Name: directed differentiation of hemogenic endothelial cells from human pluripotent stem cells
Uploaded: 2021-03-31T14:00:00
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この作業は、NIH助成金HL128064およびU2EB017103によって部分的にサポートされました。CT Innovations 15-RMB-YALE-04助成金によってさらなる支援が提供されました。

1.試薬および試薬調製
注:試薬のリストは 、材料の表に記載されています。
<ol><li>ヒト多能性幹細胞株を入手します:H1-hESC、H9-フッチ-hESC。 注:血発生性ECの生成は、H1細胞株でより効率的である可能性があります。</li>
	<li>マトリックスタンパク質ストックの準備:マトリックスタンパク質を事前に冷やした1.5 mLチューブ(氷上)に分注し、各チューブに1 mgの?...

<ol>
	<li>Giacomelli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cardiac+microtissues+composed+of+cardiomyocytes+and+endothelial+cells+co-differentiated+from+human+pluripotent+stem+cells.">Three-dimensional cardiac microtissues composed of cardiomyocytes and endothelial cells co-differentiated from human pluripotent stem cells.</a> Development. 144 (6), 1008-1017 (2017).</li><li>Wu, J., Wu, Z., Xue, Z., Li, H., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHBV/bioglass+composite+scaffolds+with+co-cultures+of+endothelial+cells+and+bone+marrow+stromal+cells+improve+vascularization+and+osteogenesis+for+bone+tissue+engineering.">PHBV/bioglass composite scaffolds with co-cultures of endothelial cells and bone marrow stromal cells improve vascularization and osteogenesis for bone tissue engineering.</a> RSC Advances. 7 (36), 22197-22207 (2017).</li><li>Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvasculature:+An+essential+component+for+organ-on-chip+systems.">Microvasculature: An essential component for organ-on-chip systems.</a> MRS Bulletin. 39 (1), 51-59 (2014).</li><li>Gritz, E., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+and+function+of+hemogenic+endothelium+during+embryogenesis.">Specification and function of hemogenic endothelium during embryogenesis.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (8), 1547-1567 (2016).</li><li>Williams, I. M., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+endothelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells:+Methods,+considerations,+and+applications.">Generation of endothelial cells from human pluripotent stem cells: Methods, considerations, and applications.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (7), 1317-1329 (2019).</li><li>Olmer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+functional+endothelial+cells+in+scalable+suspension+culture.">Differentiation of human pluripotent stem cells into functional endothelial cells in scalable suspension culture.</a> Stem Cell Reports. 10 (5), 1657-1672 (2018).</li><li>Cossu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lancet+Commission:+Stem+cells+and+regenerative+medicine.">Lancet Commission: Stem cells and regenerative medicine.</a> The Lancet. 391 (10123), 883-910 (2018).</li><li>Fox, I. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+differentiated+pluripotent+stem+cells+in+replacement+therapy+for+treating+disease.">Use of differentiated pluripotent stem cells in replacement therapy for treating disease.</a> Science. 345 (6199), 1247391 (2014).</li><li>Mahla, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+applications+in+regenerative+medicine+and+disease+therapeutics.">Stem cells applications in regenerative medicine and disease therapeutics.</a> International Journal of Cell Biology. 2016, 1-24 (2016).</li><li>Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+as+a+disease+modeling+and+drug+screening+platform.">Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).</li><li>Rowe, R. G., Daley, G. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery.">Induced pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nature Reviews Genetics. 20 (7), 377-388 (2019).</li><li>Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+human+diseases+with+induced+pluripotent+stem+cells:+from+2D+to+3D+and+beyond.">Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond.</a> Development. 145 (5), (2018).</li><li>Wnorowski, A., Yang, H., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress,+obstacles,+and+limitations+in+the+use+of+stem+cells+in+organ-on-a-chip+models.">Progress, obstacles, and limitations in the use of stem cells in organ-on-a-chip models.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 3-11 (2019).</li><li>Ramme, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+induced+pluripotent+stem+cell-derived+four-organ-chip.">Autologous induced pluripotent stem cell-derived four-organ-chip.</a> Future Science OA. 5 (8), 1-12 (2019).</li><li>Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organs-on-a-Chip:+A+fast+track+for+engineered+human+tissues+in+drug+development.">Organs-on-a-Chip: A fast track for engineered human tissues in drug development.</a> Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).</li><li>Kane, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+endothelial+cells+from+human+embryonic+stem+cells+by+directed+differentiation:+analysis+of+microrna+and+angiogenesis+in+vitro+and+in+vivo.">Derivation of endothelial cells from human embryonic stem cells by directed differentiation: analysis of microrna and angiogenesis in vitro and in vivo.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 30 (7), 1389-1397 (2010).</li><li>Costa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+endothelial+cells+from+human+embryonic+stem+cells+in+fully+defined+medium+enables+identification+of+lysophosphatidic+acid+and+platelet+activating+factor+as+regulators+of+eNOS+localization.">Derivation of endothelial cells from human embryonic stem cells in fully defined medium enables identification of lysophosphatidic acid and platelet activating factor as regulators of eNOS localization.</a> Stem Cell Research. 10 (1), 103-117 (2013).</li><li>Nguyen, M. T. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+endothelial+progenitor+cells+on+laminins+in+defined+and+xeno-free+systems.">Differentiation of human embryonic stem cells to endothelial progenitor cells on laminins in defined and xeno-free systems.</a> Stem Cell Reports. 7 (4), 802-816 (2016).</li><li>Ikuno, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+robust+differentiation+of+endothelial+cells+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+via+lineage+control+with+VEGF+and+cyclic+AMP.">Efficient and robust differentiation of endothelial cells from human induced pluripotent stem cells via lineage control with VEGF and cyclic AMP.</a> PLOS One. 12 (3), 0173271 (2017).</li><li>Aoki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+and+purification+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+endothelial+progenitor+cells+and+expansion+with+the+use+of+inhibitors+of+ROCK,+TGF-B,+and+GSK3B.">Efficient differentiation and purification of human induced pluripotent stem cell-derived endothelial progenitor cells and expansion with the use of inhibitors of ROCK, TGF-B, and GSK3B.</a> Heliyon. 6 (3), 03493 (2020).</li><li>Lian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+endothelial+progenitors+via+small-molecule+activation+of+Wnt+signaling.">Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of Wnt signaling.</a> Stem Cell Reports. 3 (5), 804-816 (2014).</li><li>Orlova, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation,+expansion+and+functional+analysis+of+endothelial+cells+and+pericytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation, expansion and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 9 (6), 1514-1531 (2014).</li><li>Kusuma, S., Gerecht, S., Turksen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+endothelial+cells+and+pericytes+from+human+pluripotent+stem+cells.">Derivation of endothelial cells and pericytes from human pluripotent stem cells.</a> Human Embryonic Stem Cell Protocols. , 213-222 (2014).</li><li>Bao, X., Lian, X., Palecek, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+endothelial+progenitor+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+wnt+activation+under+defined+conditions.">Directed endothelial progenitor differentiation from human pluripotent stem cells via wnt activation under defined conditions.</a> Methods in Molecular Biology. 1481, 183-196 (2016).</li><li>Xu, M., He, J., Zhang, C., Xu, J., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+derivation+of+endothelial+lineages+from+human+stem+cells.">Strategies for derivation of endothelial lineages from human stem cells.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 10 (1), 200 (2019).</li><li>Arora, S., Yim, E. K. F., Toh, Y. -. 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F., Adams, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+differentiation+and+specialization+of+vascular+beds.">Molecular differentiation and specialization of vascular beds.</a> Angiogenesis. 12 (2), 139-147 (2009).</li><li>Goldie, L. C., Lucitti, J. L., Dickinson, M. E., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+signaling+directing+the+formation+and+function+of+hemogenic+endothelium+during+murine+embryogenesis.">Cell signaling directing the formation and function of hemogenic endothelium during murine embryogenesis.</a> Blood. 112 (8), 3194-3204 (2008).</li><li>Chanda, B., Ditadi, A., Iscove, N. N., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+signaling+is+essential+for+embryonic+hematopoietic+stem+cell+development.">Retinoic acid signaling is essential for embryonic hematopoietic stem cell development.</a> Cell. 155 (1), 215-227 (2013).</li><li>Marcelo, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemogenic+endothelial+cell+specification+requires+c-kit,+notch+signaling,+and+p27-mediated+cell-cycle+control.">Hemogenic endothelial cell specification requires c-kit, notch signaling, and p27-mediated cell-cycle control.</a> Developmental Cell. 27 (5), 504-515 (2013).</li><li>Dejana, E., Hirschi, K. K., Simons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+of+endothelial+cell+plasticity.">The molecular basis of endothelial cell plasticity.</a> Nature Communications. 8 (1), 14361 (2017).</li><li>Ottersbach, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial-to-haematopoietic+transition:+an+update+on+the+process+of+making+blood.">Endothelial-to-haematopoietic transition: an update on the process of making blood.</a> Biochemical Society Transactions. 47 (2), 591-601 (2019).</li><li>Pauklin, S., Vallier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell-cycle+state+of+stem+cells+determines+cell+fate+propensity.">The cell-cycle state of stem cells determines cell fate propensity.</a> Cell. 155 (1), 135-147 (2013).</li><li>Qiu, J., Nordling, S., Vasavada, H. H., Butcher, E. C., Hirschi, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+acid+promotes+endothelial+cell+cycle+early+g1+state+to+enable+human+hemogenic+endothelial+cell+specification.">Retinoic acid promotes endothelial cell cycle early g1 state to enable human hemogenic endothelial cell specification.</a> Cell Reports. 33 (9), 108465 (2020).</li><li>Sriram, G., Tan, J. Y., Islam, I., Rufaihah, A. J., Cao, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+to+arterial+and+venous+endothelial+cells+under+feeder-+and+serum-free+conditions.">Efficient differentiation of human embryonic stem cells to arterial and venous endothelial cells under feeder- and serum-free conditions.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 6 (1), 261 (2015).</li><li>Ohta, R., Sugimura, R., Niwa, A., Saito, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemogenic+endothelium+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+in+a+feeder-+and+xeno-free+defined+condition.">Hemogenic endothelium differentiation from human pluripotent stem cells in a feeder- and xeno-free defined condition.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59823 (2019).</li><li>Galat, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine-free+directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+efficiently+produces+hemogenic+endothelium+with+lymphoid+potential.">Cytokine-free directed differentiation of human pluripotent stem cells efficiently produces hemogenic endothelium with lymphoid potential.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 8 (1), 67 (2017).</li><li>Sidney, L. E., Branch, M. J., Dunphy, S. E., Dua, H. S., Hopkinson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+Evidence+for+CD34+as+a+common+marker+for+diverse+progenitors.">Concise review: Evidence for CD34 as a common marker for diverse progenitors.</a> Stem Cells. 32 (6), 1380-1389 (2014).</li></ol>

本明細書では、マウスフィーダーおよび無血清2D培養システム(図1)を用いて、約1週間でヒト胚性幹細胞から血原性内皮細胞を作製するステップを概説する。このプロトコルは、Sriramら(2015)によって記述された方法を拡張して、原始EC38を取得します。CD31+ CD45-ECの原始的な性質と仕様の可能性は、これらの細胞をDLL4コーティングプレート...

内皮細胞(EC)は、人体全体および操作された組織で複数の機能を果たす細胞の不均一な集団です。これらの機能には、他の細胞型(心筋細胞1、骨芽細胞2)をサポートおよび調節することに加えて、血液と組織の間に選択的バリアを形成し、組織形成を支援することが含まれます3。正常な発達中の成熟ECの分化には、多様なシグナル伝達経路が必要です。原始ECは中胚葉前駆細胞に由来し、成熟した動脈、静脈、毛細血管、リンパの表現型4に向けて指定されます。さらに、胚性卵黄嚢および胚性大動脈-生殖腺-中腎(AGM)領域のECの小さなサブセットも、胎児の肝臓と胎児の骨髄に移動する造血幹および前駆細胞(HSPC)を生じさせ、そこで出生後に留まり、生涯を通じてすべての血球タイプを生成します4。多様なEC表現型は、すべての組織の発生と維持に不可欠です。
したがって、ECとその誘導体は、ヒトの発生および/または疾患のモデル化およびメカニズムの解明、ならびに再生医療および組織工学の応用を目的とした研究の重要な要素です5,6,7,8。ただし、これらのタイプの研究の主な制限は、必要な量で主要なヒトECが利用できないことです。治療用途の大部分には、最低3 x 108 ECが必要になると推定されています6。この問題を解決するために、ヒト胚性幹細胞(hESC)およびヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)は、それらの多様な系統の可能性および多数の子孫を生成する能力のために提案されている6,9。
実際、hESCまたはhiPS細胞に由来する細胞の有用性は、疾患モデリングおよび薬物スクリーニングに焦点を当てた複数の研究で実証されている10、11、12。Organ-on-a-Chip(OOC)技術は、細胞や組織を3次元の足場に統合することにより、人体の生理機能をより忠実に再現するために使用されてきました。さらに、複数の個々のOOC(いわゆるボディオンチップまたはヒューマンオンチップ、BOC / HOC)の接続は、マイクロフルイディクスを介して達成でき、関心のある器官間のクロストークを可能にします13、14、15。血管系などの支持組織は、OOCおよびBOC / HOCの重要な要素です。血管系を組み込むことは、組織全体にわたる栄養素、酸素、およびパラクリン因子の輸送を可能にし、それによって必要な組織特異的微小環境を促進する3,12。したがって、動脈、静脈、リンパ、および血発生ECなどの成熟ヒトECを導出する方法は、これらの組織工学的アプローチを前進させるために不可欠です。
hESCまたはhiPS細胞からヒト始原性または前駆細胞ECを誘導するためのステップを詳述した複数のプロトコルが公開されている5、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26.これらのプロトコルの多くは、ESC/iPS細胞と間質細胞のマウスフィーダー層との胚様体(EB)形成または共培養に依存しています。これらの戦略は、EC収率が低く、および/またはマウス細胞によるヒトECの汚染により、困難で時間がかかる傾向があります。間質細胞を使用せずに2D培養に厳密に依存するプロトコルは、多くの場合、長い誘導を必要とし、誘導のために成長因子および/または阻害剤の複雑な組み合わせを利用し、細胞分離後の拡張期間が長くなる、またはこれらの因子の組み合わせを有する。in vivoでの成熟ECタイプの導出に関与するシグナル伝達経路および因子に関する知識の進歩は、簡単で堅牢なin vitro分化プロトコルの基礎を提供します。
以前は、発生中のマウス動脈および血原性ECの仕様におけるNotchおよびレチノイン酸(RA)シグナル伝達経路の重要な役割がそれぞれ特定されていました。Notchシグナル伝達経路は、動脈EC表現型の仕様と維持において複数の役割を果たします。マウス網膜血管新生モデルを用いた研究では、流体せん断応力がNotch-Cx37-p27シグナル伝達軸を誘導し、G1細胞周期停止を促進する経路が同定され、動脈EC仕様27が可能になりました。細胞周期の状態は、細胞が遺伝子発現および表現型の変化を誘発することができる特定のシグナルを受け入れる明確な機会の窓を提供することによって、細胞の運命決定において役割を果たすと仮定されている28。このNotchを介したG1停止により、エフリンB2、Cx40、DLL4、Notch1、およびNotch 4などの動脈ECに富む遺伝子の発現が可能になりました(29,30でレビュー)。また、血原性EC仕様は、RAシグナル伝達を介してインビボで促進されることも示されている31,32。追加の研究では、RAシグナル伝達の下流で、c-KitとNotchの発現がp27をアップレギュレートし、マウス卵黄嚢とAGM33の血原性仕様を可能にすることが確認されました。マウスの血原性ECは、内皮(すなわち、CD31、KDR)および造血(すなわち、c-Kit、CD34)マーカーの両方の発現によって最小限に同定することができる4。最後に、血原性ECは内皮から造血への移行(EHT)を受けてHSPCを形成し、すべての血球タイプを生じさせる可能性があります4,34,35。
最近の研究では、この同じシグナル伝達階層がヒト血原性EC仕様を促進できるかどうかをテストしました。そのために、hESCから血発生性ECを誘導するための血清およびフィーダーフリーの2D培養プロトコルが開発され、これらの血発生性ECはCD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-カドヘリン- CD45-として単一細胞レベルで特徴付けられました。この研究では、FUCCIレポーターコンストラクト(H9-FUCCI-hESC)を発現するH9-hESCを使用して、さまざまな細胞周期状態を識別する蛍光ユビキチン化細胞周期インジケーター(FUCCI)レポーターも利用しました36。これらの細胞を用いた研究では、RAがECにおける早期G1細胞周期停止を促進し、初期のG1状態がin vitroでの血原性仕様を可能にすることが実証された37。本明細書では、これらのヒト血原性内皮細胞の分化のための詳細なプロトコールおよびそれらの同一性を確認するアッセイが提供される。この簡単な方法は、ヒト血球発生のメカニズムの将来の研究のために、この特殊なECのサブセットを生成するための有用な手段を提供します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 cm dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430599</td>
			<td>tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td>tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td>tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimicrobial reagent 
			Brand Name: Normocin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>ant-nr-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>233-FB-025</td>
			<td>use at 50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>595202</td>
			<td>use at 25 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Detatchment Solution 
			Brand Name: vAccutase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DLL4</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>1506-D4/CF</td>
			<td>recombinant human; use at 10 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM:F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial cell growth medium 
			Brand Name: EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit (EGM-2)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td>polystyrene round bottom with filter cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gemini Bio</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>33016015</td>
			<td>use at 4 mg/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSK3i/CHIR99021</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0004-02</td>
			<td>10 mM stock; use at 5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144S-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix protein&#160; 
			Brand Name: Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356230</td>
			<td>Growth factor reduced. Refer to the Certificate of Analysis for the lot to determine the protein (Matrigel) concentration. This concentration is required to calculate the volume of Matrigel that contains 1 mg of protein.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose-based medium 
			Brand Name: MethoCult H4435 Enriched</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>4435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluripotent stem cell differentiation medium 
			Brand Name: STEMdiff APEL 2</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluripotent stem cells: H1, H9, H9-FUCCI</td>
			<td>WiCell</td>
			<td>WA09 (H9), WA01 (H1)</td>
			<td>human; H9-FUCCI were obtained from Dr. Ludovic Vallier&#39;s lab at Cambridge Stem Cell Institute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein-Free Hybridoma Medium (PFMH)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12040077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R2625-50mg</td>
			<td>use at 0.5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse transcription master mix 
			Brand Name: iScript Reverse Transcription Supermix</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1708840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction kit 
			Brand Name: RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SS255-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stem cell growth medium 
			Brand Name: mTeSR1</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green master mix 
			Brand Name: iTaq Universal SYBR Green Master Mix</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1725121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25299956</td>
			<td>0.25%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF165 (VEGF-A)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-20</td>
			<td>use at 50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-CD31-FITC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>303104</td>
			<td>2 &#956;g/mL*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-CD34-Pacific Blue</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>343512</td>
			<td>2 &#956;g/mL*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-CD45-APC/Cy7</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304014</td>
			<td>2 &#956;g/mL*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-c-Kit-APC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>313206</td>
			<td>2 &#956;g/mL*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Flk-1-PE/Cy7</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>359911</td>
			<td>2 &#956;g/mL*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-VE-Cadherin-PE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>348506</td>
			<td>2 &#956;g/mL*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">* Antibody fluorescent conjugates should be optimized based on the cell sorter used. Presented here are the final concentrations utilized in this study.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

directed differentiation of hemogenic endothelial cells from human pluripotent stem cells

血管は体のすべての組織に遍在し、多様な機能を果たしています。したがって、血管内腔を覆う成熟血管内皮細胞のヒト多能性幹細胞からの誘導は、多数の組織工学および再生アプリケーションにとって非常に重要です。in vivoでは、始原内皮細胞は中胚葉系譜に由来し、動脈、静脈、毛細血管、血発生、リンパなどの特定のサブタイプに対して特定されます。血原性内皮細胞は、発生中に造血幹細胞と前駆細胞を生じさせ、それが生涯を通じてすべての血液系統を生成するため、特に興味深いものです。したがって、in vitroで血原性内皮細胞を生成するシステムを作成することは、内皮から造血への移行を研究する機会を提供し、ヒト血液製剤のex vivo産生とヒトドナーへの依存の減少につながる可能性があります。前駆細胞および始原内皮細胞の誘導にはいくつかのプロトコルが存在するが、ヒト幹細胞からの十分に特徴付けられた血原性内皮細胞の生成は記載されていない。ここでは、GSK3β阻害剤(CHIR99021)に応答して形成された原始的な筋細胞による分化プロトコル、bFGFによる中胚葉誘導、BMP4およびVEGF-Aによる始原内皮細胞の発生促進、そして最後にレチノイン酸による血原性内皮細胞仕様の約1週間でヒト胚性幹細胞から血原性内皮細胞を誘導する方法を紹介します。このプロトコルは、それらの分子調節と内皮から造血への移行をさらに理解するために使用できる血原性内皮細胞の明確に定義された集団を生み出し、下流の治療アプリケーションに適用できる可能性があります。

hESC由来の始原ECおよび血原性ECの仕様を概説した模式図と、めっき後24時間後の細胞の代表的な画像を図1に示します。仕様に従い、始原ECおよび血原性ECは、それぞれ5日目および8日目にFACS精製される。原始ECはCD31+ CD45-と定義され、血原性ECはCD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-カドヘリン-CD45-と定義される。始原ECおよ?...

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Directed Differentiation of Hemogenic Endothelial Cells from Human Pluripotent Stem Cells

ここに提示されるのは、約1週間でヒト多能性幹細胞から血原性内皮細胞を指向的に分化させるための簡単なプロトコルです。

ヒト多能性幹細胞からの血原性内皮細胞の指向性分化

Blood vessels are ubiquitously distributed within all tissues of the body and perform diverse functions. Thus, derivation of mature vascular endothelial ...

このプロトコルは、ヒト血原性内皮細胞の十分に特徴付けられた集団を生成する方法を詳述する。これらの細胞は、分子調節および内皮から造血への移行を研究するために利用することができる。まず、ヒト胚性幹細胞を4日間培養し、始原内皮細胞に分化させます。5日目に、細胞の上に培地を吸引します。次に、ウェルあたり1ミリリットルのDMEM / F-12で細胞を穏やかに洗浄します。ウェルあたり1ミリリットルの新たに調製した血原性内皮細胞分化培地を加え、摂氏37度および5%二酸化炭素で24時間細胞をインキュベートします。6日目および7日目に、細胞の上の培地をウェルあたり1ミリリットルの新たに調製した均質な内皮細胞分化培地と交換し、細胞をさらに24時間インキュベートします。8日目。細胞を剥離して洗浄した後、氷上の微量遠心チューブに均等に分割し、それぞれが1ミリリットルあたり10〜5番目の細胞の1倍の密度で最低600マイクロリットルの細胞を含みます。必要に応じて細胞を含むチューブに抗体を加え、光から保護された氷上で30分間インキュベートします。1000倍Gおよび摂氏4度で5分間遠心分離することにより、細胞をペレット化します。上清を除去し、ペレットを600マイクロリットルの氷冷選別バッファーに再懸濁します。5ミリリットルのFACSチューブのメッシュフィルターキャップを通してサンプルを濾し、光から保護された氷上に細胞を保存して、細胞を即座に選別します。FACSによって血原性内皮細胞を単離するには、まずCD45陰性細胞集団をゲートする。次にCD45陰性集団内で、CD31陽性細胞をゲートする。次にCD31陽性集団内で、VEカドヘリン陰性細胞集団のためのゲート。そして、VEカドヘリン陰性集団内で、c-Kit陽性細胞のゲート。c-Kit陽性集団から、CD34陽性細胞集団をゲートする。そして最後にCD34陽性細胞集団から、KDR陽性細胞を同定・採取する。造血前駆細胞の増殖のために処方されたメチルセルロースベースの培地に血原性内皮細胞を播種した後、コロニー形成ユニット-赤血球コロニー、およびいもち病形成ユニット-赤血球コロニーを8日目にカウントします。コロニー形成ユニット-顆粒球-マクロファージおよびコロニー形成ユニット-顆粒球、赤血球、マクロファージ、およびメガカリオサイト。多能性造血前駆細胞コロニーは14日目にカウントされます。播種された1000個の血原性内皮細胞当たり、約20個のコロニー形成単位が生成される。内皮細胞形態を有する細胞も培養物中に見える。これらは、単一細胞レベルで多系列造血前駆細胞を生じさせる血原性内皮細胞です。このプロトコルは、約1週間でヒト血原性内皮細胞を作製できる2D血清およびマウスフィーダーフリー培養システムです。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells

ヒト多能性幹細胞における転写因子の過剰発現によって、造血内皮と血液の直接誘導

During development, hematopoietic cells arise from a specialized subset of endothelial cells, hemogenic endothelium (HE). Modeling HE development in vitro ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

ヒト多能性幹細胞からメラノサイトのフィーダーフリーの導出

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

マウス胚性造血内皮細胞の単離

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

再現性の高い小分子ベースの分化プロトコルを使用したヒト多能性幹細胞から心筋細胞の大規模生産

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

ひと多能性幹細胞からプリミティブかつ決定的な造血前駆細胞の分化を監督

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

ヒト多能性幹細胞のin vitro分化における絨毛細胞へ

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

人間の胚または誘導多能性幹細胞からの網膜色素上皮細胞の急速な監督の分化

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

効率的かつスケーラブルな臨床的に互換性のある角膜輪部上皮幹細胞ひと多能性幹細胞からの分化

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

ヒト多能性幹細胞の肝細胞への効率的な分化

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

体節誘導体誘導される人間からの体外世代多能性幹細胞します。

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...