Name: directed differentiation of hemogenic endothelial cells from human pluripotent stem cells
Uploaded: 2021-03-31T14:00:00
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Diese Arbeit wurde teilweise durch die NIH-Zuschüsse HL128064 und U2EB017103 unterstützt. Weitere Unterstützung wurde durch CT Innovations 15-RMB-YALE-04 Grant bereitgestellt.

1. Reagenzien und Reagenzienzubereitung
HINWEIS: Eine Liste der Reagenzien finden Sie in der Materialtabelle.
<ol><li>Erhalten Sie die humanen pluripotenten Stammzelllinien: H1-hESC, H9-Fucci-hESC. HINWEIS: Die Erzeugung von hämogenen ECs kann in der H1-Zelllinie effizienter sein.</li>
	<li>Matrixproteinvorräte vorbereiten: Aliquot das Matrixprotein in vorgekühlte 1,5 ml Röhrchen (auf Eis) geben, so dass jedes Röhrchen 1 mg Matrixprotein enthält. 1 mg Matrixprotein ...

<ol>
	<li>Giacomelli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cardiac+microtissues+composed+of+cardiomyocytes+and+endothelial+cells+co-differentiated+from+human+pluripotent+stem+cells.">Three-dimensional cardiac microtissues composed of cardiomyocytes and endothelial cells co-differentiated from human pluripotent stem cells.</a> Development. 144 (6), 1008-1017 (2017).</li><li>Wu, J., Wu, Z., Xue, Z., Li, H., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHBV/bioglass+composite+scaffolds+with+co-cultures+of+endothelial+cells+and+bone+marrow+stromal+cells+improve+vascularization+and+osteogenesis+for+bone+tissue+engineering.">PHBV/bioglass composite scaffolds with co-cultures of endothelial cells and bone marrow stromal cells improve vascularization and osteogenesis for bone tissue engineering.</a> RSC Advances. 7 (36), 22197-22207 (2017).</li><li>Lee, H., Chung, M., Jeon, N. 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Hier werden die Schritte zur Herstellung hämogener Endothelzellen aus humanen embryonalen Stammzellen in ca. 1 Woche unter Verwendung eines murinfütterungs- und serumfreien 2D-Kultursystems skizziert (Abbildung 1). Dieses Protokoll erweitert eine von Sriram et al. (2015) beschriebene Methode, um primordiale ECs38 zu erhalten. Die ursprüngliche Natur und das Spezifikationspotenzial der CD31+ CD45-ECs werden demonstriert, indem diese Zellen auf DLL4-beschi...

Endothelzellen (ECs) sind eine heterogene Population von Zellen, die im gesamten menschlichen Körper und in technisch hergestellten Geweben mehrere Funktionen erfüllen. Neben der Unterstützung und Regulierung anderer Zelltypen (z. B. Kardiomyozyten1, osteoblastische Zellen2) umfassen diese Funktionen die Bildung einer selektiven Barriere zwischen Blut und Geweben und die Unterstützung der Gewebebildung3. Die Differenzierung reifer ECs während der normalen Entwicklung erfordert vielfältige Signalwege. Primordiale ECs werden von Mesoderm-Vorläuferzellen abgeleitet und dann für reife arterielle, venöse, kapillare und lymphatische Phänotypen spezifiziert4. Darüber hinaus wird eine kleine Untergruppe von ECs im extraembryonalen Dottersack und in der embryonalen Aorta-Gonad-Mesonephros-Region (AGM) ebenfalls als hämogene ECs spezifiziert, aus denen hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) hervorgehen, die in die fetale Leber und das fetale Knochenmark wandern, wo sie postnatal verbleiben und alle Blutzelltypen während des gesamten Lebens erzeugen4. Die Vielfalt der EC-Phänotypen ist essentiell für die gesamte Gewebeentwicklung und -erhaltung.
Daher sind ECs und ihre Derivate kritische Komponenten von Studien zur Modellierung und Aufklärung von Mechanismen der menschlichen Entwicklung und/oder Krankheit sowie von Anwendungen der regenerativen Medizin und des Tissue Engineering 5,6,7,8. Die Haupteinschränkung für diese Art von Studien ist jedoch die mangelnde Verfügbarkeit von primären Human-ECs in der erforderlichen Menge. Es wurde geschätzt, dass für die meisten therapeutischen Anwendungen mindestens 3 x 108 ECs erforderlich wären6. Um dieses Problem zu lösen, wurde die Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) und humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS-Zellen) aufgrund ihres vielfältigen Abstammungspotenzials und ihrer Fähigkeit, eine große Anzahl von Nachkommen zu erzeugen, vorgeschlagen 6,9.
Tatsächlich wurde die Nützlichkeit von Zellen, die aus hES-Zellen oder hiPS-Zellen gewonnen wurden, in mehreren Studien nachgewiesen, die sich auf Krankheitsmodellierung und Arzneimittelscreening konzentrierten10,11,12. Die Organ-on-a-Chip (OOC) -Technologie wurde verwendet, um die Physiologie des menschlichen Körpers genauer zu rekapitulieren, indem Zellen und Gewebe in dreidimensionale Gerüste integriert wurden. Darüber hinaus kann die Verbindung mehrerer einzelner OOCs (ein sogenannter Body- oder Human-on-a-Chip, BOC/HOC) über Mikrofluidik erreicht werden, um ein Übersprechen zwischen den interessierenden Organen13,14,15 zu ermöglichen. Stützgewebe wie das Gefäßsystem sind kritische Bestandteile von OOCs und BOC/HOCs; Die Einbeziehung des Gefäßsystems ermöglicht den Transport von Nährstoffen, Sauerstoff und parakrinen Faktoren durch das Gewebe und fördert dadurch die erforderliche gewebespezifische Mikroumgebung 3,12. Daher sind Methoden zur Ableitung reifer humaner ECs, wie arterielle, venöse, lymphatische und hämogene ECs, entscheidend für die Weiterentwicklung dieser Tissue Engineering-Ansätze.
Es wurden mehrere Protokolle veröffentlicht, in denen die Schritte für die Ableitung humaner Ur- oder Vorläufer-ECs aus hES-Zellen oder hiPS-Zellen detailliert beschrieben sind 5,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 . Viele dieser Protokolle beruhen auf der Bildung von Embryoiden Körpern (EB) oder der Kokultur von ESCs / iPSCs mit einer murinen Feederschicht von Stromazellen. Diese Strategien sind in der Regel schwierig und zeitaufwendig, mit geringen EC-Erträgen und/oder Kontamination menschlicher ECs mit Mauszellen. Protokolle, die strikt auf 2D-Kultur ohne die Verwendung von Stromazellen angewiesen sind, erfordern oft lange Induktionen, verwenden komplexe Kombinationen von Wachstumsfaktoren und / oder Inhibitoren für die Induktion, haben verlängerte Expansionszeiten nach der Zelltrennung oder eine Kombination dieser Faktoren. Die Weiterentwicklung des Wissens über Signalwege und Faktoren, die an der Ableitung reifer EC-Typen in vivo beteiligt sind, bildet die Grundlage für ein einfaches und robustes In-vitro-Differenzierungsprotokoll.
Zuvor wurden Schlüsselrollen für Notch- und Retinsäure (RA)-Signalwege bei der Spezifikation von murinen arteriellen bzw. hämogenen ECs während der Entwicklung identifiziert. Der Notch-Signalweg spielt mehrere Rollen bei der Spezifikation und Aufrechterhaltung des arteriellen EC-Phänotyps. Die Arbeit mit dem murinen retinalen Vaskularisationsmodell identifizierte einen Weg, in dem Flüssigkeitsscherspannung eine Notch-Cx37-p27-Signalachse induziert, die den G1-Zellzyklusstillstand fördert, was die arterielle EC-Spezifikation27 ermöglicht. Es wurde angenommen, dass Zellzykluszustände eine Rolle bei Zellschicksalsentscheidungen spielen, indem sie unterschiedliche Gelegenheitsfenster bieten, in denen Zellen für bestimmte Signale empfänglich sind, die Genexpression und phänotypische Veränderungen induzieren können28. Dieser Notch-vermittelte G1-Arrest ermöglichte die Expression von Genen, die in arteriellen ECs angereichert sind, einschließlich EphrinB2, Cx40, DLL4, Notch1 und Notch 4 (überprüft in29,30). Es wurde auch gezeigt, dass die hämogene EC-Spezifikation in vivo über die RA-Signalisierung31,32 gefördert wird. Zusätzliche Studien zeigten, dass die Expression von c-Kit und Notch p27 stromabwärts der RA-Signalisierung hochreguliert, was eine hämogene Spezifikation im Murindottersack und AGM33 ermöglicht. Murine hämogene ECs können minimal durch Expression sowohl endothelialer (d.h. CD31, KDR) als auch hämatopoetischer (d.h. c-Kit, CD34) Marker identifiziert werden4. Schließlich durchlaufen hämogene ECs einen endothelialen zu hämatopoetischen Übergang (EHT), um HSPCs zu bilden, die zu allen Blutzelltypen 4,34,35 führen können.
Neuere Arbeiten haben getestet, ob dieselbe Signalhierarchie die humane hämogene EC-Spezifikation fördern kann. Dazu wurde ein serum- und feederfreies 2D-Kulturprotokoll zur Ableitung hämogener ECs aus hES-Zellen entwickelt, und diese hämogenen ECs wurden auf Einzelzellebene als CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherin- CD45- charakterisiert. Diese Studie nutzte auch den FUCCI-Reporter (Fluorescent Ubiquitination Cell Cycle Indicator), der verschiedene Zellzykluszustände unter Verwendung von H9-hES-Zellen identifiziert, die das FUCCI-Reporterkonstrukt (H9-FUCCI-hESC) ausdrücken36. In Studien mit diesen Zellen wurde gezeigt, dass RA den frühen G1-Zellzyklus-Arrest in ECs fördert und der frühe G1-Zustand eine hämogene Spezifikation in vitroermöglicht 37. Hierin werden ein detailliertes Protokoll für die Differenzierung dieser humanen hämogenen Endothelzellen und Assays zur Bestätigung ihrer Identität bereitgestellt. Diese einfache Methode bietet ein nützliches Mittel, um diese spezialisierte Untergruppe von ECs für zukünftige Studien der Mechanismen der Entwicklung menschlicher Blutzellen zu generieren.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>15 cm dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430599</td>
			<td>tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td>tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td>tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimicrobial reagent 
			Brand Name: Normocin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>ant-nr-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>233-FB-025</td>
			<td>use at 50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>595202</td>
			<td>use at 25 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Detatchment Solution 
			Brand Name: vAccutase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DLL4</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>1506-D4/CF</td>
			<td>recombinant human; use at 10 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM:F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial cell growth medium 
			Brand Name: EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit (EGM-2)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td>polystyrene round bottom with filter cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gemini Bio</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>33016015</td>
			<td>use at 4 mg/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSK3i/CHIR99021</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0004-02</td>
			<td>10 mM stock; use at 5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144S-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix protein&#160; 
			Brand Name: Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356230</td>
			<td>Growth factor reduced. Refer to the Certificate of Analysis for the lot to determine the protein (Matrigel) concentration. This concentration is required to calculate the volume of Matrigel that contains 1 mg of protein.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose-based medium 
			Brand Name: MethoCult H4435 Enriched</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>4435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluripotent stem cell differentiation medium 
			Brand Name: STEMdiff APEL 2</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluripotent stem cells: H1, H9, H9-FUCCI</td>
			<td>WiCell</td>
			<td>WA09 (H9), WA01 (H1)</td>
			<td>human; H9-FUCCI were obtained from Dr. Ludovic Vallier&#39;s lab at Cambridge Stem Cell Institute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein-Free Hybridoma Medium (PFMH)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12040077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R2625-50mg</td>
			<td>use at 0.5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse transcription master mix 
			Brand Name: iScript Reverse Transcription Supermix</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1708840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction kit 
			Brand Name: RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SS255-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stem cell growth medium 
			Brand Name: mTeSR1</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green master mix 
			Brand Name: iTaq Universal SYBR Green Master Mix</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1725121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25299956</td>
			<td>0.25%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF165 (VEGF-A)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-20</td>
			<td>use at 50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-CD31-FITC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>303104</td>
			<td>2 &#956;g/mL*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-CD34-Pacific Blue</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>343512</td>
			<td>2 &#956;g/mL*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-CD45-APC/Cy7</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304014</td>
			<td>2 &#956;g/mL*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-c-Kit-APC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>313206</td>
			<td>2 &#956;g/mL*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Flk-1-PE/Cy7</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>359911</td>
			<td>2 &#956;g/mL*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-VE-Cadherin-PE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>348506</td>
			<td>2 &#956;g/mL*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">* Antibody fluorescent conjugates should be optimized based on the cell sorter used. Presented here are the final concentrations utilized in this study.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

directed differentiation of hemogenic endothelial cells from human pluripotent stem cells

Blutgefäße sind ubiquitär in allen Geweben des Körpers verteilt und erfüllen vielfältige Funktionen. Daher ist die Ableitung reifer vaskulärer Endothelzellen, die Blutgefäßlumen auskleiden, aus humanen pluripotenten Stammzellen entscheidend für eine Vielzahl von Tissue Engineering- und Regenerationsanwendungen. In vivo stammen primordiale Endothelzellen aus der mesodermalen Linie und sind für bestimmte Subtypen spezifiziert, einschließlich arterieller, venöser, kapillarer, hämogener und lymphatischer Typen. Hämogene Endothelzellen sind von besonderem Interesse, da sie während der Entwicklung hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen hervorbringen, die dann im Laufe des Lebens alle Blutlinien erzeugen. Daher würde die Schaffung eines Systems zur Erzeugung hämogener Endothelzellen in vitro die Möglichkeit bieten, den endothelialen zu hämatopoetischen Übergang zu untersuchen, und könnte zu einer Ex-vivo-Produktion menschlicher Blutprodukte und einer geringeren Abhängigkeit von menschlichen Spendern führen. Während mehrere Protokolle für die Ableitung von Vorläufer- und primordialen Endothelzellen existieren, wurde die Erzeugung gut charakterisierter hämogener Endothelzellen aus menschlichen Stammzellen nicht beschrieben. Hier wird eine Methode zur Gewinnung hämogener Endothelzellen aus humanen embryonalen Stammzellen in ca. 1 Woche vorgestellt: ein Differenzierungsprotokoll mit primitiven Streakzellen, die als Reaktion auf GSK3β-Inhibitor (CHIR99021) gebildet wurden, dann Mesoderm-Linieninduktion vermittelt durch bFGF, gefolgt von primordialer Endothelzellentwicklung, die durch BMP4 und VEGF-A gefördert wird, und schließlich hämogene Endothelzellspezifikation, die durch Retinsäure induziert wird. Dieses Protokoll liefert eine gut definierte Population hämogener Endothelzellen, die verwendet werden können, um ihre molekulare Regulation und ihren endothelialen zu hämatopoetischen Übergang besser zu verstehen, was das Potenzial hat, auf nachgelagerte therapeutische Anwendungen angewendet zu werden.

Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung der Spezifikation von primordialen ECs und hämogenen ECs aus hES-Zellen sowie ein repräsentatives Bild der Zellen 24 h nach der Beschichtung. Nach der Spezifikation werden primordiale ECs und hämogene ECs an den Tagen 5 bzw. 8 FACS gereinigt. Primordiale ECs sind definiert als CD31+ CD45- und hämogene ECs sind definiert als CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherin- CD45-.</su...

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Directed Differentiation of Hemogenic Endothelial Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Hier wird ein einfaches Protokoll für die gezielte Differenzierung von hämogenen Endothelzellen aus humanen pluripotenten Stammzellen in ca. 1 Woche vorgestellt.

Gerichtete Differenzierung hämogener Endothelzellen aus humanen pluripotenten Stammzellen

Blood vessels are ubiquitously distributed within all tissues of the body and perform diverse functions. Thus, derivation of mature vascular endothelial ...

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Erzeugung einer gut charakterisierten Population menschlicher hämogener Endothelzellen. Diese Zellen können verwendet werden, um die molekulare Regulation und den endothelialen zu hämatopoetischen Übergang zu untersuchen. Beginnen Sie mit der Kultivierung menschlicher embryonaler Stammzellen für vier Tage, um sie in primordiale Endothelzellen zu differenzieren.Am fünften Tag saugen Sie das Medium über den Zellen ab. Anschließend waschen Sie die Zellen vorsichtig mit einem Milliliter DMEM/F-12 pro Vertiefung. Fügen Sie einen Milliliter frisch zubereitetes hämogenes Endothelzelldifferenzierungsmedium pro Vertiefung hinzu und inkubieren Sie die Zellen für 24 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.Ersetzen Sie am sechsten und siebten Tag das Medium über den Zellen durch einen Milliliter frisch zubereitetes homogenes Endothelzelldifferenzierungsmedium pro Vertiefung und inkubieren Sie die Zellen für weitere 24 Stunden. Am achten Tag. Nach dem Ablösen und Waschen der Zellen teilen Sie sie gleichmäßig in Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis auf, die jeweils mindestens 600 Mikroliter Zellen mit einer Dichte von 1 mal 10 bis 5. Zellen pro Milliliter enthalten.Fügen Sie den Röhrchen, die Zellen enthalten, gegebenenfalls Antikörper hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten lang auf lichtgeschütztem Eis. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugieren bei 1000 mal G und 4 Grad Celsius für fünf Minuten. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Pellets in 600 Mikroliter eiskaltem Sortierpuffer.Die Proben werden durch die Mesh-Filterkappe aus fünf Milliliter-FACS-Röhrchen gespannt und die Zellen lichtgeschützt auf Eis gelagert, um sie sofort zu sortieren. Um hämogene Endothelzellen durch FACS zu isolieren, wird zunächst die CD45-negative Zellpopulation gettert. Dann innerhalb der CD45-negativen Population, Gate die CD31-positiven Zellen.Als nächstes innerhalb der CD31-positiven Population, Tor für die VE-Cadherin-negative Zellpopulation. Und dann innerhalb der VE-Cadherin-negativen Population, Tor für die c-Kit-positiven Zellen. Aus der c-Kit-positiven Population, Gate die CD34-positive Zellpopulation.Und schließlich aus der CD34-positiven Zellpopulation identifizieren und sammeln Sie die KDR-positiven Zellen. Nach der Aussaat hämogener Endothelzellen in einem Methylcellulose-basierten Medium, das für das Wachstum von hämatopoetischen Vorläuferzellen formuliert ist, werden am achten Tag koloniebildende Einheit-erythroide Kolonien und explosionsbildende Einheit-erythroide Kolonien gezählt. Koloniebildende Einheit-Granulozyten-Makrophage und koloniebildende Einheit-Granulozyten, Erythroide, Makrophagen und Megakaryozyten.Multipotente hämatopoetische Vorläuferkolonien werden am 14. Tag gezählt. Pro 1000 kologen Endothelzellen werden etwa 20 koloniebildende Einheiten erzeugt. Auch Zellen mit Endothelzellmorphologie sind in den Kulturen sichtbar.Dies sind die hämogenen Endothelzellen, die auf Einzelzellebene hämatopoetische Vorläuferzellen mit mehreren Linien hervorbringen. Dieses Protokoll ist ein 2D-Serum- und Maus-Feeder-freies Kultursystem, das in etwa einer Woche menschliche hämogene Endothelzellen erzeugen kann.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells

Direkte Induktion von Hemogenic Endothel und das Blut durch die Überexpression von Transkriptionsfaktoren in der Personal pluripotenten Stammzellen

During development, hematopoietic cells arise from a specialized subset of endothelial cells, hemogenic endothelium (HE). Modeling HE development in vitro ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Feeder freie Ableitung von Melanozyten aus humanen pluripotenten Stammzellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

Isolierung von murinen embryonalen Hemogenic Endothelial Cells

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Die Großproduktion von Kardiomyozyten aus humanen pluripotenten Stammzellen hochreproduzierbarer Kleinmolekül-basierte Differenzierung Protokoll

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Differenzierung der Primitive und Definitive hämatopoetischen Vorläuferzellen aus menschlichen pluripotente Stammzellen gerichtet

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In vitro Differenzierung von humanen pluripotenten Zellen in Trophoblastische Stammzellen

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Schnelle, gezielte Differenzierung der retinalen Pigment epithelialen Zellen aus menschlichen embryonalen oder induzierte pluripotente Stammzellen

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Effiziente und skalierbare gerichtete Differenzierung von klinisch kompatibel Hornhaut limbischen epithelialen Stammzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

Effiziente Differenzierung menschlicher pluripotenter Stammzellen in Leberzellen

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In vitro-Generation der Somiten Derivate aus menschlichen induzierten Zellen pluripotenten Stammzellen

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...