Name: directed differentiation of hemogenic endothelial cells from human pluripotent stem cells
Uploaded: 2021-03-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Directed Differentiation of Hemogenic Endothelial Cells from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door NIH-subsidies HL128064 en U2EB017103. Verdere ondersteuning werd geboden door CT Innovations 15-RMB-YALE-04 subsidie.

1. Reagentia en reagensbereiding
OPMERKING: Een lijst met reagentia is opgenomen in de tabel met materialen.
<ol><li>Verkrijg de menselijke pluripotente stamcellijnen: H1-hESC, H9-Fucci-hESC. OPMERKING: Het genereren van hemogene EC's kan efficiënter zijn in de H1-cellijn.</li>
	<li>Bereid matrixeiwitvoorraden voor: Aliquot het matrixeiwit in voorgekoelde buisjes van 1,5 ml (op ijs) zodat elke buis 1 mg matrixeiwit bevat. 1 mg matrixeiwit is voldoende om alle putten van ...

<ol>
	<li>Giacomelli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cardiac+microtissues+composed+of+cardiomyocytes+and+endothelial+cells+co-differentiated+from+human+pluripotent+stem+cells.">Three-dimensional cardiac microtissues composed of cardiomyocytes and endothelial cells co-differentiated from human pluripotent stem cells.</a> Development. 144 (6), 1008-1017 (2017).</li><li>Wu, J., Wu, Z., Xue, Z., Li, H., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHBV/bioglass+composite+scaffolds+with+co-cultures+of+endothelial+cells+and+bone+marrow+stromal+cells+improve+vascularization+and+osteogenesis+for+bone+tissue+engineering.">PHBV/bioglass composite scaffolds with co-cultures of endothelial cells and bone marrow stromal cells improve vascularization and osteogenesis for bone tissue engineering.</a> RSC Advances. 7 (36), 22197-22207 (2017).</li><li>Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvasculature:+An+essential+component+for+organ-on-chip+systems.">Microvasculature: An essential component for organ-on-chip systems.</a> MRS Bulletin. 39 (1), 51-59 (2014).</li><li>Gritz, E., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+and+function+of+hemogenic+endothelium+during+embryogenesis.">Specification and function of hemogenic endothelium during embryogenesis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (8), 1547-1567 (2016).</li><li>Williams, I. M., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+endothelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells:+Methods,+considerations,+and+applications.">Generation of endothelial cells from human pluripotent stem cells: Methods, considerations, and applications.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (7), 1317-1329 (2019).</li><li>Olmer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+functional+endothelial+cells+in+scalable+suspension+culture.">Differentiation of human pluripotent stem cells into functional endothelial cells in scalable suspension culture.</a> Stem Cell Reports. 10 (5), 1657-1672 (2018).</li><li>Cossu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lancet+Commission:+Stem+cells+and+regenerative+medicine.">Lancet Commission: Stem cells and regenerative medicine.</a> The Lancet. 391 (10123), 883-910 (2018).</li><li>Fox, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+differentiated+pluripotent+stem+cells+in+replacement+therapy+for+treating+disease.">Use of differentiated pluripotent stem cells in replacement therapy for treating disease.</a> Science. 345 (6199), 1247391 (2014).</li><li>Mahla, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+applications+in+regenerative+medicine+and+disease+therapeutics.">Stem cells applications in regenerative medicine and disease therapeutics.</a> International Journal of Cell Biology. 2016, 1-24 (2016).</li><li>Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+as+a+disease+modeling+and+drug+screening+platform.">Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).</li><li>Rowe, R. G., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery.">Induced pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nature Reviews Genetics. 20 (7), 377-388 (2019).</li><li>Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+diseases+with+induced+pluripotent+stem+cells:+from+2D+to+3D+and+beyond.">Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond.</a> Development. 145 (5), (2018).</li><li>Wnorowski, A., Yang, H., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress,+obstacles,+and+limitations+in+the+use+of+stem+cells+in+organ-on-a-chip+models.">Progress, obstacles, and limitations in the use of stem cells in organ-on-a-chip models.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 3-11 (2019).</li><li>Ramme, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+induced+pluripotent+stem+cell-derived+four-organ-chip.">Autologous induced pluripotent stem cell-derived four-organ-chip.</a> Future Science OA. 5 (8), 1-12 (2019).</li><li>Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organs-on-a-Chip:+A+fast+track+for+engineered+human+tissues+in+drug+development.">Organs-on-a-Chip: A fast track for engineered human tissues in drug development.</a> Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).</li><li>Kane, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+endothelial+cells+from+human+embryonic+stem+cells+by+directed+differentiation:+analysis+of+microrna+and+angiogenesis+in+vitro+and+in+vivo.">Derivation of endothelial cells from human embryonic stem cells by directed differentiation: analysis of microrna and angiogenesis in vitro and in vivo.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 30 (7), 1389-1397 (2010).</li><li>Costa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+endothelial+cells+from+human+embryonic+stem+cells+in+fully+defined+medium+enables+identification+of+lysophosphatidic+acid+and+platelet+activating+factor+as+regulators+of+eNOS+localization.">Derivation of endothelial cells from human embryonic stem cells in fully defined medium enables identification of lysophosphatidic acid and platelet activating factor as regulators of eNOS localization.</a> Stem Cell Research. 10 (1), 103-117 (2013).</li><li>Nguyen, M. T. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+endothelial+progenitor+cells+on+laminins+in+defined+and+xeno-free+systems.">Differentiation of human embryonic stem cells to endothelial progenitor cells on laminins in defined and xeno-free systems.</a> Stem Cell Reports. 7 (4), 802-816 (2016).</li><li>Ikuno, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+robust+differentiation+of+endothelial+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+via+lineage+control+with+VEGF+and+cyclic+AMP.">Efficient and robust differentiation of endothelial cells from human induced pluripotent stem cells via lineage control with VEGF and cyclic AMP.</a> PLOS One. 12 (3), 0173271 (2017).</li><li>Aoki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+and+purification+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+endothelial+progenitor+cells+and+expansion+with+the+use+of+inhibitors+of+ROCK,+TGF-B,+and+GSK3B.">Efficient differentiation and purification of human induced pluripotent stem cell-derived endothelial progenitor cells and expansion with the use of inhibitors of ROCK, TGF-B, and GSK3B.</a> Heliyon. 6 (3), 03493 (2020).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+endothelial+progenitors+via+small-molecule+activation+of+Wnt+signaling.">Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of Wnt signaling.</a> Stem Cell Reports. 3 (5), 804-816 (2014).</li><li>Orlova, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation,+expansion+and+functional+analysis+of+endothelial+cells+and+pericytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation, expansion and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 9 (6), 1514-1531 (2014).</li><li>Kusuma, S., Gerecht, S., Turksen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+endothelial+cells+and+pericytes+from+human+pluripotent+stem+cells.">Derivation of endothelial cells and pericytes from human pluripotent stem cells.</a> Human Embryonic Stem Cell Protocols. , 213-222 (2014).</li><li>Bao, X., Lian, X., Palecek, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+endothelial+progenitor+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+wnt+activation+under+defined+conditions.">Directed endothelial progenitor differentiation from human pluripotent stem cells via wnt activation under defined conditions.</a> Methods in Molecular Biology. 1481, 183-196 (2016).</li><li>Xu, M., He, J., Zhang, C., Xu, J., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+derivation+of+endothelial+lineages+from+human+stem+cells.">Strategies for derivation of endothelial lineages from human stem cells.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 10 (1), 200 (2019).</li><li>Arora, S., Yim, E. K. F., Toh, Y. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+specification+of+pluripotent+stem+cell+derived+endothelial+cells+toward+arterial+and+venous+subtypes.">Environmental specification of pluripotent stem cell derived endothelial cells toward arterial and venous subtypes.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 143 (2019).</li><li>Fang, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-induced+Notch-Cx37-p27+axis+arrests+endothelial+cell+cycle+to+enable+arterial+specification.">Shear-induced Notch-Cx37-p27 axis arrests endothelial cell cycle to enable arterial specification.</a> Nature Communications. 8 (1), 2149 (2017).</li><li>Dalton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+the+cell+cycle+to+cell+fate+decisions.">Linking the cell cycle to cell fate decisions.</a> Trends in Cell Biology. 25 (10), 592-600 (2015).</li><li>Wolf, K., Hu, H., Isaji, T., Dardik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identity+of+arteries,+veins,+and+lymphatics.">Molecular identity of arteries, veins, and lymphatics.</a> Journal of Vascular Surgery. 69 (1), 253-262 (2019).</li><li>Rocha, S. F., Adams, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+differentiation+and+specialization+of+vascular+beds.">Molecular differentiation and specialization of vascular beds.</a> Angiogenesis. 12 (2), 139-147 (2009).</li><li>Goldie, L. C., Lucitti, J. L., Dickinson, M. E., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+signaling+directing+the+formation+and+function+of+hemogenic+endothelium+during+murine+embryogenesis.">Cell signaling directing the formation and function of hemogenic endothelium during murine embryogenesis.</a> Blood. 112 (8), 3194-3204 (2008).</li><li>Chanda, B., Ditadi, A., Iscove, N. N., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+signaling+is+essential+for+embryonic+hematopoietic+stem+cell+development.">Retinoic acid signaling is essential for embryonic hematopoietic stem cell development.</a> Cell. 155 (1), 215-227 (2013).</li><li>Marcelo, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemogenic+endothelial+cell+specification+requires+c-kit,+notch+signaling,+and+p27-mediated+cell-cycle+control.">Hemogenic endothelial cell specification requires c-kit, notch signaling, and p27-mediated cell-cycle control.</a> Developmental Cell. 27 (5), 504-515 (2013).</li><li>Dejana, E., Hirschi, K. K., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+of+endothelial+cell+plasticity.">The molecular basis of endothelial cell plasticity.</a> Nature Communications. 8 (1), 14361 (2017).</li><li>Ottersbach, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial-to-haematopoietic+transition:+an+update+on+the+process+of+making+blood.">Endothelial-to-haematopoietic transition: an update on the process of making blood.</a> Biochemical Society Transactions. 47 (2), 591-601 (2019).</li><li>Pauklin, S., Vallier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell-cycle+state+of+stem+cells+determines+cell+fate+propensity.">The cell-cycle state of stem cells determines cell fate propensity.</a> Cell. 155 (1), 135-147 (2013).</li><li>Qiu, J., Nordling, S., Vasavada, H. H., Butcher, E. C., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+promotes+endothelial+cell+cycle+early+g1+state+to+enable+human+hemogenic+endothelial+cell+specification.">Retinoic acid promotes endothelial cell cycle early g1 state to enable human hemogenic endothelial cell specification.</a> Cell Reports. 33 (9), 108465 (2020).</li><li>Sriram, G., Tan, J. Y., Islam, I., Rufaihah, A. J., Cao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+arterial+and+venous+endothelial+cells+under+feeder-+and+serum-free+conditions.">Efficient differentiation of human embryonic stem cells to arterial and venous endothelial cells under feeder- and serum-free conditions.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 6 (1), 261 (2015).</li><li>Ohta, R., Sugimura, R., Niwa, A., Saito, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemogenic+endothelium+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+in+a+feeder-+and+xeno-free+defined+condition.">Hemogenic endothelium differentiation from human pluripotent stem cells in a feeder- and xeno-free defined condition.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59823 (2019).</li><li>Galat, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine-free+directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+efficiently+produces+hemogenic+endothelium+with+lymphoid+potential.">Cytokine-free directed differentiation of human pluripotent stem cells efficiently produces hemogenic endothelium with lymphoid potential.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 8 (1), 67 (2017).</li><li>Sidney, L. E., Branch, M. J., Dunphy, S. E., Dua, H. S., Hopkinson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Evidence+for+CD34+as+a+common+marker+for+diverse+progenitors.">Concise review: Evidence for CD34 as a common marker for diverse progenitors.</a> Stem Cells. 32 (6), 1380-1389 (2014).</li></ol>

Hierin worden de stappen beschreven voor het produceren van hemogene endotheelcellen uit menselijke embryonale stamcellen in ongeveer 1 week met behulp van een muizenvoeder- en serumvrij 2D-kweeksysteem (figuur 1). Dit protocol borduurt voort op een methode beschreven door Sriram et al. (2015) om primordiale EC's38 te verkrijgen. De primordiale aard en het specificatiepotentieel van de CD31+ CD45-EC's wordt aangetoond door deze cellen op DLL4-gecoate platen...

Endotheelcellen (EC's) zijn een heterogene populatie van cellen die meerdere functies vervullen in het menselijk lichaam en in gemanipuleerde weefsels. Naast het ondersteunen en reguleren van andere celtypen (d.w.z. cardiomyocyten1, osteoblastische cellen2), omvatten deze functies het vormen van een selectieve barrière tussen bloed en weefsels en het helpen bij weefselvorming3. Differentiatie van volwassen EC's tijdens de normale ontwikkeling vereist diverse signaalroutes. Primordiale EC's zijn afgeleid van mesoderm-voorlopers en worden vervolgens gespecificeerd in de richting van volwassen arteriële, veneuze, capillaire en lymfatische fenotypen4. Bovendien wordt ook een kleine subset van EC's in het extra-embryonale dooierzak- en embryonale Aorta-Gonad-Mesonephros (AGM) -gebied gespecificeerd om hemogene EC's te worden, die aanleiding geven tot hematopoietische stam- en voorlopercellen (HSPC's) die migreren naar de foetale lever en het foetale beenmerg, waar ze postnataal blijven en alle bloedceltypen gedurende het hele leven genereren4. Het gevarieerde scala aan EC-fenotypen is essentieel voor alle weefselontwikkeling en -onderhoud.
ECs en hun derivaten zijn dus kritische componenten van studies gericht op het modelleren en ophelderen van mechanismen van menselijke ontwikkeling en / of ziekte, evenals regeneratieve geneeskunde en weefselmanipulatietoepassingen 5,6,7,8. De belangrijkste beperking voor dit soort studies is echter het gebrek aan beschikbaarheid van primaire menselijke EC's in de vereiste hoeveelheid. Geschat wordt dat voor de meeste therapeutische toepassingen minimaal 3 x 108 EC's nodig zouden zijn6. Om dit probleem op te lossen, is het gebruik van menselijke embryonale stamcellen (hESCs) en door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) voorgesteld vanwege hun gevarieerde afstammingspotentieel en hun vermogen om grote aantallen nakomelingen te genereren 6,9.
Inderdaad, het nut van cellen afgeleid van hESCs of hiPSC's is aangetoond in meerdere studies gericht op ziektemodellering en medicijnscreening 10,11,12. Organ-on-a-Chip (OOC) -technologie is gebruikt om de fysiologie van het menselijk lichaam getrouwer samen te vatten door cellen en weefsels te integreren in driedimensionale steigers. Bovendien kan verbinding van meerdere individuele OIC's (een zogenaamde body- of human-on-a-chip, BOC / HOC) worden bereikt via microfluïdica om kruisverwijzing tussen de organen van belang mogelijk te maken 13,14,15. Ondersteunende weefsels, zoals de vasculatuur, zijn kritieke componenten van OAG's en BOC / HOCs; het opnemen van vasculatuur maakt het transport van voedingsstoffen, zuurstof en paracriene factoren door de weefsels mogelijk, waardoor de vereiste weefselspecifieke micro-omgeving wordt bevorderd 3,12. Methoden voor het afleiden van volwassen menselijke EC's, zoals arteriële, veneuze, lymfatische en hemogene EC's, zijn dus cruciaal voor het bevorderen van deze weefselmanipulatiebenaderingen.
Er zijn meerdere protocollen gepubliceerd met gedetailleerde stappen voor de afleiding van menselijke primordiale of voorloper-EC's van hESCs of hiPSCs 5,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 . Veel van deze protocollen zijn afhankelijk van embryoïde lichaamsvorming (EB) of co-cultuur van SER's / iPSC's met een muizentoevoerlaag van stromale cellen. Deze strategieën zijn vaak moeilijk en tijdrovend, met lage EC-opbrengsten en/of besmetting van menselijke EC's met muizencellen. Protocollen die strikt afhankelijk zijn van 2D-cultuur zonder het gebruik van stromale cellen vereisen vaak lange inducties, gebruiken complexe combinaties van groeifactoren en / of remmers voor inductie, hebben langere expansieperioden na celscheiding of een combinatie van deze factoren. De voortschrijdende kennis van signaalroutes en factoren die betrokken zijn bij de afleiding van volwassen EC-typen in vivo biedt de basis voor een eenvoudig en robuust in vitro differentiatieprotocol.
Eerder werden belangrijke rollen voor notch- en retinoïnezuur (RA) signaleringsroutes geïdentificeerd in de specificatie van respectievelijk muriene arteriële en hemogene EC's tijdens de ontwikkeling. De Notch-signaleringsroute speelt meerdere rollen bij de specificatie en het onderhoud van het arteriële EC-fenotype. Werk met behulp van het murine retinale vascularisatiemodel identificeerde een route waarin vloeistofschuifspanning een Notch-Cx37-p27-signaleringsas induceert, waardoor G1-celcyclusstilstand wordt bevorderd, wat arteriële EC-specificatie27 mogelijk maakt. Celcyclustoestanden zijn verondersteld een rol te spelen bij beslissingen over het lot van cellen door verschillende kansen te bieden waarin cellen ontvankelijk zijn voor bepaalde signalen die genexpressie en fenotypische veranderingen kunnen induceren28. Deze notch-gemedieerde G1-arrestatie maakte de expressie mogelijk van genen verrijkt in arteriële EC's, waaronder ephrinB2, Cx40, DLL4, Notch1 en Notch 4 (beoordeeld in29,30). Het is ook aangetoond dat hemogene EC-specificatie in vivo wordt bevorderd via RA-signalering 31,32. Aanvullende studies hebben aangetoond dat, stroomafwaarts van RA-signalering, expressie van c-Kit en Notch p27 upreguleren, wat hemogene specificatie in de murine dooierzak en AGM33 mogelijk maakt. Murine hemogene EC's kunnen minimaal worden geïdentificeerd door expressie van zowel endotheel (d.w.z. CD31, KDR) als hematopoëtische (d.w.z. c-Kit, CD34) markers4. Ten slotte ondergaan hemogene EC's een endotheel-naar-hematopoietische overgang (EHT) om HSPC's te vormen, die aanleiding kunnen geven tot alle bloedceltypen 4,34,35.
Recent werk testte of dezelfde signaleringshiërarchie de menselijke hemogene EC-specificatie kan bevorderen. Om dit te doen, werd een serum- en feedervrij 2D-kweekprotocol ontwikkeld om hemogene EC's af te leiden van hESCs, en deze hemogene EC's werden op eencellig niveau gekarakteriseerd als CD31 + KDR + c-Kit + CD34 + VE-Cadherin- CD45-. Deze studie maakte ook gebruik van de Fluorescent Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) reporter, die verschillende celcyclustoestanden identificeert, met behulp van H9-hESCs die de FUCCI-reporterconstructie uitdrukken (H9-FUCCI-hESC)36. In studies met deze cellen werd aangetoond dat RA vroege G1-celcyclusstilstand in EC's bevordert, en vroege G1-toestand maakt hemogene specificatie in vitromogelijk 37. Hierin wordt een gedetailleerd protocol verstrekt voor de differentiatie van deze menselijke hemogene endotheelcellen en testen die hun identiteit bevestigen. Deze eenvoudige methode biedt een nuttig middel om deze gespecialiseerde subset van EC's te genereren voor toekomstige studies van mechanismen van de ontwikkeling van menselijke bloedcellen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 cm dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430599</td>
			<td>tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td>tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td>tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimicrobial reagent 
			Brand Name: Normocin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>ant-nr-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>233-FB-025</td>
			<td>use at 50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>595202</td>
			<td>use at 25 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Detatchment Solution 
			Brand Name: vAccutase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DLL4</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>1506-D4/CF</td>
			<td>recombinant human; use at 10 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM:F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial cell growth medium 
			Brand Name: EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit (EGM-2)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td>polystyrene round bottom with filter cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gemini Bio</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>33016015</td>
			<td>use at 4 mg/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSK3i/CHIR99021</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0004-02</td>
			<td>10 mM stock; use at 5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144S-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix protein&#160; 
			Brand Name: Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356230</td>
			<td>Growth factor reduced. Refer to the Certificate of Analysis for the lot to determine the protein (Matrigel) concentration. This concentration is required to calculate the volume of Matrigel that contains 1 mg of protein.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose-based medium 
			Brand Name: MethoCult H4435 Enriched</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>4435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluripotent stem cell differentiation medium 
			Brand Name: STEMdiff APEL 2</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluripotent stem cells: H1, H9, H9-FUCCI</td>
			<td>WiCell</td>
			<td>WA09 (H9), WA01 (H1)</td>
			<td>human; H9-FUCCI were obtained from Dr. Ludovic Vallier&#39;s lab at Cambridge Stem Cell Institute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein-Free Hybridoma Medium (PFMH)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12040077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R2625-50mg</td>
			<td>use at 0.5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse transcription master mix 
			Brand Name: iScript Reverse Transcription Supermix</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1708840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction kit 
			Brand Name: RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SS255-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stem cell growth medium 
			Brand Name: mTeSR1</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green master mix 
			Brand Name: iTaq Universal SYBR Green Master Mix</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1725121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25299956</td>
			<td>0.25%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF165 (VEGF-A)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-20</td>
			<td>use at 50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-CD31-FITC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>303104</td>
			<td>2 &#956;g/mL*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-CD34-Pacific Blue</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>343512</td>
			<td>2 &#956;g/mL*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-CD45-APC/Cy7</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304014</td>
			<td>2 &#956;g/mL*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-c-Kit-APC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>313206</td>
			<td>2 &#956;g/mL*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Flk-1-PE/Cy7</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>359911</td>
			<td>2 &#956;g/mL*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-VE-Cadherin-PE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>348506</td>
			<td>2 &#956;g/mL*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">* Antibody fluorescent conjugates should be optimized based on the cell sorter used. Presented here are the final concentrations utilized in this study.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

directed differentiation of hemogenic endothelial cells from human pluripotent stem cells

Bloedvaten zijn alomtegenwoordig verdeeld in alle weefsels van het lichaam en vervullen verschillende functies. Dus, afleiding van volwassen vasculaire endotheelcellen, die bloedvatlumen bekleden, van menselijke pluripotente stamcellen is cruciaal voor een veelheid aan weefselmanipulatie- en regeneratietoepassingen. In vivo zijn primordiale endotheelcellen afgeleid van de mesodermale afstamming en worden gespecificeerd voor specifieke subtypen, waaronder arteriële, veneuze, capillaire, hemogene en lymfatische. Hemogene endotheelcellen zijn van bijzonder belang omdat ze tijdens de ontwikkeling aanleiding geven tot hematopoëtische stam- en voorlopercellen, die vervolgens alle bloedlijnen gedurende het hele leven genereren. Het creëren van een systeem om hemogene endotheelcellen in vitro te genereren, zou dus een mogelijkheid bieden om de endotheel-naar-hematopoietische overgang te bestuderen, en kan leiden tot ex vivo productie van menselijke bloedproducten en verminderde afhankelijkheid van menselijke donoren. Hoewel er verschillende protocollen bestaan voor de afleiding van voorloper- en primordiale endotheelcellen, is de generatie van goed gekarakteriseerde hemogene endotheelcellen uit menselijke stamcellen niet beschreven. Hier wordt een methode gepresenteerd voor de afleiding van hemogene endotheelcellen uit menselijke embryonale stamcellen in ongeveer 1 week: een differentiatieprotocol met primitieve streakcellen gevormd als reactie op GSK3β-remmer (CHIR99021), vervolgens mesoderm-afstammingsinductie gemedieerd door bFGF, gevolgd door primordiale endotheelcelontwikkeling bevorderd door BMP4 en VEGF-A, en ten slotte hemogene endotheelcelspecificatie geïnduceerd door retinoïnezuur. Dit protocol levert een goed gedefinieerde populatie van hemogene endotheelcellen op die kunnen worden gebruikt om hun moleculaire regulatie en endotheel-naar-hematopoietische overgang verder te begrijpen, wat het potentieel heeft om te worden toegepast op downstream therapeutische toepassingen.

Een schema met de specificatie van primordiale EC's en hemogene EC's uit hESCs, en een representatief beeld van cellen 24 uur na plating zijn weergegeven in figuur 1. Volgens specificatie worden primordiale EC's en hemogene EC's FACS gezuiverd op respectievelijk dag 5 en 8. Primordiale EC's worden gedefinieerd als CD31+ CD45- en hemogene EC's worden gedefinieerd als CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherin- CD45-</s...

Watch this Scientific Journal Video about Directed Differentiation of Hemogenic Endothelial Cells from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Directed Differentiation of Hemogenic Endothelial Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Hier wordt een eenvoudig protocol gepresenteerd voor de gerichte differentiatie van hemogene endotheelcellen van menselijke pluripotente stamcellen in ongeveer 1 week.

Gerichte differentiatie van hemogene endotheelcellen uit menselijke pluripotente stamcellen

Blood vessels are ubiquitously distributed within all tissues of the body and perform diverse functions. Thus, derivation of mature vascular endothelial ...

Dit protocol beschrijft een methode om een goed gekarakteriseerde populatie van menselijke hemogene endotheelcellen te genereren. Deze cellen kunnen worden gebruikt om de moleculaire regulatie en endotheel-naar-hematopoietische overgang te bestuderen. Begin met het kweken van menselijke embryonale stamcellen gedurende vier dagen om ze te differentiëren in primordiale endotheelcellen.Op dag vijf aspirateer je het medium boven de cellen. Was de cellen vervolgens voorzichtig met één milliliter DMEM/F-12 per putje. Voeg één milliliter vers bereid hemogeen endotheelceldifferentiatiemedium per put toe en incubeer de cellen gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.Vervang op dag zes en dag zeven het medium boven de cellen door één milliliter vers bereid homogeen homogeen endotheelceldifferentiatiemedium per put en incubeer de cellen nog eens 24 uur. Op dag acht. na het losmaken en wassen van de cellen, verdeel ze gelijkmatig in microcentrifugebuizen op ijs, elk met minimaal 600 microliter cellen met een dichtheid van 1 keer 10 tot de 5e cellen per milliliter.Voeg antilichamen toe aan de buizen die cellen bevatten en incubeer op ijs beschermd tegen licht gedurende 30 minuten. Pelleteer de cellen door centrifugeren op 1000 keer G en 4 graden Celsius gedurende vijf minuten. Verwijder het supernatant en resuspenseer de pellets in 600 microliter ijskoude sorteerbuffer.Zeef de monsters door de mesh filterdop van vijf milliliter FACS-buizen en sla de cellen op ijs beschermd tegen licht voor onmiddellijke celsortering. Om hemogene endotheelcellen te isoleren door FACS, moet eerst de CD45-negatieve celpopulatie worden afgesloten. Dan binnen de CD45-negatieve populatie, gate de CD31-positieve cellen.Volgende binnen de CD31-positieve populatie, poort voor de VE-cadherine-negatieve celpopulatie. En dan binnen de VE-cadherine-negatieve populatie, poort voor de c-Kit-positieve cellen. Van de c-Kit-positieve populatie, poort de CD34-positieve celpopulatie.En ten slotte van de CD34-positieve celpopulatie, identificeer en verzamel de KDR-positieve cellen. Na het zaaien van hemogene endotheelcellen in een op methylcellulose gebaseerd medium geformuleerd voor groei van hematopoëtische voorlopercellen, worden kolonievormende unit-erytroïde kolonies en blastvormende eenheid-erytroïde kolonies geteld op dag acht. Kolonievormende eenheid-granulocyt-macrofaag en kolonievormende eenheid-granulocyt, erytroïde, macrofaag en megacaryocyt.Multipotente hematopoëtische voorloperkolonies worden geteld op dag 14. Per 1000 hemogene endotheelcellen die worden geplateerd, worden ongeveer 20 kolonievormende eenheden gegenereerd. Cellen met endotheelcelmorfologie zijn ook zichtbaar in de culturen.Dit zijn de hemogene endotheelcellen die aanleiding geven tot multilineaire hematopoëtische voorlopercellen op eencellig niveau. Dit protocol is een 2D-serum en murine feeder-vrij kweeksysteem dat menselijke hemogene endotheelcellen in ongeveer een week kan genereren.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells

Direct Inductie van Hemogenic Endotheel en Bloed door overexpressie van transcriptiefactoren in menselijke pluripotente stamcellen

During development, hematopoietic cells arise from a specialized subset of endothelial cells, hemogenic endothelium (HE). Modeling HE development in vitro ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Feeder-vrij Afleiding van melanocyten uit menselijke pluripotente stamcellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

Isolatie van muizen embryonale Hemogenic endotheelcellen

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Grootschalige productie van cardiomyocyten van menselijke pluripotente stamcellen met behulp van een zeer reproduceerbare Small-Molecule Based Differentiatie Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Regie van differentiatie van primitieve en definitieve hematopoietische progenitorcellen van menselijke pluripotente stamcellen

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In vitro differentiatie van humane pluripotente stamcellen in trofoblastcellen

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Snelle, gerichte differentiatie van de epitheliale cellen van de retinale Pigment van menselijke embryonale of geïnduceerde pluripotente stamcellen

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Efficiënt en schaalbare gestuurde differentiatie van klinisch hoornvlies Limbal epitheliale cellen van de stam van menselijke pluripotente stamcellen

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Efficiënte differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen in levercellen

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In Vitro generatie van Somiet derivaten uit menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen-cellen

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...