G foram sonicados no banho com três tubos ao mesmo tempo, enquanto os cupons B, D, F e H foram sonicados em um banho com 12 tubos ao mesmo tempo. Parece que as amostras sonicadas com menos tubos apresentaram colheita superior de biofilme. Em última análise, minimizar o volume nos tubos, reduzir o número de tubos sonicados de uma só vez, e o uso de caldo neutralizante DE parecem contribuir para uma maior colheita de biofilmes.Não há um método perfeito para colher e desagregar o biofilme, mas algumas abordagens são melhores para diferentes superfícies e/ou aplicações. As técnicas demonstradas neste vídeo são os três métodos mais comuns de acordo com uma revisão biblio literatura. Essas três técnicas podem fornecer um ponto de partida para os pesquisadores.É importante aproveitar o tempo para validar o método de colheita e desagregação escolhido. Todos os equipamentos são ligeiramente diferentes, por isso, mesmo que o método tenha sido padronizado, ainda é prudente confirmar o processo para o equipamento utilizado. Pesquisas demonstraram que escolhas inadequadas podem levar a resultados de testes tendenciosos.Depois de assistir a este vídeo, essas informações, esperançosamente, ajudarão os pesquisadores a tomar decisões mais informadas sobre qual método usar e fornecer orientações sobre a melhoria da reprodutibilidade para os três tipos de superfície e técnicas de colheita e desagregação complementares.

Research

JoVE Journal

Biology

Harvesting Sperm and Artificial Insemination of Mice

Sperm colheita e Inseminação Artificial de Ratos

Rodents of the genus Peromyscus (deer mice) are the most prevalent native North American mammals.  Peromyscus species are used in a wide range of research ...

Biologia

A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles

Um método passo-a-passo para a reconstituição de um transportador ABC em partículas lipídicas Nanodisc

The nanodisc is a discoidal particle (~ 10-12 nm large) that trap membrane proteins into a small patch of phospholipid bilayer. The nanodisc is a ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Básico<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Métodos: Sincronização e observação

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

In Vitro Reconstituição de Complexos de Light-colheita de plantas e algas verdes

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls ...

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

Expressão Mammalian Cell eficiente e de uma etapa de purificação extracelular glicoproteínas para a cristalização

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...

An In Vitro Model to Study the Effect of 5-Aminolevulinic Acid-mediated Photodynamic Therapy on Staphylococcus aureus Biofilm

An In Vitro Model to Study the Effect of 5-Aminolevulinic Acid-mediated Photodynamic Therapy on Staphylococcus aureus Biofilm

Um modelo In Vitro para estudar o efeito da terapia fotodinâmica 5 ácido aminolevulínico-mediada no biofilme de Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus (S. aureus) is a common human pathogen, which causes pyogenic and systemic infections. S. aureus infections are difficult to ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

Análise de microbiota usando PCR de duas etapas e sequenciamento do gene 16S rRNA de próxima geração

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

A Step-by-Step Guide to Mosquito Electroantennography

Um guia passo-a-passo para eletroantennografia de mosquitos

Female mosquitoes are the deadliest animals on earth, claiming the lives of more than 1 million people every year due to pathogens they transmit when ...

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

Protocolos digitais de PCR digital de gotícula de transcrição reversa em duas etapas para detecção e quantificação de SARS-CoV-2

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...

A Step-By-Step Method to Detect Neutralizing Antibodies Against AAV using a Colorimetric Cell-Based Assay

Um método passo-a-passo para detectar anticorpos neutralizantes contra a AAV usando um ensaio baseado em células coloridas

Recombinant adeno-associated viruses (rAAV) have proven to be a safe and successful vector for transferring genetic material to treat various health ...