Name: directed differentiation of hemogenic endothelial cells from human pluripotent stem cells
Uploaded: 2021-03-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Directed Differentiation of Hemogenic Endothelial Cells from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Ce travail a été partiellement soutenu par les subventions HL128064 et U2EB017103 des NIH. Un soutien supplémentaire a été fourni par CT Innovations 15-RMB-YALE-04.

1. Réactifs et préparation des réactifs
REMARQUE : Une liste des réactifs est fournie dans le Tableau des matériaux.
<ol><li>Obtenir les lignées de cellules souches pluripotentes humaines : H1-hESC, H9-Fucci-hESC. REMARQUE: La génération d’EC hémogènes peut être plus efficace dans la lignée cellulaire H1.</li>
	<li>Préparer les souches de protéines matricielles : Aliquote la protéine matricielle dans des tubes pré-réfrigérés de 1,5 mL (sur glace) de s...

<ol>
	<li>Giacomelli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cardiac+microtissues+composed+of+cardiomyocytes+and+endothelial+cells+co-differentiated+from+human+pluripotent+stem+cells.">Three-dimensional cardiac microtissues composed of cardiomyocytes and endothelial cells co-differentiated from human pluripotent stem cells.</a> Development. 144 (6), 1008-1017 (2017).</li><li>Wu, J., Wu, Z., Xue, Z., Li, H., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHBV/bioglass+composite+scaffolds+with+co-cultures+of+endothelial+cells+and+bone+marrow+stromal+cells+improve+vascularization+and+osteogenesis+for+bone+tissue+engineering.">PHBV/bioglass composite scaffolds with co-cultures of endothelial cells and bone marrow stromal cells improve vascularization and osteogenesis for bone tissue engineering.</a> RSC Advances. 7 (36), 22197-22207 (2017).</li><li>Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvasculature:+An+essential+component+for+organ-on-chip+systems.">Microvasculature: An essential component for organ-on-chip systems.</a> MRS Bulletin. 39 (1), 51-59 (2014).</li><li>Gritz, E., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+and+function+of+hemogenic+endothelium+during+embryogenesis.">Specification and function of hemogenic endothelium during embryogenesis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (8), 1547-1567 (2016).</li><li>Williams, I. M., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+endothelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells:+Methods,+considerations,+and+applications.">Generation of endothelial cells from human pluripotent stem cells: Methods, considerations, and applications.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (7), 1317-1329 (2019).</li><li>Olmer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+functional+endothelial+cells+in+scalable+suspension+culture.">Differentiation of human pluripotent stem cells into functional endothelial cells in scalable suspension culture.</a> Stem Cell Reports. 10 (5), 1657-1672 (2018).</li><li>Cossu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lancet+Commission:+Stem+cells+and+regenerative+medicine.">Lancet Commission: Stem cells and regenerative medicine.</a> The Lancet. 391 (10123), 883-910 (2018).</li><li>Fox, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+differentiated+pluripotent+stem+cells+in+replacement+therapy+for+treating+disease.">Use of differentiated pluripotent stem cells in replacement therapy for treating disease.</a> Science. 345 (6199), 1247391 (2014).</li><li>Mahla, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+applications+in+regenerative+medicine+and+disease+therapeutics.">Stem cells applications in regenerative medicine and disease therapeutics.</a> International Journal of Cell Biology. 2016, 1-24 (2016).</li><li>Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+as+a+disease+modeling+and+drug+screening+platform.">Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).</li><li>Rowe, R. G., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery.">Induced pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nature Reviews Genetics. 20 (7), 377-388 (2019).</li><li>Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+diseases+with+induced+pluripotent+stem+cells:+from+2D+to+3D+and+beyond.">Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond.</a> Development. 145 (5), (2018).</li><li>Wnorowski, A., Yang, H., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress,+obstacles,+and+limitations+in+the+use+of+stem+cells+in+organ-on-a-chip+models.">Progress, obstacles, and limitations in the use of stem cells in organ-on-a-chip models.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 3-11 (2019).</li><li>Ramme, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+induced+pluripotent+stem+cell-derived+four-organ-chip.">Autologous induced pluripotent stem cell-derived four-organ-chip.</a> Future Science OA. 5 (8), 1-12 (2019).</li><li>Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organs-on-a-Chip:+A+fast+track+for+engineered+human+tissues+in+drug+development.">Organs-on-a-Chip: A fast track for engineered human tissues in drug development.</a> Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).</li><li>Kane, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+endothelial+cells+from+human+embryonic+stem+cells+by+directed+differentiation:+analysis+of+microrna+and+angiogenesis+in+vitro+and+in+vivo.">Derivation of endothelial cells from human embryonic stem cells by directed differentiation: analysis of microrna and angiogenesis in vitro and in vivo.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 30 (7), 1389-1397 (2010).</li><li>Costa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+endothelial+cells+from+human+embryonic+stem+cells+in+fully+defined+medium+enables+identification+of+lysophosphatidic+acid+and+platelet+activating+factor+as+regulators+of+eNOS+localization.">Derivation of endothelial cells from human embryonic stem cells in fully defined medium enables identification of lysophosphatidic acid and platelet activating factor as regulators of eNOS localization.</a> Stem Cell Research. 10 (1), 103-117 (2013).</li><li>Nguyen, M. T. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+endothelial+progenitor+cells+on+laminins+in+defined+and+xeno-free+systems.">Differentiation of human embryonic stem cells to endothelial progenitor cells on laminins in defined and xeno-free systems.</a> Stem Cell Reports. 7 (4), 802-816 (2016).</li><li>Ikuno, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+robust+differentiation+of+endothelial+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+via+lineage+control+with+VEGF+and+cyclic+AMP.">Efficient and robust differentiation of endothelial cells from human induced pluripotent stem cells via lineage control with VEGF and cyclic AMP.</a> PLOS One. 12 (3), 0173271 (2017).</li><li>Aoki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+and+purification+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+endothelial+progenitor+cells+and+expansion+with+the+use+of+inhibitors+of+ROCK,+TGF-B,+and+GSK3B.">Efficient differentiation and purification of human induced pluripotent stem cell-derived endothelial progenitor cells and expansion with the use of inhibitors of ROCK, TGF-B, and GSK3B.</a> Heliyon. 6 (3), 03493 (2020).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+endothelial+progenitors+via+small-molecule+activation+of+Wnt+signaling.">Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of Wnt signaling.</a> Stem Cell Reports. 3 (5), 804-816 (2014).</li><li>Orlova, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation,+expansion+and+functional+analysis+of+endothelial+cells+and+pericytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation, expansion and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 9 (6), 1514-1531 (2014).</li><li>Kusuma, S., Gerecht, S., Turksen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+endothelial+cells+and+pericytes+from+human+pluripotent+stem+cells.">Derivation of endothelial cells and pericytes from human pluripotent stem cells.</a> Human Embryonic Stem Cell Protocols. , 213-222 (2014).</li><li>Bao, X., Lian, X., Palecek, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+endothelial+progenitor+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+wnt+activation+under+defined+conditions.">Directed endothelial progenitor differentiation from human pluripotent stem cells via wnt activation under defined conditions.</a> Methods in Molecular Biology. 1481, 183-196 (2016).</li><li>Xu, M., He, J., Zhang, C., Xu, J., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+derivation+of+endothelial+lineages+from+human+stem+cells.">Strategies for derivation of endothelial lineages from human stem cells.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 10 (1), 200 (2019).</li><li>Arora, S., Yim, E. K. F., Toh, Y. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+specification+of+pluripotent+stem+cell+derived+endothelial+cells+toward+arterial+and+venous+subtypes.">Environmental specification of pluripotent stem cell derived endothelial cells toward arterial and venous subtypes.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 143 (2019).</li><li>Fang, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-induced+Notch-Cx37-p27+axis+arrests+endothelial+cell+cycle+to+enable+arterial+specification.">Shear-induced Notch-Cx37-p27 axis arrests endothelial cell cycle to enable arterial specification.</a> Nature Communications. 8 (1), 2149 (2017).</li><li>Dalton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+the+cell+cycle+to+cell+fate+decisions.">Linking the cell cycle to cell fate decisions.</a> Trends in Cell Biology. 25 (10), 592-600 (2015).</li><li>Wolf, K., Hu, H., Isaji, T., Dardik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identity+of+arteries,+veins,+and+lymphatics.">Molecular identity of arteries, veins, and lymphatics.</a> Journal of Vascular Surgery. 69 (1), 253-262 (2019).</li><li>Rocha, S. F., Adams, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+differentiation+and+specialization+of+vascular+beds.">Molecular differentiation and specialization of vascular beds.</a> Angiogenesis. 12 (2), 139-147 (2009).</li><li>Goldie, L. C., Lucitti, J. L., Dickinson, M. E., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+signaling+directing+the+formation+and+function+of+hemogenic+endothelium+during+murine+embryogenesis.">Cell signaling directing the formation and function of hemogenic endothelium during murine embryogenesis.</a> Blood. 112 (8), 3194-3204 (2008).</li><li>Chanda, B., Ditadi, A., Iscove, N. N., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+signaling+is+essential+for+embryonic+hematopoietic+stem+cell+development.">Retinoic acid signaling is essential for embryonic hematopoietic stem cell development.</a> Cell. 155 (1), 215-227 (2013).</li><li>Marcelo, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemogenic+endothelial+cell+specification+requires+c-kit,+notch+signaling,+and+p27-mediated+cell-cycle+control.">Hemogenic endothelial cell specification requires c-kit, notch signaling, and p27-mediated cell-cycle control.</a> Developmental Cell. 27 (5), 504-515 (2013).</li><li>Dejana, E., Hirschi, K. K., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+of+endothelial+cell+plasticity.">The molecular basis of endothelial cell plasticity.</a> Nature Communications. 8 (1), 14361 (2017).</li><li>Ottersbach, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial-to-haematopoietic+transition:+an+update+on+the+process+of+making+blood.">Endothelial-to-haematopoietic transition: an update on the process of making blood.</a> Biochemical Society Transactions. 47 (2), 591-601 (2019).</li><li>Pauklin, S., Vallier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell-cycle+state+of+stem+cells+determines+cell+fate+propensity.">The cell-cycle state of stem cells determines cell fate propensity.</a> Cell. 155 (1), 135-147 (2013).</li><li>Qiu, J., Nordling, S., Vasavada, H. H., Butcher, E. C., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+promotes+endothelial+cell+cycle+early+g1+state+to+enable+human+hemogenic+endothelial+cell+specification.">Retinoic acid promotes endothelial cell cycle early g1 state to enable human hemogenic endothelial cell specification.</a> Cell Reports. 33 (9), 108465 (2020).</li><li>Sriram, G., Tan, J. Y., Islam, I., Rufaihah, A. J., Cao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+arterial+and+venous+endothelial+cells+under+feeder-+and+serum-free+conditions.">Efficient differentiation of human embryonic stem cells to arterial and venous endothelial cells under feeder- and serum-free conditions.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 6 (1), 261 (2015).</li><li>Ohta, R., Sugimura, R., Niwa, A., Saito, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemogenic+endothelium+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+in+a+feeder-+and+xeno-free+defined+condition.">Hemogenic endothelium differentiation from human pluripotent stem cells in a feeder- and xeno-free defined condition.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59823 (2019).</li><li>Galat, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine-free+directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+efficiently+produces+hemogenic+endothelium+with+lymphoid+potential.">Cytokine-free directed differentiation of human pluripotent stem cells efficiently produces hemogenic endothelium with lymphoid potential.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 8 (1), 67 (2017).</li><li>Sidney, L. E., Branch, M. J., Dunphy, S. E., Dua, H. S., Hopkinson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Evidence+for+CD34+as+a+common+marker+for+diverse+progenitors.">Concise review: Evidence for CD34 as a common marker for diverse progenitors.</a> Stem Cells. 32 (6), 1380-1389 (2014).</li></ol>

Les étapes de production de cellules endothéliales hémogéniques à partir de cellules souches embryonnaires humaines en environ 1 semaine à l’aide d’un système de culture 2D murin sans alimentation et sans sérum (Figure 1) sont décrites. Ce protocole développe une méthode décrite par Sriram et al. (2015) pour obtenir des CE primordiales38. La nature primordiale et le potentiel de spécification des CD31+ CD45- EC sont démontrés e...

Les cellules endothéliales (CE) sont une population hétérogène de cellules qui remplissent de multiples fonctions dans tout le corps humain et dans les tissus modifiés. En plus de soutenir et de réguler d’autres types de cellules (c.-à-d. cardiomyocytes1, cellules ostéoblastiques2), ces fonctions comprennent la formation d’une barrière sélective entre le sang et les tissus et l’aide à la formation des tissus3. La différenciation des EC matures au cours du développement normal nécessite diverses voies de signalisation. Les CE primordiaux sont dérivés des progéniteurs du mésoderme, et sont ensuite spécifiés vers les phénotypes artériels, veineux, capillaires et lymphatiques matures4. En outre, un petit sous-ensemble de CE dans le sac vitellin extraembryonnaire et la région embryonnaire Aorte-Gonade-Mésonéphros (AGM) sont également spécifiés pour devenir des CE hémogènes, qui donnent naissance à des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPC) qui migrent vers le foie fœtal et la moelle osseuse fœtale, où elles restent postnatales et génèrent tous les types de cellules sanguines tout au long de la vie4. La diversité des phénotypes EC est essentielle pour tout développement et entretien tissulaire.
Ainsi, les CE et leurs dérivés sont des composantes essentielles des études visant à modéliser et à élucider les mécanismes du développement humain et/ou des maladies, ainsi que les applications de la médecine régénérative et de l’ingénierie tissulaire 5,6,7,8. Cependant, la principale limite de ces types d’études est le manque de disponibilité des EC humaines primaires dans la quantité requise. Il a été estimé qu’un minimum de 3 x 108 EC serait nécessaire pour la majorité des applications thérapeutiques6. Pour résoudre ce problème, l’utilisation de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (CSPhi) a été proposée en raison de leur potentiel de lignée diversifiée et de leur capacité à générer un grand nombre de descendants 6,9.
En effet, l’utilité des cellules dérivées des CSEh ou des CSPh a été démontrée dans de multiples études axées sur la modélisation de la maladie et le dépistage de médicaments10,11,12. La technologie Organ-on-a-Chip (OOC) a été utilisée pour récapituler plus fidèlement la physiologie du corps humain en intégrant des cellules et des tissus dans des échafaudages tridimensionnels. En outre, la connexion de plusieurs OOC individuels (un soi-disant corps ou humain sur puce, BOC / HOC) peut être réalisée via la microfluidique pour permettre la diaphonie entre les organes d’intérêt13,14,15. Les tissus de soutien, tels que le système vasculaire, sont des composants essentiels des COO et des BOC/HOC; L’incorporation du système vasculaire permet le transport des nutriments, de l’oxygène et des facteurs paracrines dans les tissus, favorisant ainsi le microenvironnement tissulaire spécifique requis 3,12. Ainsi, les méthodes de dérivation des CE humains matures, telles que les CE artérielles, veineuses, lymphatiques et hémogènes, sont cruciales pour faire progresser ces approches d’ingénierie tissulaire.
Plusieurs protocoles ont été publiés détaillant les étapes pour la dérivation des CE primordiales ou progénitrices humaines à partir de CSEh ou de CSPh 5,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 . Bon nombre de ces protocoles reposent sur la formation de corps embryoïdes (EB) ou la co-culture d’ESC/CSPi avec une couche nourricière murine de cellules stromales. Ces stratégies ont tendance à être difficiles et à prendre beaucoup de temps, avec de faibles rendements EC et/ou une contamination des CE humaines par des cellules murines. Les protocoles qui reposent strictement sur la culture 2D sans l’utilisation de cellules stromales nécessitent souvent de longues inductions, utilisent des combinaisons complexes de facteurs de croissance et / ou d’inhibiteurs pour l’induction, ont des périodes d’expansion prolongées après la séparation cellulaire, ou une combinaison de ces facteurs. L’avancement des connaissances sur les voies de signalisation et les facteurs impliqués dans la dérivation des types EC matures in vivo jette les bases d’un protocole de différenciation in vitro simple et robuste.
Auparavant, les rôles clés des voies de signalisation Notch et de l’acide rétinoïque (RA) dans la spécification des CE artérielles et hémogéniques murines, respectivement, au cours du développement ont été identifiés. La voie de signalisation Notch joue de multiples rôles dans la spécification et le maintien du phénotype EC artériel. Les travaux utilisant le modèle de vascularisation rétinienne murine ont identifié une voie dans laquelle la contrainte de cisaillement des fluides induit un axe de signalisation Notch-Cx37-p27, favorisant l’arrêt du cycle cellulaire G1, ce qui permet la spécification EC artérielle27. On a émis l’hypothèse que les états du cycle cellulaire jouent un rôle dans les décisions relatives au devenir cellulaire en fournissant des fenêtres d’opportunité distinctes dans lesquelles les cellules sont réceptives à certains signaux qui peuvent induire l’expression des gènes et des changements phénotypiques28. Cet arrêt G1 médié par Notch a permis l’expression de gènes enrichis en EC artériels, notamment ephrinB2, Cx40, DLL4, Notch1 et Notch 4 (examinés dans29,30). Il a également été démontré que la spécification CE hémogénique est encouragée in vivo via la signalisation RA31,32. Des études supplémentaires ont identifié que, en aval de la signalisation RA, l’expression de c-Kit et Notch régule p27, ce qui permet une spécification hémogénique dans le sac vitellin murin et AGM33. Les CE hémogènes murins peuvent être identifiés de manière minimale par l’expression des marqueurs endothéliaux (CD31, KDR) et hématopoïétiques (c-à-d. c-Kit, CD34)4. Enfin, les CE hémogènes subissent une transition endothéliale-hématopoïétique (EHT) pour former des HSPC, qui peuvent donner naissance à tous les types de cellules sanguines 4,34,35.
Des travaux récents ont testé si cette même hiérarchie de signalisation peut promouvoir la spécification EC hémogénique humaine. Pour ce faire, un protocole de culture 2D sans sérum et sans alimentation pour dériver des CE hémogènes à partir de CSEh a été développé, et ces CE hémogéniques ont été caractérisés au niveau cellulaire comme CD31+ KDR+ c-Kit + CD34+ VE-Cadhérine- CD45-. Cette étude a également tiré parti du rapporteur FUCCI (Fluorescent Ubiquitination Cell Cycle Indicator), qui identifie différents états du cycle cellulaire, en utilisant des CSEh H9 qui expriment la construction du rapporteur FUCCI (H9-FUCCI-hESC)36. Dans des études avec ces cellules, il a été démontré que la PR favorise l’arrêt précoce du cycle cellulaire G1 dans les CE, et que l’état G1 précoce permet une spécification hémogénique in vitro37. Ici, un protocole détaillé pour la différenciation de ces cellules endothéliales hémogènes humaines et des tests confirmant leur identité sont fournis. Cette méthode simple fournit un moyen utile de générer ce sous-ensemble spécialisé de CE pour de futures études sur les mécanismes du développement des cellules sanguines humaines.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 cm dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430599</td>
			<td>tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td>tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td>tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimicrobial reagent 
			Brand Name: Normocin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>ant-nr-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>233-FB-025</td>
			<td>use at 50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>595202</td>
			<td>use at 25 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Detatchment Solution 
			Brand Name: vAccutase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DLL4</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>1506-D4/CF</td>
			<td>recombinant human; use at 10 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM:F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial cell growth medium 
			Brand Name: EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit (EGM-2)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td>polystyrene round bottom with filter cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gemini Bio</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>33016015</td>
			<td>use at 4 mg/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSK3i/CHIR99021</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0004-02</td>
			<td>10 mM stock; use at 5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144S-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix protein&#160; 
			Brand Name: Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356230</td>
			<td>Growth factor reduced. Refer to the Certificate of Analysis for the lot to determine the protein (Matrigel) concentration. This concentration is required to calculate the volume of Matrigel that contains 1 mg of protein.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose-based medium 
			Brand Name: MethoCult H4435 Enriched</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>4435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluripotent stem cell differentiation medium 
			Brand Name: STEMdiff APEL 2</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluripotent stem cells: H1, H9, H9-FUCCI</td>
			<td>WiCell</td>
			<td>WA09 (H9), WA01 (H1)</td>
			<td>human; H9-FUCCI were obtained from Dr. Ludovic Vallier&#39;s lab at Cambridge Stem Cell Institute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein-Free Hybridoma Medium (PFMH)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12040077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R2625-50mg</td>
			<td>use at 0.5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse transcription master mix 
			Brand Name: iScript Reverse Transcription Supermix</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1708840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction kit 
			Brand Name: RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SS255-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stem cell growth medium 
			Brand Name: mTeSR1</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green master mix 
			Brand Name: iTaq Universal SYBR Green Master Mix</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1725121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25299956</td>
			<td>0.25%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF165 (VEGF-A)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-20</td>
			<td>use at 50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-CD31-FITC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>303104</td>
			<td>2 &#956;g/mL*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-CD34-Pacific Blue</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>343512</td>
			<td>2 &#956;g/mL*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-CD45-APC/Cy7</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304014</td>
			<td>2 &#956;g/mL*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-c-Kit-APC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>313206</td>
			<td>2 &#956;g/mL*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Flk-1-PE/Cy7</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>359911</td>
			<td>2 &#956;g/mL*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-VE-Cadherin-PE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>348506</td>
			<td>2 &#956;g/mL*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">* Antibody fluorescent conjugates should be optimized based on the cell sorter used. Presented here are the final concentrations utilized in this study.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

directed differentiation of hemogenic endothelial cells from human pluripotent stem cells

Les vaisseaux sanguins sont omniprésents dans tous les tissus du corps et remplissent diverses fonctions. Ainsi, la dérivation de cellules endothéliales vasculaires matures, qui tapissent les lumières des vaisseaux sanguins, à partir de cellules souches pluripotentes humaines est cruciale pour une multitude d’applications d’ingénierie tissulaire et de régénération. In vivo, les cellules endothéliales primordiales sont dérivées de la lignée mésodermique et sont spécifiées vers des sous-types spécifiques, y compris artériel, veineux, capillaire, hémogène et lymphatique. Les cellules endothéliales hémogènes présentent un intérêt particulier car, au cours du développement, elles donnent naissance à des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques, qui génèrent ensuite toutes les lignées sanguines tout au long de la vie. Ainsi, la création d’un système pour générer des cellules endothéliales hémogènes in vitro fournirait l’occasion d’étudier la transition endothéliale-hématopoïétique et pourrait conduire à la production ex vivo de produits sanguins humains et à une réduction de la dépendance à l’égard des donneurs humains. Bien qu’il existe plusieurs protocoles pour la dérivation des cellules endothéliales progénitrices et primordiales, la génération de cellules endothéliales hémogènes bien caractérisées à partir de cellules souches humaines n’a pas été décrite. Ici, une méthode de dérivation de cellules endothéliales hémogènes à partir de cellules souches embryonnaires humaines en environ 1 semaine est présentée: un protocole de différenciation avec des cellules de stries primitives formées en réponse à l’inhibiteur de GSK3β (CHIR99021), puis induction de la lignée mésodermique médiée par le FGFb, suivie du développement des cellules endothéliales primordiales favorisé par BMP4 et VEGF-A, et enfin de la spécification des cellules endothéliales hémogènes induite par l’acide rétinoïque. Ce protocole produit une population bien définie de cellules endothéliales hémogènes qui peuvent être utilisées pour mieux comprendre leur régulation moléculaire et leur transition endothéliale-hématopoïétique, ce qui pourrait être appliqué à des applications thérapeutiques en aval.

La figure 1 présente un schéma décrivant la spécification des CE primordiales et des CE hémogènes à partir des CSEh, ainsi qu’une image représentative des cellules 24 h après le placage. Conformément aux spécifications, les EC primordiaux et les EC hémogènes sont purifiés FACS aux jours 5 et 8, respectivement. Les EC primordiaux sont définis comme CD31+ CD45- et les EC hémogènes sont définis comme CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadh...

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Directed Differentiation of Hemogenic Endothelial Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Présenté ici est un protocole simple pour la différenciation dirigée des cellules endothéliales hémogènes à partir de cellules souches pluripotentes humaines en environ 1 semaine.

Différenciation dirigée de cellules endothéliales hémogéniques à partir de cellules souches pluripotentes humaines

Blood vessels are ubiquitously distributed within all tissues of the body and perform diverse functions. Thus, derivation of mature vascular endothelial ...

Ce protocole détaille une méthode pour générer une population bien caractérisée de cellules endothéliales hémogènes humaines. Ces cellules peuvent être utilisées pour étudier la régulation moléculaire et la transition endothéliale-hématopoïétique. Commencez par cultiver des cellules souches embryonnaires humaines pendant quatre jours pour les différencier en cellules endothéliales primordiales.Le cinquième jour, aspirez le milieu au-dessus des cellules. Ensuite, lavez doucement les cellules avec un millilitre de DMEM / F-12 par puits. Ajouter un millilitre de milieu de différenciation des cellules endothéliales hémogènes fraîchement préparé par puits et incuber les cellules pendant 24 heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.Le sixième et le septième jour, remplacez le milieu au-dessus des cellules par un millilitre de milieu de différenciation des cellules endothéliales homogènes fraîchement préparé par puits, et incuber les cellules pendant 24 heures supplémentaires. Le huitième jour. Après avoir détaché et lavé les cellules, divisez-les uniformément en tubes de microcentrifugeuses sur de la glace, chacun contenant un minimum de 600 microlitres de cellules à une densité de 1 fois 10 à la 5ème cellule par millilitre.Ajouter des anticorps aux tubes contenant les cellules, le cas échéant, et incuber sur de la glace à l’abri de la lumière pendant 30 minutes. Enduire les cellules par centrifugation à 1000 fois G et 4 degrés Celsius pendant cinq minutes. Retirez le surnageant et remettez les granulés en suspension dans 600 microlitres de tampon de tri glacé.Filtrer les échantillons à travers le capuchon filtrant des tubes FACS de cinq millilitres et stocker les cellules sur de la glace à l’abri de la lumière pour un tri cellulaire immédiat. Pour isoler les cellules endothéliales hémogènes par FACS, commencez par la population de cellules CD45 négatives. Ensuite, au sein de la population CD45-négative, porte les cellules CD31-positives.Suivant dans la population CD31-positive, porte pour la population de cellules VE-cadhérine-négative. Et puis au sein de la population VE-cadhérine-négative, porte pour les cellules c-Kit-positives. De la population c-Kit-positive, porte la population de cellules CD34-positives.Et enfin, à partir de la population de cellules CD34-positives, identifier et collecter les cellules KDR-positives. Après l’ensemencement des cellules endothéliales hémogènes dans un milieu à base de méthylcellulose formulé pour la croissance des cellules progénitrices hématopoïétiques, les colonies d’unités érythroïdes formant des colonies et les colonies d’unités érythroïdes formant des explosions sont comptées au huitième jour. Unité formant colonie-granulocytes-macrophages et unité formant colonie-granulocytes, érythroïdes, macrophages et mégacaryocytes.Les colonies progénitrices hématopoïétiques multipotentes sont comptées au jour 14. Pour 1000 cellules endothéliales hémogènes plaquées, environ 20 unités formant colonie sont générées. Les cellules ayant une morphologie de cellules endothéliales sont également visibles dans les cultures.Ce sont les cellules endothéliales hémogènes qui donnent naissance à des progéniteurs hématopoïétiques multilignés au niveau unicellulaire. Ce protocole est un système de culture 2D sans sérum et sans alimentation murine qui peut générer des cellules endothéliales hémogènes humaines en une semaine environ.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells

Induction directe de Hemogenic endothélium et le sang par la surexpression de facteurs de transcription dans pluripotentes humaines Cellules souches

During development, hematopoietic cells arise from a specialized subset of endothelial cells, hemogenic endothelium (HE). Modeling HE development in vitro ...

Recherche

Biologie du développement

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Dérivation libre Feeder-de mélanocytes de pluripotentes humaines Cellules souches

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

Isolement des cellules embryonnaires murines Hemogenic endothéliales

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Production à grande échelle de cardiomyocytes à partir pluripotentes humaines cellules souches en utilisant un petit protocole Différenciation Molecule-Based hautement reproductible

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Réalisé la différenciation des progéniteurs hématopoïétiques primitives et définitif des cellules souches pluripotentes humaines

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

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The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Rapide, réalisée la différenciation des cellules épithéliales pigmentaire rétinien de cellules souches pluripotentes humaines embryonnaires ou induit

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Efficace et évolutive différenciation dirigée de cliniquement compatibles cornéenne limbique épithéliales cellules souches à partir des cellules souches pluripotentes humaines

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In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Dans Vitro génération du Somite dérivés de Human induit Pluripotent Stem cellules

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...