Name: directed differentiation of hemogenic endothelial cells from human pluripotent stem cells
Uploaded: 2021-03-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Directed Differentiation of Hemogenic Endothelial Cells from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Questo lavoro è stato parzialmente supportato dalle sovvenzioni NIH HL128064 e U2EB017103. Un ulteriore supporto è stato fornito dalla sovvenzione CT Innovations 15-RMB-YALE-04.

1. Reagenti e preparazione dei reagenti
NOTA: un elenco dei reagenti è fornito nella tabella dei materiali.
<ol><li>Ottenere le linee di cellule staminali pluripotenti umane: H1-hESC, H9-Fucci-hESC. NOTA: La generazione di EC emogeniche può essere più efficiente nella linea cellulare H1.</li>
	<li>Preparare le scorte di proteine della matrice: Aliquotare la proteina della matrice in provette pre-refrigerate da 1,5 mL (su ghiaccio) in modo che ogni provetta contenga 1 m...

<ol>
	<li>Giacomelli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cardiac+microtissues+composed+of+cardiomyocytes+and+endothelial+cells+co-differentiated+from+human+pluripotent+stem+cells.">Three-dimensional cardiac microtissues composed of cardiomyocytes and endothelial cells co-differentiated from human pluripotent stem cells.</a> Development. 144 (6), 1008-1017 (2017).</li><li>Wu, J., Wu, Z., Xue, Z., Li, H., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHBV/bioglass+composite+scaffolds+with+co-cultures+of+endothelial+cells+and+bone+marrow+stromal+cells+improve+vascularization+and+osteogenesis+for+bone+tissue+engineering.">PHBV/bioglass composite scaffolds with co-cultures of endothelial cells and bone marrow stromal cells improve vascularization and osteogenesis for bone tissue engineering.</a> RSC Advances. 7 (36), 22197-22207 (2017).</li><li>Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvasculature:+An+essential+component+for+organ-on-chip+systems.">Microvasculature: An essential component for organ-on-chip systems.</a> MRS Bulletin. 39 (1), 51-59 (2014).</li><li>Gritz, E., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+and+function+of+hemogenic+endothelium+during+embryogenesis.">Specification and function of hemogenic endothelium during embryogenesis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (8), 1547-1567 (2016).</li><li>Williams, I. M., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+endothelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells:+Methods,+considerations,+and+applications.">Generation of endothelial cells from human pluripotent stem cells: Methods, considerations, and applications.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (7), 1317-1329 (2019).</li><li>Olmer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+functional+endothelial+cells+in+scalable+suspension+culture.">Differentiation of human pluripotent stem cells into functional endothelial cells in scalable suspension culture.</a> Stem Cell Reports. 10 (5), 1657-1672 (2018).</li><li>Cossu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lancet+Commission:+Stem+cells+and+regenerative+medicine.">Lancet Commission: Stem cells and regenerative medicine.</a> The Lancet. 391 (10123), 883-910 (2018).</li><li>Fox, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+differentiated+pluripotent+stem+cells+in+replacement+therapy+for+treating+disease.">Use of differentiated pluripotent stem cells in replacement therapy for treating disease.</a> Science. 345 (6199), 1247391 (2014).</li><li>Mahla, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+applications+in+regenerative+medicine+and+disease+therapeutics.">Stem cells applications in regenerative medicine and disease therapeutics.</a> International Journal of Cell Biology. 2016, 1-24 (2016).</li><li>Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+as+a+disease+modeling+and+drug+screening+platform.">Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).</li><li>Rowe, R. G., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery.">Induced pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nature Reviews Genetics. 20 (7), 377-388 (2019).</li><li>Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+diseases+with+induced+pluripotent+stem+cells:+from+2D+to+3D+and+beyond.">Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond.</a> Development. 145 (5), (2018).</li><li>Wnorowski, A., Yang, H., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress,+obstacles,+and+limitations+in+the+use+of+stem+cells+in+organ-on-a-chip+models.">Progress, obstacles, and limitations in the use of stem cells in organ-on-a-chip models.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 3-11 (2019).</li><li>Ramme, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+induced+pluripotent+stem+cell-derived+four-organ-chip.">Autologous induced pluripotent stem cell-derived four-organ-chip.</a> Future Science OA. 5 (8), 1-12 (2019).</li><li>Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organs-on-a-Chip:+A+fast+track+for+engineered+human+tissues+in+drug+development.">Organs-on-a-Chip: A fast track for engineered human tissues in drug development.</a> Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).</li><li>Kane, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+endothelial+cells+from+human+embryonic+stem+cells+by+directed+differentiation:+analysis+of+microrna+and+angiogenesis+in+vitro+and+in+vivo.">Derivation of endothelial cells from human embryonic stem cells by directed differentiation: analysis of microrna and angiogenesis in vitro and in vivo.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 30 (7), 1389-1397 (2010).</li><li>Costa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+endothelial+cells+from+human+embryonic+stem+cells+in+fully+defined+medium+enables+identification+of+lysophosphatidic+acid+and+platelet+activating+factor+as+regulators+of+eNOS+localization.">Derivation of endothelial cells from human embryonic stem cells in fully defined medium enables identification of lysophosphatidic acid and platelet activating factor as regulators of eNOS localization.</a> Stem Cell Research. 10 (1), 103-117 (2013).</li><li>Nguyen, M. T. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+endothelial+progenitor+cells+on+laminins+in+defined+and+xeno-free+systems.">Differentiation of human embryonic stem cells to endothelial progenitor cells on laminins in defined and xeno-free systems.</a> Stem Cell Reports. 7 (4), 802-816 (2016).</li><li>Ikuno, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+robust+differentiation+of+endothelial+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+via+lineage+control+with+VEGF+and+cyclic+AMP.">Efficient and robust differentiation of endothelial cells from human induced pluripotent stem cells via lineage control with VEGF and cyclic AMP.</a> PLOS One. 12 (3), 0173271 (2017).</li><li>Aoki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+and+purification+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+endothelial+progenitor+cells+and+expansion+with+the+use+of+inhibitors+of+ROCK,+TGF-B,+and+GSK3B.">Efficient differentiation and purification of human induced pluripotent stem cell-derived endothelial progenitor cells and expansion with the use of inhibitors of ROCK, TGF-B, and GSK3B.</a> Heliyon. 6 (3), 03493 (2020).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+endothelial+progenitors+via+small-molecule+activation+of+Wnt+signaling.">Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of Wnt signaling.</a> Stem Cell Reports. 3 (5), 804-816 (2014).</li><li>Orlova, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation,+expansion+and+functional+analysis+of+endothelial+cells+and+pericytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation, expansion and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 9 (6), 1514-1531 (2014).</li><li>Kusuma, S., Gerecht, S., Turksen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+endothelial+cells+and+pericytes+from+human+pluripotent+stem+cells.">Derivation of endothelial cells and pericytes from human pluripotent stem cells.</a> Human Embryonic Stem Cell Protocols. , 213-222 (2014).</li><li>Bao, X., Lian, X., Palecek, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+endothelial+progenitor+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+wnt+activation+under+defined+conditions.">Directed endothelial progenitor differentiation from human pluripotent stem cells via wnt activation under defined conditions.</a> Methods in Molecular Biology. 1481, 183-196 (2016).</li><li>Xu, M., He, J., Zhang, C., Xu, J., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+derivation+of+endothelial+lineages+from+human+stem+cells.">Strategies for derivation of endothelial lineages from human stem cells.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 10 (1), 200 (2019).</li><li>Arora, S., Yim, E. K. F., Toh, Y. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+specification+of+pluripotent+stem+cell+derived+endothelial+cells+toward+arterial+and+venous+subtypes.">Environmental specification of pluripotent stem cell derived endothelial cells toward arterial and venous subtypes.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 143 (2019).</li><li>Fang, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear-induced+Notch-Cx37-p27+axis+arrests+endothelial+cell+cycle+to+enable+arterial+specification.">Shear-induced Notch-Cx37-p27 axis arrests endothelial cell cycle to enable arterial specification.</a> Nature Communications. 8 (1), 2149 (2017).</li><li>Dalton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+the+cell+cycle+to+cell+fate+decisions.">Linking the cell cycle to cell fate decisions.</a> Trends in Cell Biology. 25 (10), 592-600 (2015).</li><li>Wolf, K., Hu, H., Isaji, T., Dardik, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+identity+of+arteries,+veins,+and+lymphatics.">Molecular identity of arteries, veins, and lymphatics.</a> Journal of Vascular Surgery. 69 (1), 253-262 (2019).</li><li>Rocha, S. F., Adams, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+differentiation+and+specialization+of+vascular+beds.">Molecular differentiation and specialization of vascular beds.</a> Angiogenesis. 12 (2), 139-147 (2009).</li><li>Goldie, L. C., Lucitti, J. L., Dickinson, M. E., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+signaling+directing+the+formation+and+function+of+hemogenic+endothelium+during+murine+embryogenesis.">Cell signaling directing the formation and function of hemogenic endothelium during murine embryogenesis.</a> Blood. 112 (8), 3194-3204 (2008).</li><li>Chanda, B., Ditadi, A., Iscove, N. N., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+signaling+is+essential+for+embryonic+hematopoietic+stem+cell+development.">Retinoic acid signaling is essential for embryonic hematopoietic stem cell development.</a> Cell. 155 (1), 215-227 (2013).</li><li>Marcelo, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemogenic+endothelial+cell+specification+requires+c-kit,+notch+signaling,+and+p27-mediated+cell-cycle+control.">Hemogenic endothelial cell specification requires c-kit, notch signaling, and p27-mediated cell-cycle control.</a> Developmental Cell. 27 (5), 504-515 (2013).</li><li>Dejana, E., Hirschi, K. K., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+of+endothelial+cell+plasticity.">The molecular basis of endothelial cell plasticity.</a> Nature Communications. 8 (1), 14361 (2017).</li><li>Ottersbach, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial-to-haematopoietic+transition:+an+update+on+the+process+of+making+blood.">Endothelial-to-haematopoietic transition: an update on the process of making blood.</a> Biochemical Society Transactions. 47 (2), 591-601 (2019).</li><li>Pauklin, S., Vallier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell-cycle+state+of+stem+cells+determines+cell+fate+propensity.">The cell-cycle state of stem cells determines cell fate propensity.</a> Cell. 155 (1), 135-147 (2013).</li><li>Qiu, J., Nordling, S., Vasavada, H. H., Butcher, E. C., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+promotes+endothelial+cell+cycle+early+g1+state+to+enable+human+hemogenic+endothelial+cell+specification.">Retinoic acid promotes endothelial cell cycle early g1 state to enable human hemogenic endothelial cell specification.</a> Cell Reports. 33 (9), 108465 (2020).</li><li>Sriram, G., Tan, J. Y., Islam, I., Rufaihah, A. J., Cao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+arterial+and+venous+endothelial+cells+under+feeder-+and+serum-free+conditions.">Efficient differentiation of human embryonic stem cells to arterial and venous endothelial cells under feeder- and serum-free conditions.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 6 (1), 261 (2015).</li><li>Ohta, R., Sugimura, R., Niwa, A., Saito, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemogenic+endothelium+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+in+a+feeder-+and+xeno-free+defined+condition.">Hemogenic endothelium differentiation from human pluripotent stem cells in a feeder- and xeno-free defined condition.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59823 (2019).</li><li>Galat, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine-free+directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+efficiently+produces+hemogenic+endothelium+with+lymphoid+potential.">Cytokine-free directed differentiation of human pluripotent stem cells efficiently produces hemogenic endothelium with lymphoid potential.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 8 (1), 67 (2017).</li><li>Sidney, L. E., Branch, M. J., Dunphy, S. E., Dua, H. S., Hopkinson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Evidence+for+CD34+as+a+common+marker+for+diverse+progenitors.">Concise review: Evidence for CD34 as a common marker for diverse progenitors.</a> Stem Cells. 32 (6), 1380-1389 (2014).</li></ol>

Qui, vengono delineati i passaggi per la produzione di cellule endoteliali emogeniche da cellule staminali embrionali umane in circa 1 settimana utilizzando un sistema di coltura 2D senza siero e alimentatore murino (Figura 1). Questo protocollo espande un metodo descritto da Sriram et al. (2015) per ottenere EC primordiali38. La natura primordiale e il potenziale di specificazione delle EC CD31+ CD45- sono dimostrate coltivando queste cellule su...

Le cellule endoteliali (ECs) sono una popolazione eterogenea di cellule che svolgono molteplici funzioni in tutto il corpo umano e nei tessuti ingegnerizzati. Oltre a sostenere e regolare altri tipi di cellule (ad esempio, cardiomiociti1, cellule osteoblastiche2), queste funzioni includono la formazione di una barriera selettiva tra sangue e tessuti e l'assistenza nella formazione dei tessuti3. La differenziazione delle EC mature durante lo sviluppo normale richiede diverse vie di segnalazione. Le EC primordiali derivano dai progenitori del mesoderma e sono quindi specificate verso fenotipi arteriosi, venosi, capillari e linfatici maturi4. Inoltre, un piccolo sottogruppo di EC nel sacco vitellino extraembrionale e nella regione embrionale Aorta-Gonad-Mesonephros (AGM) sono anche specificati per diventare EC emogeniche, che danno origine a cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC) che migrano verso il fegato fetale e il midollo osseo fetale, dove rimangono postnatali e generano tutti i tipi di cellule del sangue per tutta la vita4. La vasta gamma di fenotipi EC è essenziale per lo sviluppo e il mantenimento di tutti i tessuti.
Pertanto, le EC e i loro derivati sono componenti critiche di studi volti a modellare e chiarire i meccanismi dello sviluppo umano e / o delle malattie, nonché della medicina rigenerativa e delle applicazioni di ingegneria tissutale 5,6,7,8. Tuttavia, la limitazione principale per questi tipi di studi è la mancanza di disponibilità di EC umane primarie nella quantità richiesta. È stato stimato che per la maggior partedelle applicazioni terapeutiche sarebbero necessarie almeno 3 x 108 CE. Per risolvere questo problema, è stato proposto l'uso di cellule staminali embrionali umane (hESC) e cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSCs) a causa del loro diverso potenziale di lignaggio e della loro capacità di generare un gran numero di progenie 6,9.
Infatti, l'utilità delle cellule derivate da hESCs o hiPSCs è stata dimostrata in molteplici studi incentrati sulla modellizzazione della malattia e sullo screening dei farmaci10,11,12. La tecnologia Organ-on-a-Chip (OOC) è stata utilizzata per ricapitolare più fedelmente la fisiologia del corpo umano integrando cellule e tessuti in scaffold tridimensionali. Inoltre, la connessione di più OOC individuali (un cosiddetto body- o human-on-a-chip, BOC / HOC) può essere realizzata tramite microfluidica per consentire la diafonia tra gli organi di interesse13,14,15. I tessuti di supporto, come il sistema vascolare, sono componenti critici di OOC e BOC / HOC; L'incorporazione della vascolarizzazione consente il trasporto di nutrienti, ossigeno e fattori paracrini in tutti i tessuti, promuovendo così il microambiente tessuto-specifico richiesto 3,12. Pertanto, i metodi per derivare EC umane mature, come le EC arteriose, venose, linfatiche ed emogeniche, sono cruciali per far progredire questi approcci di ingegneria tissutale.
Sono stati pubblicati protocolli multipli che descrivono in dettaglio le fasi per la derivazione di EC primordiali o progenitrici umane da hESC o hiPSCs 5,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 . Molti di questi protocolli si basano sulla formazione di corpi embrioidi (EB) o sulla co-coltura di ESCs/iPSCs con uno strato murino di cellule stromali. Queste strategie tendono ad essere difficili e richiedono tempo, con basse rese EC e / o contaminazione di EC umane con cellule murine. I protocolli che si basano strettamente sulla coltura 2D senza l'uso di cellule stromali spesso richiedono lunghe induzioni, utilizzano complesse combinazioni di fattori di crescita e / o inibitori per l'induzione, hanno periodi di espansione prolungati dopo la separazione cellulare o una combinazione di questi fattori. L'avanzamento della conoscenza delle vie di segnalazione e dei fattori coinvolti nella derivazione di tipi maturi di EC in vivo fornisce le basi per un protocollo di differenziazione in vitro semplice e robusto.
In precedenza, sono stati identificati ruoli chiave per le vie di segnalazione di Notch e acido retinoico (RA) nella specifica delle EC arteriose murine ed emogeniche, rispettivamente, durante lo sviluppo. La via di segnalazione di Notch svolge molteplici ruoli nella specificazione e nel mantenimento del fenotipo EC arterioso. Il lavoro che utilizza il modello di vascolarizzazione retinica murina ha identificato un percorso in cui lo stress di taglio del fluido induce un asse di segnalazione Notch-Cx37-p27, promuovendo l'arresto del ciclo cellulare G1, che consente la specifica EC arteriosa27. È stato ipotizzato che gli stati del ciclo cellulare svolgano un ruolo nelle decisioni sul destino cellulare fornendo finestre di opportunità distinte in cui le cellule sono ricettive a determinati segnali che possono indurre espressione genica e cambiamenti fenotipici28. Questo arresto G1 mediato da Notch ha permesso l'espressione di geni arricchiti nelle EC arteriose, tra cui ephrinB2, Cx40, DLL4, Notch1 e Notch 4 (recensito in29,30). È stato anche dimostrato che la specifica EMOGENIC EC è promossa in vivo tramite la segnalazione RA31,32. Ulteriori studi hanno identificato che, a valle della segnalazione RA, l'espressione di c-Kit e Notch upregola p27, che consente la specificazione emogenica nel sacco vitellino murino e AGM33. Le EC emogeniche murine possono essere minimamente identificate dall'espressione di entrambi i marcatori endoteliali (CD31, KDR) ed ematopoietici (c-Kit, CD34)4. Infine, le EC emogeniche subiscono una transizione endoteliale-ematopoietica (EHT) per formare HSPC, che può dare origine a tutti i tipi di cellule del sangue 4,34,35.
Lavori recenti hanno testato se questa stessa gerarchia di segnalazione può promuovere la specifica EC ematogena umana. Per fare ciò, è stato sviluppato un protocollo di coltura 2D privo di siero e alimentatore per derivare EC emogeniche da hESC, e queste EC emogeniche sono state caratterizzate a livello di singola cellula come CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherin-CD45-. Questo studio ha anche sfruttato il reporter FUCCI (Fluorescent Ubiquitination Cell Cycle Indicator), che identifica diversi stati del ciclo cellulare, utilizzando H9-hESC che esprimono il costrutto del reporter FUCCI (H9-FUCCI-hESC)36. Negli studi con queste cellule, è stato dimostrato che l'AR promuove l'arresto precoce del ciclo cellulare G1 nelle EC e lo stato precoce di G1 consente la specifica ematogena in vitro37. Qui viene fornito un protocollo dettagliato per la differenziazione di queste cellule endoteliali emogeniche umane e saggi che confermano la loro identità. Questo semplice metodo fornisce un mezzo utile per generare questo sottoinsieme specializzato di EC per studi futuri sui meccanismi di sviluppo delle cellule del sangue umano.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 cm dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430599</td>
			<td>tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td>tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td>tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimicrobial reagent 
			Brand Name: Normocin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>ant-nr-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>233-FB-025</td>
			<td>use at 50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>595202</td>
			<td>use at 25 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Detatchment Solution 
			Brand Name: vAccutase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DLL4</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>1506-D4/CF</td>
			<td>recombinant human; use at 10 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM:F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial cell growth medium 
			Brand Name: EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit (EGM-2)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td>polystyrene round bottom with filter cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gemini Bio</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>33016015</td>
			<td>use at 4 mg/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSK3i/CHIR99021</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0004-02</td>
			<td>10 mM stock; use at 5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144S-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix protein&#160; 
			Brand Name: Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356230</td>
			<td>Growth factor reduced. Refer to the Certificate of Analysis for the lot to determine the protein (Matrigel) concentration. This concentration is required to calculate the volume of Matrigel that contains 1 mg of protein.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose-based medium 
			Brand Name: MethoCult H4435 Enriched</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>4435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluripotent stem cell differentiation medium 
			Brand Name: STEMdiff APEL 2</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluripotent stem cells: H1, H9, H9-FUCCI</td>
			<td>WiCell</td>
			<td>WA09 (H9), WA01 (H1)</td>
			<td>human; H9-FUCCI were obtained from Dr. Ludovic Vallier&#39;s lab at Cambridge Stem Cell Institute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein-Free Hybridoma Medium (PFMH)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12040077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R2625-50mg</td>
			<td>use at 0.5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse transcription master mix 
			Brand Name: iScript Reverse Transcription Supermix</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1708840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction kit 
			Brand Name: RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SS255-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stem cell growth medium 
			Brand Name: mTeSR1</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green master mix 
			Brand Name: iTaq Universal SYBR Green Master Mix</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1725121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25299956</td>
			<td>0.25%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF165 (VEGF-A)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-20</td>
			<td>use at 50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-CD31-FITC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>303104</td>
			<td>2 &#956;g/mL*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-CD34-Pacific Blue</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>343512</td>
			<td>2 &#956;g/mL*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-CD45-APC/Cy7</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304014</td>
			<td>2 &#956;g/mL*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-c-Kit-APC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>313206</td>
			<td>2 &#956;g/mL*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Flk-1-PE/Cy7</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>359911</td>
			<td>2 &#956;g/mL*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-VE-Cadherin-PE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>348506</td>
			<td>2 &#956;g/mL*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">* Antibody fluorescent conjugates should be optimized based on the cell sorter used. Presented here are the final concentrations utilized in this study.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

directed differentiation of hemogenic endothelial cells from human pluripotent stem cells

I vasi sanguigni sono distribuiti ubiquitariamente all'interno di tutti i tessuti del corpo e svolgono diverse funzioni. Pertanto, la derivazione di cellule endoteliali vascolari mature, che rivestono i lumi dei vasi sanguigni, da cellule staminali pluripotenti umane è cruciale per una moltitudine di applicazioni di ingegneria e rigenerazione tissutale. In vivo, le cellule endoteliali primordiali derivano dalla linea mesodermica e sono specificate verso sottotipi specifici, tra cui arterioso, venoso, capillare, emogenico e linfatico. Le cellule endoteliali emogeniche sono di particolare interesse perché, durante lo sviluppo, danno origine a cellule staminali e progenitrici ematopoietiche, che generano quindi tutte le linee di sangue per tutta la vita. Pertanto, la creazione di un sistema per generare cellule endoteliali emogeniche in vitro offrirebbe l'opportunità di studiare la transizione endoteliale-ematopoietica e potrebbe portare alla produzione ex vivo di prodotti sanguigni umani e a una ridotta dipendenza da donatori umani. Mentre esistono diversi protocolli per la derivazione di cellule endoteliali progenitrici e primordiali, non è stata descritta la generazione di cellule endoteliali emogeniche ben caratterizzate da cellule staminali umane. Qui viene presentato un metodo per la derivazione di cellule endoteliali emogeniche da cellule staminali embrionali umane in circa 1 settimana: un protocollo di differenziazione con cellule striate primitive formate in risposta all'inibitore GSK3β (CHIR99021), quindi induzione della linea mesodermica mediata da bFGF, seguita dallo sviluppo di cellule endoteliali primordiali promosso da BMP4 e VEGF-A, e infine specificazione di cellule endoteliali emogeniche indotte dall'acido retinoico. Questo protocollo produce una popolazione ben definita di cellule endoteliali emogeniche che possono essere utilizzate per comprendere ulteriormente la loro regolazione molecolare e la transizione endoteliale-ematopoietica, che ha il potenziale per essere applicata alle applicazioni terapeutiche a valle.

Uno schema che delinea le specifiche delle EC primordiali e delle EC emogeniche dalle hESC e un'immagine rappresentativa delle cellule 24 ore dopo la placcatura sono mostrati nella Figura 1. Seguendo le specifiche, le EC primordiali e le EC emogeniche sono FACS purificate rispettivamente nei giorni 5 e 8. Le EC primordiali sono definite come CD31+ CD45- e le EC emogeniche sono definite come CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherin- CD45-...

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Directed Differentiation of Hemogenic Endothelial Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Presentato qui è un semplice protocollo per la differenziazione diretta delle cellule endoteliali emogeniche da cellule staminali pluripotenti umane in circa 1 settimana.

Differenziazione diretta di cellule endoteliali emogeniche da cellule staminali pluripotenti umane

Blood vessels are ubiquitously distributed within all tissues of the body and perform diverse functions. Thus, derivation of mature vascular endothelial ...

Questo protocollo descrive un metodo per generare una popolazione ben caratterizzata di cellule endoteliali emogeniche umane. Queste cellule possono essere utilizzate per studiare la regolazione molecolare e la transizione endoteliale-ematopoietica. Inizia coltivando cellule staminali embrionali umane per quattro giorni per differenziarle in cellule endoteliali primordiali.Il quinto giorno, aspirare il mezzo sopra le cellule. Quindi lavare delicatamente le cellule con un millilitro di DMEM / F-12 per pozzetto. Aggiungere un millilitro di mezzo di differenziazione delle cellule endoteliali ematogeniche appena preparato per pozzetto e incubare le cellule per 24 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.Il sesto e il settimo giorno, sostituire il mezzo sopra le cellule con un millilitro di mezzo di differenziazione delle cellule endoteliali omogenee appena preparato per pozzetto e incubare le cellule per altre 24 ore. L'ottavo giorno. Dopo aver staccato e lavato le celle, dividerle uniformemente in provette da microcentrifuga su ghiaccio, ciascuna contenente un minimo di 600 microlitri di cellule ad una densità di 1 volte 10 alle 5 celle per millilitro.Aggiungere anticorpi alle provette contenenti le cellule come appropriato e incubare su ghiaccio protetto dalla luce per 30 minuti. Pellettare le celle mediante centrifugazione a 1000 volte G e 4 gradi Celsius per cinque minuti. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 600 microlitri di tampone di selezione ghiacciato.Filtrare i campioni attraverso il tappo filtrante a rete di tubi FACS da cinque millilitri e conservare le celle su ghiaccio al riparo dalla luce per la selezione immediata delle cellule. Per isolare le cellule endoteliali emogeniche mediante FACS, prima eliminare la popolazione cellulare CD45-negativa. Quindi, all'interno della popolazione CD45-negativa, le cellule CD31-positive.Successivamente all'interno della popolazione CD31-positiva, porta per la popolazione cellulare VE-caderina-negativa. E poi all'interno della popolazione VE-caderina-negativa, porta per le cellule c-Kit-positive. Dalla popolazione c-Kit-positiva, porta la popolazione cellulare CD34-positiva.E infine dalla popolazione cellulare CD34-positiva, identificare e raccogliere le cellule KDR-positive. Dopo aver seminato cellule endoteliali emogeniche in un mezzo a base di metilcellulosa formulato per la crescita di cellule progenitrici ematopoietiche, le colonie di unità eritroidi formanti colonie e unità eritroidi formanti esplosione vengono contate l'ottavo giorno. Unità formante colonie-granulociti-macrofagi e unità formanti colonie-granulociti, eritroidi, macrofagi e megacariociti.Le colonie progenitrici ematopoietiche multipotenti vengono contate il giorno 14. Per 1000 cellule endoteliali emogeniche placcate, vengono generate circa 20 unità formanti colonie. Nelle colture sono visibili anche cellule con morfologia cellulare endoteliale.Queste sono le cellule endoteliali emogeniche che danno origine a progenitori ematopoietici multilineare a livello unicellulare. Questo protocollo è un sistema di coltura 2D privo di siero e alimentatore murino in grado di generare cellule endoteliali emogeniche umane in circa una settimana.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells

Induzione diretta di Hemogenic endotelio e Sangue da sovraespressione di fattori di trascrizione in cellule staminali pluripotenti umane

During development, hematopoietic cells arise from a specialized subset of endothelial cells, hemogenic endothelium (HE). Modeling HE development in vitro ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Derivazione senza alimentatore di melanociti da cellule staminali umane pluripotenti

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

Isolamento di cellule murine embrionali Hemogenic endoteliali

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Produzione su larga scala dei cardiomiociti da cellule staminali umane pluripotenti usando un altamente riproducibile piccole molecole-Based Differenziazione protocollo

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

Regia di differenziazione dei progenitori ematopoietici primitivi e definitivo da cellule staminali pluripotenti umane

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In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

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La differenziazione in vitro di pluripotenti umane Cellule Staminali in cellule trofoblastiche

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Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Efficiente e scalabile di differenziazione diretto di clinicamente compatibile corneale Limbal cellule staminali epiteliali da cellule staminali pluripotenti umane

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Differenziazione efficiente delle cellule staminali pluripotenti umane nelle cellule del fegato

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In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generazione in Vitro di Somite derivati da umani indotta da cellule staminali pluripotenti indotte

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