Name: harvesting and disaggregation: an overlooked step in biofilm methods research
Uploaded: 2022-04-22T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Harvesting and Disaggregation: An Overlooked Step in Biofilm Methods Research at JoVE.com

Danielle Orr Goveia, Blaine Fritz, Jennifer Summers ve Fei San Lee'ye bu makaleye katkılarından dolayı teşekkür ederiz.

1. Vorteks ve sonication
<ol><li>ASTM Standardı E25622'ye göre yetiştirilen olgun bir P. aeruginosa ATCC 15442 biyofilmi yetiştirin.</li>
	<li>48 saatlik büyüme süresinin sonunda, biyofilm ve numune kuponlarını ASTM Standardı E28718'e göre işlemeye hazırlanın.
</li>
	<li>Otoklavlanmış sıçrama korumalarını, alevle sterilize edilmiş forseps kullanarak steril 50 mL konik tüplere aseptik olarak yerleştirin. Tedavi görecek tüm...

<ol>
	<li>Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+microbial+life+on+surfaces.">Biofilms: microbial life on surfaces.</a> Emerging Infectious Diseases. 8 (9), 881-890 (2002).</li><li>ASTM International. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ASTM+Standard+E2562,+2017,+Standard+Test+Method+for+Quantification+of+Pseudomonas+aeruginosa+Biofilm+Grown+with+High+Shear+and+Continuous+Flow+using+CDC+Biofilm+Reactor.">ASTM Standard E2562, 2017, Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown with High Shear and Continuous Flow using CDC Biofilm Reactor.</a> ASTM International. , (2017).</li><li>Azeredo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+review+on+biofilm+methods.">Critical review on biofilm methods.</a> Critical Reviews In Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).</li><li>Gomes, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+reactors+for+the+study+of+medical+biofilms:+a+review+of+the+principles+and+latest+modifications.">Standardized reactors for the study of medical biofilms: a review of the principles and latest modifications.</a> Critical Reviews in Biotechnology. 38 (5), 657-670 (2018).</li><li>Goeres, D. M., et al., Simoes, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+fabrication+of+biofilm+reactors.">Design and fabrication of biofilm reactors.</a> Recent Trends in Biofilm Sciences and Technology. , 71-88 (2020).</li><li>Goeres, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+growing+a+biofilm+under+low+shear+at+the+air-liquid+interface+using+the+drip+flow+biofilm+reactor.">A method for growing a biofilm under low shear at the air-liquid interface using the drip flow biofilm reactor.</a> Nature Protocols. 4 (5), 783-788 (2009).</li><li>ASTM International. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ASTM+Standard+E2871,+Standard+Test+Method+for+Determining+Disinfectant+Efficacy+Against+Biofilm+Grown+in+the+CDC+Biofilm+Reactor+Using+the+Single+Tube+Method.">ASTM Standard E2871, Standard Test Method for Determining Disinfectant Efficacy Against Biofilm Grown in the CDC Biofilm Reactor Using the Single Tube Method.</a> ASTM International. , (2019).</li><li>Goeres, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+Biofilm+Efficacy+Test:+The+Single+Tube+Method.">Validation of a Biofilm Efficacy Test: The Single Tube Method.</a> Journal of Microbiological Methods. , (2019).</li><li>The development and validation of a standard in vitro method to evaluate the efficacy of surface modified urinary catheters. Theses and Dissertations at Montana State University Available from: <a target="_blank" href="https://scholarworks.montana.edu/xmlui/handle/1/15149">https://scholarworks.montana.edu/xmlui/handle/1/15149</a> (2019)</li><li>Hamilton, M. A., Buckingham-Meyer, K., Goeres, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Checking+the+Validity+of+the+harvesting+and+Disaggregating+Steps+in+Laboratory+Tests+of+Surface+Disinfectants.">Checking the Validity of the harvesting and Disaggregating Steps in Laboratory Tests of Surface Disinfectants.</a> Journal of AOAC International. 92 (6), 1755-1762 (2009).</li><li>Conlon, B. P., Rowe, S. E., Lewis, K., Donelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persister+Cells+in+Biofilm+Associated+Infections.">Persister Cells in Biofilm Associated Infections.</a> Biofilm-based Healthcare-associated Infections. , (2015).</li><li>ASTM International. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ASTM+Standard+E2647,+Standard+Test+Method+for+Quantification+of+Pseudomonas+aeruginosa+Biofilm+Grown+Using+Drip+Flow+Biofilm+Reactor+with+Low+Shear+and+Continuous+Flow.">ASTM Standard E2647, Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown Using Drip Flow Biofilm Reactor with Low Shear and Continuous Flow.</a> ASTM International. , (2020).</li><li>Rosenberg, M., Azevedo, N., Ivask, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propidium+iodide+staining+underestimates+viability+of+adherent+bacterial+cells.">Propidium iodide staining underestimates viability of adherent bacterial cells.</a> Scientific Reports. , (2019).</li><li>Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Manuira-Weber, K., Ren, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+aspects+of+using+bacterial+cell+viability+assays+with+the+fluorophores+SYTO9+and+propidium+iodide.">Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide.</a> BMC Microbiology. , (2015).</li><li>Kobayashi, N., Bauer, T. W., Tuohy, M. J., Fujishiro, T., Procop, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+Ultrasonication+Improves+Detection+of+Biofilm-formative+Bacteria+Around+a+Metal+Implant.">Brief Ultrasonication Improves Detection of Biofilm-formative Bacteria Around a Metal Implant.</a> Clinical Orthopaedics and Related Research. 457, 210-213 (2007).</li><li>Lourenco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimum+information+about+a+biofilm+experiment+(MIABiE),+standards+for+reporting+experiments+and+data+on+sessile+microbial+communities+living+at+interfaces.">Minimum information about a biofilm experiment (MIABiE), standards for reporting experiments and data on sessile microbial communities living at interfaces.</a> Pathogens and Disease. , 1-7 (2014).</li><li>Nascentes, C. C., Korn, M., Sousa, C. S., Arruda, M. A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Ultrasonic+Baths+for+Analytical+Applications:+A+New+Approach+for+Optimisation+Conditions.">Use of Ultrasonic Baths for Analytical Applications: A New Approach for Optimisation Conditions.</a> Journal of Brazilian Chemical Society. 12 (1), 57-63 (2001).</li><li>Elma GmbH &amp; Co. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KG+TI-H+Ultrasonic+Cleaning+Units:+Operating+Instructions.">KG TI-H Ultrasonic Cleaning Units: Operating Instructions.</a> Elma GmbH &amp; Co. , (2009).</li><li>Stamper, D. M., Holm, E. R., Brizzolara, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+times+and+energy+densities+for+ultrasonic+disinfection+of+Escherichia+coli,+Pseudomonas+aeruginosa,+Enterococcus+avium+and+sewage.">Exposure times and energy densities for ultrasonic disinfection of Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus avium and sewage.</a> Journal of Environmental Engineering and Science. 7 (2), 139-146 (2008).</li><li>Suslick, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonochemistry.">Sonochemistry.</a> Science. 247 (4949), (1990).</li></ol>

Hasat ve ayrıştırma yöntemleri için minimum bilgi Bilimsel topluluk genelinde tekrarlanabilir biyofilm verileri oluşturmak için, yazarların bir biyofilm yönteminin büyüme, tedavi, örnekleme ve analiz adımlarının her biri ile ilgili mümkün olduğunca fazla ayrıntı içermesi zorunludur. Biyofilm yöntemlerinin standardizasyonu, araştırmacının belirli bir yönteme ve ilgili değişikliklere atıfta bulunmasına izin verdiği için bu çabaya yardımcı olmuştur. Bununla birlikte, ...

Biyofilmin tanımı son birkaç on yılda gelişmiştir ve çeşitli biyolojik ve / veya biyolojik olmayan yüzeylerle mikrobiyal ilişkiyi, bir matris içinde farklı büyüme ve genetik ekspresyon2 gösteren hücresel olmayan bileşenlerin1 dahil edilmesini kapsar. Biyofilm, kurutma gibi çevresel streslerden korunma sağlar ve kimyasal dezenfektanların etkisini mikropların hayatta kalmasına neden olacak şekilde daha az etkili hale getirebilir. Bir biyofilm içinde hayatta kalanlar, potansiyel olarak bir halk sağlığı sorunu olan patojenik mikroorganizmaların bir kaynağını sağlayabilir3.
Biyofilm yöntemleri büyüme, arıtma, örnekleme (hasat ve ayrıştırma) ve analiz olmak üzere dört adımdan oluşur. Kullanıcının organizma büyüme koşullarını, sıcaklığını, ortamını vb. belirlediği ilk adım olan büyüme, biyofilm literatüründe en çok düşünülen ve raporlanan adımdır4,5,6,7. Tedavi adımı, olgun bir biyofilme3,8,9 karşı etkinliklerini belirlemek için antimikrobiyalleri (örneğin, dezenfektanlar) değerlendirir veya antimikrobiyal, ürünün biyofilm büyümesini önleme veya azaltma yeteneğini belirlemek için yüzeye dahil edilebilir10. Üçüncü adım olan örnekleme, biyofilmi üzerinde büyüdüğü yüzeyden toplama ve çıkarılan kümeleri ayrıştırma adımlarını içerir3,8,11. Dördüncü adım olan analiz, canlı hücre sayımlarını, mikroskopiyi, floresan ölçümlerini, moleküler sonuçları ve / veya bir matris bileşeni değerlendirmesini içerebilir8,9. Verilerin değerlendirilmesi, bir deneyin sonucu hakkında bilgi sağlar. Dördü arasında, örnekleme genellikle en çok göz ardı edilen adımdır, çünkü seçilen biyofilm toplama ve / veya ayrıştırma tekniğinin, genellikle doğrulama olmadan% 100 etkili olduğunu varsayar11.
Genellikle homojen olduğu düşünülen bakterilerin planktonik süspansiyonları, analizden önce basit vorteks gerektirir. Bununla birlikte, biyofilmler mikroorganizmalardan (prokaryotik ve / veya ökaryotik), ekzopolisakkaritlerden, proteinlerden, lipitlerden, hücre dışı DNA'dan ve konakçı hücrelerden oluşan karmaşık topluluklardır12. Biyofilmi bir yüzeyden yeterince hasat etmek ve daha sonra homojen bir tek hücreli süspansiyona ayırmak için geleneksel planktonik mikrobiyolojik kültür yöntemlerinin ötesine geçen adımlara ihtiyaç vardır. Kapsamlı bir literatür taraması (bu yayında yer almayan bilgiler), çıkarma ve ayrıştırma tekniğinin seçiminin, biyofilmde bulunan türler, biyofilmin bağlı olduğu yüzey (gözeneksiz veya gözenekli), büyüme yüzeylerine erişilebilirlik (kolayca çıkarılabilir kupon veya biyofilmin büyüdüğü aparatın fiziksel tahribatı) dahil olmak üzere bir dizi faktöre bağlı olduğunu göstermiştir. yüzey geometrisi (alan ve şekil), büyüme yüzeylerinde biyofilm yoğunluğu ve mevcut laboratuvar ekipmanları.
Biyofilm bir yüzeyden toplandığında, ortaya çıkan hücre süspansiyonu heterojendir. Bu düzgün olmayan süspansiyon doğru bir şekilde numaralandırılacaksa, tek tek hücrelere ayrıştırılmalıdır. Canlı plaka sayımları, koloni oluşturan bir birimin bir bakteriden kaynaklandığını varsayar. Biyofilm agregaları büyüme ortamına yerleştirilirse, yanlış tahminlere yol açabilecek bireysel hücreleri ayırt etmek imkansızdır. Örneğin, dezenfektan etkinlik testi sırasında, bir işlem biyofilmi kontrole kıyasla bir yüzeyden çok etkili bir şekilde çıkarırsa, kütük azaltma kontrole kıyasla yapay olarak büyük görünebilir. Öte yandan, biyofilmi kontrole kıyasla bir yüzeye sabitleyen kimyasal bir dezenfektan, daha düşük bir kütük azaltma oranına sahip gibi görünecektir11. Bu tür bir senaryo, deneysel verilerin önyargılı yorumlanmasına yol açabilir.
Yayına hazırlanırken, literatürün gözden geçirilmesi, biyofilmin toplanması ve ayrıştırılmasına yönelik yaygın yaklaşımların kazıma, sürüntü alma, sonikasyon, vorteks veya bunların bir kombinasyonunu içerdiğini belirlemiştir. Kazıma, biyofilmin steril bir çubuk, spatula veya başka bir aletle yüzeylerden fiziksel olarak uzaklaştırılması olarak tanımlanır. Swabbing, biyofilmin pamuklu uçlu bir çubuk veya başka bir sabit emici malzeme ile yüzeylerden uzaklaştırılmasını ifade eder. Sonikasyon, biyofilmin su yoluyla dağıtılan ultrasonik dalgalar yoluyla yüzeylerden bozulmasını ifade eder. Vorteksing, bir tüp içindeki numunenin sıvı vorteksini elde etmek için bir karıştırıcının kullanılmasını ifade eder. Homojenizasyon, hasat edilen biyofilm kümelerini tek bir hücre süspansiyonuna kesmek için döner bıçaklar kullanır. Bu yazıda, sert/gözeneksiz ve gözenekli olmak üzere iki farklı yüzey tipi için üç hasat ve ayrıştırma yöntemi sunulmuştur.
Araştırmacıların yayınların yöntemler bölümlerine dahil etmeleri gereken önerilen asgari bilgilerin bir listesi sağlanır. Bu bilgilerin dahil edilmesinin, diğer araştırmacıların çalışmalarını yeniden üretmelerini sağladığını umuyoruz. Mükemmel bir hasat ve ayrıştırma yöntemi yoktur, bu nedenle tekniğin nasıl kontrol edileceğine dair öneriler de sağlanmaktadır.
Bu makalede, biyofilmi ortak büyüme yüzeylerinden toplamak ve ayrıştırmak için üç yaygın yöntem gösterilmiştir. Bu bilgi, araştırmacıların bir biyofilm test yönteminin genel hassasiyetini ve önyargısını daha iyi anlamalarını sağlayacaktır. Açıklanan yöntemler şunlardır: (1) CDC Biyofilm Reaktöründe yüksek sıvı makası altında polikarbonat kuponlar (sert gözeneksiz yüzey) üzerinde yetiştirilen bir Pseudomonas aeruginosa biyofilmi, biyofilm hasadı ve ayrışması elde etmek için vorteks ve sonikasyonun beş adımlı bir kombinasyonunu takiben hasat edilir ve ayrıştırılır (2) A P. aeruginosa Düşük sıvı makası altında damlama akış reaktöründe borosilikat cam kuponlarda (sert gözeneksiz yüzey) yetiştirilen biyofilm, kazıma ve homojenizasyon kullanılarak toplanır ve ayrıştırılır (3) Silikon boruda (gözenekli yüzey) yetiştirilen bir Escherichia coli biyofilmi, kazıma kullanılarak hasat edilir ve ayrıştırılır, ardından sonikasyon ve vorteks yapılır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>50 mL conical vials</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL glass beakers</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB102100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL serological pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-12D</td>
			<td>For adding treatment to vials containing coupons.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL serological pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-14C</td>
			<td>For adding neutralizer to vials at the end of treatment contact time.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applicator sticks</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostats</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal spatula</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-373</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTFE policemen</td>
			<td>Saint-Gobain</td>
			<td>06369-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S 10 N - 10 G - ST Dispersing tool</td>
			<td>IKA</td>
			<td>4446700</td>
			<td>For homogenization of biofilm samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-951-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Foley catheter, size 16 French</td>
			<td>Medline Industries</td>
			<td>DYND11502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone tubing, size 16</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW96400-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Splash Guards</td>
			<td>BioSurface Technologies, Inc.</td>
			<td>CBR 2232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T 10 basic ULTRA-TURRAX Disperser</td>
			<td>IKA</td>
			<td>3737001</td>
			<td>For homogenization of biofilm samples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing connectors</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW02023-86</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Elma</td>
			<td>TI-H15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex-Genie 2 Vertical 50 mL Tube Holder</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-V506</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

harvesting and disaggregation: an overlooked step in biofilm methods research

Biyofilm yöntemleri dört ayrı adımdan oluşur: biyofilmi ilgili bir modelde büyütmek, olgun biyofilmi işlemek, biyofilmi yüzeyden toplamak ve kümeleri ayırmak ve numuneyi analiz etmek. Dört adımdan, hasat ve ayrıştırma en az çalışılan, ancak test yanlılığı potansiyeli göz önüne alındığında yine de kritik olanıdır. Bu makalede, üç farklı yüzeyde yetiştirilen biyofilm için yaygın olarak kullanılan hasat ve ayrıştırma teknikleri gösterilmektedir. Kapsamlı bir literatür taramasından toplanan üç biyofilm toplama ve ayrıştırma tekniği, vorteks ve sonikasyon, kazıma ve homojenizasyon ve kazıma, vorteks ve sonikasyonu içerir. İki yüzey tipi göz önünde bulundurulur: sert gözeneksiz (polikarbonat ve borosilikat cam) ve gözenekli (silikon). Ek olarak, izlenen hasat tekniğini bildirirken dahil edilmesi gereken minimum bilgiler ve önyargıyı kontrol etmek için eşlik eden bir yöntem için önerilerde bulunuyoruz.

Bir Hasat Yönteminin Doğrulanması/Onaylanması Laboratuvarımızda yapılan çeşitli çalışmalar, Tek Tüp Yöntemi (ASTM E2871) 8 kullanılarak biyofilm reaktöründe (ASTM E2562)2 yetiştirilen biyofilmi etkili bir şekilde hasat etmek için vorteks ve sonikasyon yeteneğini incelemiştir.
Bir P. aeruginosa ATCC 15442 biyofilmi, borosilikat cam kuponlar üzerinde ASTM E25622'ye göre yetiştirildi.<sup class="...

Watch this Scientific Journal Video about Harvesting and Disaggregation: An Overlooked Step in Biofilm Methods Research at JoVE.com

Harvesting and Disaggregation: An Overlooked Step in Biofilm Methods Research

Bu yazıda, iki yüzey tipinde üç yaygın biyofilm toplama ve ayrıştırma tekniğini gösteren yöntemler, bir hasat yönteminin sağlamlık testi ve tekrarlanabilirliği artırmak için hasat ve ayrıştırma tekniklerini seçerken ve optimize ederken göz önünde bulundurulması gereken minimum bilgiler açıklanmaktadır.

Hasat ve Ayrıştırma: Biyofilm Yöntemleri Araştırmalarında Gözden Kaçan Bir Adım

Biofilm methods consist of four distinct steps: growing the biofilm in a relevant model, treating the mature biofilm, harvesting the biofilm from the ...

Bu prosedürlerin genel amacı, tekrarlanabilirliği artırmak için biyofilmleri en uygun şekilde toplamak ve ayrıştırmaktır. Bu videoda, her biri farklı bir yüzey türünden hasat ve ayrıştırmaya odaklanan üç teknik gösterilecektir. Bu video, CDC biyofilm reaktöründen bir polikarbonat kupon gibi sert gözeneksiz bir yüzeyden vorteks ve sonikasyon biyofilmi için uygun teknikleri gösterecektir.İkincisi, biyofilmin damlama akış reaktöründe yaygın olarak bulunan sert gözeneksiz borosilikat cam yüzeyden kazınması ve homojenleştirilmesi. Üçüncüsü, kateter modelinde yaygın olarak bulunan gözenekli bir silikon boru yüzeyinden biyofilmin kazınması, girdablanması ve sonikleştirilmesi. Merhaba, benim adım Kelly Buckingham-Meyer burada, Standardize Biofilm Methods Lab'de.Laboratuvarımızda biyofilm yöntemlerini dört bileşene ayırıyoruz: büyüme, arıtma, örnekleme ve analiz. Hakemli literatürde, biyofilmlerin nasıl örneklendiği veya hasat edildiği ve bir yüzeyden nasıl ayrıştırıldığına dair detaylar tipik olarak seyrektir. Bu videonun nedeni budur.Laboratuvarımız standartlaştırılmış biyofilm yöntemleri geliştirip test ettiğinden, en yaygın üç biyofilm toplama ve ayrıştırma yönteminin tanımlandığı kapsamlı bir literatür taraması yaptık. Bu yöntemler, bir polikarbonat kupondan biyofilmi vorteksleme ve sonikleştirme, borosilikat cam kupondan biyofilmi kazıma ve homojenleştirme ve silikon borudan biyofilmi kazıma, vorteks ve sonikleştirmedir. Kağıda yazılmış yöntemler güçlü olsa da, iş arkadaşım Lindsey Miller ve ben tarafından sunulan teknik ayrıntıları içeren videonun yardımcı olacağını umuyoruz.Başlamak için, CDC Biyofilm Reaktörü kullanılarak Yüksek Kesme ve Sürekli Akış ile Yetiştirilen Pseudomonas aeruginosa Biyofilminin Niceliği için Standart Test Yöntemi olan ASTM Standardı E2562'ye göre olgun Pseudomonas aeruginosa 15442 biyofilmini büyütün. 48 saatlik büyüme süresinin sonunda, kuponları ASTM Standardı E2871'e göre, CDC Biyofilm Reaktöründe Tek Tüp Yöntemi Kullanılarak Yetiştirilen Biyofilme Karşı Dezenfektan Etkinliğini Belirlemek İçin Standart Test Yöntemine göre işlemeye ve numune almaya hazırlanın. Daha sonra otoklavlanmış sıçrama korumalarını, alevle sterilize edilmiş forseps kullanarak steril 50 mililitrelik konik tüplere aseptik olarak yerleştirin.Tedavi görecek tüm tüpler için tekrarlayın. Kontrol kuponları için tüplerin bir sıçrama korumasına ihtiyacı yoktur. CDC biyofilm reaktöründen bir çubuğu aseptik olarak çıkarın ve 30 mililitre steril seyreltme suyunda durulayın.Bu, gevşek bir şekilde bağlanmış hücreleri biyofilmden çıkaracaktır. Çubuğu, sıçrama korumaları olan numune tüplerinin üzerinde tezgah üstüne paralel tutun. Alevle sterilize edilmiş bir Allen anahtarı kullanarak, biyofilm kaplı bir kuponu tüpe düşürmek için set vidalarını gevşetin.İstediğiniz kupon sayısı için tekrarlayın. Sıçrama korumalarını çıkarın ve sıçrama korumalarını sterilizasyon için ayrı bir kaba yerleştirin. Beş mililitrelik bir serolojik pipet kullanarak, sıvının tüpün duvarının iç kısmından aşağı akması için tüplere yavaşça dört mililitre işlem veya kontrol pipetin.Kuponun altındaki hava kabarcıklarının yer değiştirmesi için tüpün tabanını yavaşça döndürün. Her ekleme arasında 30 ila 60 saniye bekleyin. Belirtilen temas süresinin sonunda, pipet, 36 mililitre nötrleştirici ile aynı sırayla tüplere tedavi veya kontrol uygulandı.Her tüpü 30 artı veya eksi beş saniye boyunca en yüksek ayarda vorteks yapın ve tam bir vorteks elde edilmesini sağlayın. Tüpleri, gazdan arındırılmış sonikatörde asılı olan tüp rafına, banyodaki su seviyesi, tüplerdeki su seviyesine eşit olacak şekilde yerleştirin. Örnekleri 45 kilohertz,% 100 güç ve 30 artı veya eksi beş saniye boyunca normal fonksiyonda sonikleştirin.Vorteks ve sonikasyon döngülerini tekrarlayın ve toplam beş döngü için son bir vorteks ile bitirin. Son olarak, numuneyi seri olarak seyreltin, seyreltmeyi R2A agar üzerine yerleştirin ve plakaları 36 santigrat derecede 24 saat boyunca inkübe edin. Kolonileri kaplama yöntemine uygun olarak sayın ve verileri kaydedin.Bu bir sonraki biyofilm toplama ve ayrıştırma tekniği, damlama akışı reaktöründe standart olan sert gözeneksiz kuponlar için yararlıdır. ASTM Standardı E2647'ye göre olgun bir Pseudomonas aeruginosa 15442 biyofilmi yetiştirin Düşük Kesme ve Sürekli Akışlı Damlama Akışlı Biyofilm Reaktörü Kullanılarak Yetiştirilen Pseudomonas aeruginosa Biyofilminin Niceliği için Standart Test Yöntemi. Numune alma istasyonunu bir numune alma panosu, bir beherde% 95 etanol, bir alkol brülörü, hemostatlar, bir kupon çıkarma aracı, steril seyreltme suyu içeren beherler ve kuponları durulamak için seyreltme tüpleri içerecek şekilde ayarlayın.Pompayı kapatın, kanal kapağını çıkarın ve biyofilmi rahatsız etmemeye dikkat ederek kuponu çıkarmak için steril kupon çıkarma aleti ve hemostatlar kullanın. 50 mililitrelik bir santrifüj tüpünde bulunan 45 mililitre steril seyreltme suyuna sıvı bir hareketle hafifçe daldırarak kuponu durulayın. Kuponu kaldırmak için hareketi hemen tersine çevirin.Kuponu 45 mililitre steril seyreltme suyu içeren bir beherin içine yerleştirin. Biyofilm kaplı kupon yüzeyini, steril bir spatula veya kazıyıcı kullanarak yaklaşık 15 saniye boyunca aşağı yönde kazıyın. Spatula veya kazıyıcıyı beherde karıştırarak durulayın.Kazıma ve durulama işlemini üç ila dört kez tekrarlayın ve kupon yüzeyinin tam olarak kaplanmasını sağlayın. Kuponu steril kabın üzerinde 60 derecelik bir açıyla tutarak ve kuponun yüzeyine bir mililitre steril seyreltme suyu pipetleyerek, durulayın. Toplam beş durulama için tekrarlayın.Beherdeki son hacim şimdi 50 mililitredir. Biyogüvenlik kabininde çalışarak, kazınmış biyofilm numunesini homojenize edin. Homojenizatöre steril bir homojenizatör probu takın.Prob ucunu sıvıya yerleştirin ve homojenizatörü açın ve 20.500 RPM'ye kadar yükseltin. Numuneyi 30 saniye boyunca homojenize edin. RPM'yi kapatın ve homojenizatörü kapatın.Yukarıda açıklandığı gibi 20.500 RPM'de dokuz mililitrelik steril seyreltme boşluğunda 30 saniye boyunca homojenize ederek biyofilm numuneleri arasındaki probu sterilize edin. Dokuz mililitrelik bir 70% etanol tüpünü 30 saniye boyunca homojenize edin ve probu ayırın ve bir dakika boyunca etanol tüpünde bekletin. İki ek seyreltme boşluğunu homojenize edin.Ayrıca, her numune için steril tek kullanımlık homojenizatör probu kullanılabilir. Homojenize numuneyi seri olarak seyreltin, uygun kaplama yöntemini kullanarak seyreltmeleri R2A üzerine plakalayın ve plakaları 36 santigrat derecede 24 saat boyunca inkübe edin. Kolonileri sayın ve verileri kaydedin.Bu son biyofilm toplama ve ayrıştırma tekniği, kateter modelinde kullanılan silikon boru gibi gözenekli borularda yetiştirilen biyofilm için yararlıdır. Bu prosedüre başlamak için, silikon kateter borusunda olgun bir E.coli 53498 biyofilm yetiştirin. Numune alma malzemelerini hazırlayın: durulanmış tüpler, steril bir santrifüj tüpü, boş bir steril Petri kabı, alevle sterilize edilmiş paslanmaz çelik hemostatlar, makas, zamanlayıcı ve cetvel.Pompa duraklatıldığında, borunun dışını temizlemek için% 70 etanol kullanın. Konektöre bağlı alandan kaçınarak uçtan iki santimetre ölçün ve kesme yerlerini belirlemek için boruyu işaretleyin. Alevle sterilize edilmiş makasla boruyu iki santimetre işaretinde kesin.Planktonik hücreleri çıkarmak için boru segmentini durulayın. Alevle sterilize edilmiş forsepslerle, boru segmentini nazikçe 20 mililitre steril seyreltme suyuna batırın, ardından hemen çıkarın. Segmenti 10 mililitre nötrleştiriciye yerleştirin.Alevle sterilize edilmiş forsepslerle, boru segmentini tutun ve borunun tüm iç alanları kazınana kadar steril bir ahşap aplikatör çubuğu ile kazıyın. Bazen çubuğu 10 mililitre nötrleştirici içinde durulayın ve segmenti numune tüpüne geri yerleştirin. Kazınmış boru segmenti artık 10 ila sıfır veya sıfır seyreltmedir.Her tüpü 30 artı veya eksi beş saniye boyunca en yüksek ayarda vorteksleyin. Tüpleri, sonikatör banyosunda asılı olan tüp rafına yerleştirin, böylece banyodaki su seviyesi tüplerdeki sıvı seviyesine eşit olacaktır. 45 kilohertz,% 100 güç ve 30 artı veya eksi beş saniye boyunca normal işlevde sonikasyon.Bu vorteks ve sonikasyon döngüsünü tekrarlayın, ardından son vorteks ile bitirin. Numuneleri tamponlanmış suda seri olarak seyreltin. Uygun kaplama yöntemini kullanarak triptik soya agar üzerine plaka yapın ve daha sonra tüpleri 24 saat boyunca 36 artı veya eksi iki santigrat derecede inkübe edin.Kolonileri kullanılan kaplama yöntemine uygun olarak sayın ve aritmetik ortalamayı hesaplamak için verileri kaydedin. Danielle Or ve Blaine Fritz tarafından çekilen bu dört görüntü, bu hasat ve ayrıştırma prosedürünün önemini göstermeye yardımcı oluyor. Bu kuponların dördü de, vorteks ve sonikasyon işleminden önce ve sonra kuponlarda bulunan Pseudomonas aeruginosa biyofilm miktarını görselleştirmeye yardımcı olmak için kristal menekşe ile boyanmıştır.Kupon A tamamen biyofilm ile kaplıdır, B, C ve D kuponlarının hepsi yüzeylerinde önemli ölçüde daha az biyofilme sahiptir. Kuponlar B, C ve D, daha önce açıklanan vorteks ve sonikasyon sürecine tabi tutuldu. Lindsey Miller tarafından 12.5X büyütmede konfokal mikroskopta çekilen bu iki görüntü, arka ışık canlı / ölü lekesi ile muamele edilen bir Pseudomonas aeruginosa biyofilmini göstermektedir.Soldaki görüntü 45 kilohertz ve% 10 güçte sonikleştirilirken, sağdaki görüntü 45 kilohertz ve% 100 güçte sonikleştirildi. Açıkçası, soldaki kupon, sağdaki kupona kıyasla yüzeyinde çok daha fazla biyofilm kalmaktadır. Bu son şekil, farklı sonikasyon parametrelerinin manipülasyonunun, kupon yüzeyinden çıkarılan Pseudomonas aeruginosa biyofilm miktarını nasıl etkilediğini göstermektedir.Tüm bu kuponlar 45 kilohertz,% 100 güç ve normal ayarda 30 artı veya eksi beş saniye boyunca sonikleştirildi. Bu görüntüler Lindsey Miller tarafından 12.5X büyütmede çekildi. Birinci sıradaki kuponlar seyreltme suyunda sonikleştirilirken, ikinci sıradaki kuponlar DE nötrleştirici et suyunda sonikleştirildi.Seyreltme suyuna kıyasla bir yüzey aktif madde içeren DE suyunda sonikleştirilen kuponlarda daha az biyofilm kaldığı görülmektedir. A, B, E ve F kuponlarının hepsi 10 mililitrelik bir hacimde sonikleştirilirken, C, D, G ve H kuponları 40 mililitre çözelti içinde sonikleştirildi. Daha küçük hacimlerde sonikleştirilen kuponlarda açıkça daha az biyofilm var.A, C, E ve G kuponları banyoda aynı anda üç tüple sonikleştirilirken, B, D, F ve H kuponları aynı anda 12 tüplü bir banyoda sonikleştirildi. Daha az tüple sonikleştirilen örneklerin üstün biyofilm hasadı sergilediği görülmektedir. Nihayetinde, tüplerdeki hacmi en aza indirmek, bir kerede sonikleştirilen tüp sayısını azaltmak ve DE nötralize edici et suyunun kullanılması, gelişmiş biyofilm hasadına katkıda bulunuyor gibi görünmektedir.Biyofilmi hasat etmek ve ayrıştırmak için mükemmel bir yöntem yoktur, ancak bazı yaklaşımlar farklı yüzeyler ve / veya uygulamalar için daha iyidir. Bu videoda gösterilen teknikler, literatür taramasına göre en yaygın üç yöntemdir. Bu üç teknik, araştırmacılar için bir başlangıç noktası sağlayabilir.Seçilen hasat ve ayrıştırma yöntemini doğrulamak için zaman ayırmak önemlidir. Tüm ekipman biraz farklıdır, bu nedenle yöntem standartlaştırılmış olsa bile, kullanılan ekipman için işlemi onaylamak hala ihtiyatlıdır. Araştırmalar, yanlış seçimlerin önyargılı test sonuçlarına yol açabileceğini göstermiştir.Bu videoyu izledikten sonra, bu bilgiler araştırmacıların hangi yöntemin kullanılacağı konusunda daha bilinçli kararlar vermelerine yardımcı olacak ve üç yüzey tipi için tekrarlanabilirliği ve ücretsiz hasat ve ayrıştırma tekniklerini iyileştirme konusunda rehberlik sağlayacaktır.

Research

JoVE Journal

Biology

Harvesting Sperm and Artificial Insemination of Mice

Farelerin Hasat Sperm ve Suni Tohumlama

Rodents of the genus Peromyscus (deer mice) are the most prevalent native North American mammals.  Peromyscus species are used in a wide range of research ...

A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles

Nanodisc Lipid Parçacıklar içine bir ABC Transporter Sulandırma için bir adım-adım yöntemi

The nanodisc is a discoidal particle (~ 10-12 nm large) that trap membrane proteins into a small patch of phospholipid bilayer. The nanodisc is a ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Temel<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Yöntem: Senkronizasyon ve Gözlem

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

Bitkiler ve Yeşil Alg Işık hasat Kompleksleri İn Vitro Sulandırma içinde

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls ...

Efficient Mammalian Cell Expression and Single-step Purification of Extracellular Glycoproteins for Crystallization

Verimli memeli hücre ekspresyon ve Kristalizasyon için hücre dışı Glikoproteinlerin Tek aşamalı saflaştırma

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time ...

An In Vitro Model to Study the Effect of 5-Aminolevulinic Acid-mediated Photodynamic Therapy on Staphylococcus aureus Biofilm

An In Vitro Model to Study the Effect of 5-Aminolevulinic Acid-mediated Photodynamic Therapy on Staphylococcus aureus Biofilm

5-Aminolevulinik asit-aracılı Fotodinamik Tedavi etkisi Staphylococcus aureus biyofilm çalışmaya bir In Vitro modeli

Staphylococcus aureus (S. aureus) is a common human pathogen, which causes pyogenic and systemic infections. S. aureus infections are difficult to ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

İki adımlı PCR ve Yeni Nesil 16S rRNA Gen Sıralaması Kullanarak Mikrobiyota Analizi

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

A Step-by-Step Guide to Mosquito Electroantennography

Sivrisinek elektroantennografisi için adım adım kılavuz

Female mosquitoes are the deadliest animals on earth, claiming the lives of more than 1 million people every year due to pathogens they transmit when ...

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

SARS-CoV-2 Tespiti ve Ölçümü için İki Adımlı Ters Transkripsiyon Damlacığı Dijital PCR Protokolleri

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...

A Step-By-Step Method to Detect Neutralizing Antibodies Against AAV using a Colorimetric Cell-Based Assay

Kolorimetrik Hücre Tabanlı Bir Test Kullanarak AAV'ye Karşı Nötralize Edici Antikorları Tespit Etmek İçin Adım Adım Bir Yöntem

Recombinant adeno-associated viruses (rAAV) have proven to be a safe and successful vector for transferring genetic material to treat various health ...