Name: directed differentiation of hemogenic endothelial cells from human pluripotent stem cells
Uploaded: 2021-03-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Directed Differentiation of Hemogenic Endothelial Cells from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

이 작업은 NIH 보조금 HL128064 및 U2EB017103에 의해 부분적으로 지원되었습니다. 추가 지원은 CT Innovations 15-RMB-YALE-04 보조금으로 제공되었습니다.

1. 시약 및 시약 준비
참고: 시약 목록은 재료 표에 나와 있습니다.
<ol><li>인간 만능 줄기 세포주를 얻습니다: H1-hESC, H9-푸치-hESC. 참고: hemogenic EC의 생성은 H1 세포주에서 더 효율적일 수 있습니다.</li>
	<li>매트릭스 단백질 스톡을 준비합니다: 매트릭스 단백질을 사전 냉각된 1.5mL 튜브(얼음 위)에 분취하여 각 튜브에 1mg의 매트릭스 단백질이 포함되도록 합니다. 1...

<ol>
	<li>Giacomelli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cardiac+microtissues+composed+of+cardiomyocytes+and+endothelial+cells+co-differentiated+from+human+pluripotent+stem+cells.">Three-dimensional cardiac microtissues composed of cardiomyocytes and endothelial cells co-differentiated from human pluripotent stem cells.</a> Development. 144 (6), 1008-1017 (2017).</li><li>Wu, J., Wu, Z., Xue, Z., Li, H., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PHBV/bioglass+composite+scaffolds+with+co-cultures+of+endothelial+cells+and+bone+marrow+stromal+cells+improve+vascularization+and+osteogenesis+for+bone+tissue+engineering.">PHBV/bioglass composite scaffolds with co-cultures of endothelial cells and bone marrow stromal cells improve vascularization and osteogenesis for bone tissue engineering.</a> RSC Advances. 7 (36), 22197-22207 (2017).</li><li>Lee, H., Chung, M., Jeon, N. 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V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation,+expansion+and+functional+analysis+of+endothelial+cells+and+pericytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation, expansion and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 9 (6), 1514-1531 (2014).</li><li>Kusuma, S., Gerecht, S., Turksen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+endothelial+cells+and+pericytes+from+human+pluripotent+stem+cells.">Derivation of endothelial cells and pericytes from human pluripotent stem cells.</a> Human Embryonic Stem Cell Protocols. , 213-222 (2014).</li><li>Bao, X., Lian, X., Palecek, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+endothelial+progenitor+differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+via+wnt+activation+under+defined+conditions.">Directed endothelial progenitor differentiation from human pluripotent stem cells via wnt activation under defined conditions.</a> Methods in Molecular Biology. 1481, 183-196 (2016).</li><li>Xu, M., He, J., Zhang, C., Xu, J., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+derivation+of+endothelial+lineages+from+human+stem+cells.">Strategies for derivation of endothelial lineages from human stem cells.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 10 (1), 200 (2019).</li><li>Arora, S., Yim, E. K. F., Toh, Y. -. 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본원에는 뮤린 피더 및 무혈청 2D 배양 시스템(그림 1)을 사용하여 약 1주일 내에 인간 배아 줄기 세포로부터 혈구 내피 세포를 생산하는 단계가 요약되어 있습니다. 이 프로토콜은 원시 ECs38을 얻기 위해 Sriram et al. (2015) 에 의해 설명 된 방법을 확장합니다. CD31+ CD45-EC의 원시적 특성 및 사양 잠재력은 DLL4 코팅 플레이트에서 이러한 세포를 배?...

내피 세포(EC)는 인체 전체와 조작된 조직에서 여러 기능을 수행하는 이질적인 세포 집단입니다. 다른 세포 유형(즉, 심근세포1, 조골세포2)을 지지하고 조절하는 것 외에도, 이러한 기능에는 혈액과 조직 사이에 선택적 장벽을 형성하고 조직 형성을 돕는것3이 포함됩니다. 정상적인 발달 과정에서 성숙한 EC를 차별화하려면 다양한 신호 경로가 필요합니다. 원시 EC는 중배엽 전구 세포에서 파생 된 다음 성숙한 동맥, 정맥, 모세 혈관 및 림프 표현형으로 지정됩니다4. 또한, 배아 외 난황낭 및 배아 대동맥-생식선-메소네프로스(AGM) 영역에 있는 EC의 작은 하위 집합도 조혈성 EC가 되도록 지정되며, 이는 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC)를 생성하여 태아 간 및 태아 골수로 이동하여 출생 후에도남아 평생 동안 모든 유형의 혈액 세포를 생성합니다4. 다양한 범위의 EC 표현형은 모든 조직 발달 및 유지에 필수적입니다.
따라서 EC와 그 파생물은 인간 발달 및/또는 질병의 모델링 및 해명 메커니즘뿐만 아니라 재생 의학 및 조직공학 응용 5,6,7,8을 목표로 하는 연구의 중요한 구성 요소입니다. 그러나 이러한 유형의 연구에 대한 주요 한계는 필요한 양에서 1 차 인간 EC의 가용성이 부족하다는 것입니다. 대부분의 치료 응용 프로그램에 최소 3 x 108 EC가 필요한 것으로 추정됩니다6. 이 문제를 해결하기 위해 인간 배아 줄기 세포 (hESC) 및 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC)의 사용이 다양한 혈통 잠재력과 많은 수의 자손을 생성 할 수있는 능력으로 인해 제안되었습니다 6,9.
실제로, hESC 또는 hiPSC에서 유래 한 세포의 유용성은 질병 모델링 및 약물 스크리닝10,11,12에 초점을 맞춘 여러 연구에서 입증되었습니다. OOC(Organ-on-a-Chip) 기술은 세포와 조직을 3차원 스캐폴드로 통합하여 인체의 생리학을 보다 충실하게 요약하는 데 사용되었습니다. 또한, 다수의 개별 OOC(소위 바디- 또는 휴먼-온-어칩, BOC/HOC)의 연결은 미세유체공학을 통해 달성되어 관심 기관(13,14,15) 간의 혼선을 허용할 수 있다. 혈관구조와 같은지지 조직은 OOC 및 BOC / HOC의 중요한 구성 요소입니다. 혈관 구조를 통합하면 조직 전체에 영양분, 산소 및 파라 크린 인자를 운반 할 수 있으므로 필요한 조직 특이 적 미세 환경 3,12을 촉진 할 수 있습니다. 따라서 동맥, 정맥, 림프 및 hemogenic EC와 같은 성숙한 인간 EC를 유도하는 방법은 이러한 조직 공학 접근법을 발전시키는 데 중요합니다.
hESC 또는 hiPSC 5,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26에서 인간 원시 또는 전구 EC를 파생하는 단계를 자세히 설명하는 여러 프로토콜이 게시되었습니다. . 이러한 프로토콜의 대부분은 배아체(EB) 형성 또는 기질 세포의 쥐 영양층이 있는 ESC/iPSC의 공동 배양에 의존합니다. 이러한 전략은 낮은 EC 수율 및/또는 쥐 세포로 인한 인간 EC의 오염으로 인해 어렵고 시간이 많이 소요되는 경향이 있습니다. 기질 세포를 사용하지 않고 2D 배양에만 의존하는 프로토콜은 종종 긴 유도가 필요하거나, 유도를 위해 성장 인자 및/또는 억제제의 복잡한 조합을 사용하거나, 세포 분리 후 확장 기간이 연장되거나, 이러한 요인의 조합이 필요합니다. 생체 내에서 성숙한 EC 유형의 유도와 관련된 신호 경로 및 요인에 대한 지식을 발전시키면 간단하고 강력한 체외 차별화 프로토콜의 토대를 마련할 수 있습니다.
이전에는 개발 중에 쥐 동맥 및 호모닉 EC의 사양에서 각각 Notch 및 Retinoic Acid (RA) 신호 전달 경로의 주요 역할이 확인되었습니다. Notch 신호 전달 경로는 동맥 EC 표현형의 사양 및 유지에 여러 역할을 합니다. 쥐 망막 혈관화 모델을 사용한 연구는 유체 전단 응력이 Notch-Cx37-p27 신호 축을 유도하여 G1 세포 주기 정지를 촉진하는 경로를 식별하여 동맥 EC 사양27을 가능하게 했습니다. 세포주기 상태는 세포가 유전자 발현 및 표현형 변화를 유도 할 수있는 특정 신호를 수용하는 뚜렷한 기회 창을 제공함으로써 세포 운명 결정에 역할을하는 것으로 가정되었습니다28. 이 노치 매개 G1 정지는 에프린B2, Cx40, DLL4, 노치1 및 노치 4를 포함한 동맥 EC에서 풍부한 유전자의 발현을 가능하게 했습니다(29,30에서 검토됨). 또한 혈구 EC 사양은 RA 신호 전달31,32를 통해 생체 내에서 촉진되는 것으로 나타났습니다. 추가 연구에서는 RA 신호전달의 하류, c-Kit 및 Notch의 발현이 p27을 상향조절하여 뮤린 난황낭 및 AGM33에서 혈구 사양을 가능하게 한다는 것을 확인했습니다. 뮤린 헤모닉 EC는 내피 (즉, CD31, KDR) 및 조혈 (즉, c-Kit, CD34) 마커4 둘 다의 발현에 의해 최소한으로 확인될 수 있다. 마지막으로, 혈구 EC는 내피에서 조혈로의 전이 (EHT)를 거쳐 HSPC를 형성하며, 이는 모든 혈액 세포 유형 4,34,35를 생성 할 수 있습니다.
최근 연구에서는 이 동일한 신호 계층 구조가 인간 hemogenic EC 사양을 촉진할 수 있는지 여부를 테스트했습니다. 이를 위해 hESC에서 헤모닉 EC를 유도하기 위한 혈청 및 피더가 없는 2D 배양 프로토콜이 개발되었으며, 이러한 헤모닉 EC는 단일 세포 수준에서 CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadherin-CD45-로 특성화되었습니다. 이 연구는 또한 FUCCI 리포터 구조체(H9-FUCCI-hESC)36를 발현하는 H9-hESC를 사용하여 다양한 세포 주기 상태를 식별하는 형광 유비퀴틴화 세포 주기 지표(FUCCI) 리포터를 활용했습니다. 이들 세포를 사용한 연구에서, RA는 ECs에서 초기 G1 세포 주기 정지를 촉진하고, 초기 G1 상태는 시험관내37에서 헤모겐 스펙을 가능하게 한다는 것이 입증되었다. 본원에서, 이들 인간 조혈성 내피 세포의 분화를 위한 상세한 프로토콜 및 이들의 정체를 확인하는 분석법이 제공된다. 이 간단한 방법은 인간 혈액 세포 발달 메커니즘에 대한 향후 연구를 위해 EC의 특수 하위 집합을 생성하는 유용한 수단을 제공합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 cm dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430599</td>
			<td>tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430165</td>
			<td>tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td>tissue culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimicrobial reagent 
			Brand Name: Normocin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>ant-nr-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>233-FB-025</td>
			<td>use at 50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BMP4</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>595202</td>
			<td>use at 25 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1600-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Detatchment Solution 
			Brand Name: vAccutase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D2650-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DLL4</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>1506-D4/CF</td>
			<td>recombinant human; use at 10 &#956;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM:F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11320-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelial cell growth medium 
			Brand Name: EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit (EGM-2)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352235</td>
			<td>polystyrene round bottom with filter cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gemini Bio</td>
			<td>100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>33016015</td>
			<td>use at 4 mg/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSK3i/CHIR99021</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0004-02</td>
			<td>10 mM stock; use at 5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid (HCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A144S-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrix protein&#160; 
			Brand Name: Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356230</td>
			<td>Growth factor reduced. Refer to the Certificate of Analysis for the lot to determine the protein (Matrigel) concentration. This concentration is required to calculate the volume of Matrigel that contains 1 mg of protein.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose-based medium 
			Brand Name: MethoCult H4435 Enriched</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>4435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluripotent stem cell differentiation medium 
			Brand Name: STEMdiff APEL 2</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>5270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluripotent stem cells: H1, H9, H9-FUCCI</td>
			<td>WiCell</td>
			<td>WA09 (H9), WA01 (H1)</td>
			<td>human; H9-FUCCI were obtained from Dr. Ludovic Vallier&#39;s lab at Cambridge Stem Cell Institute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein-Free Hybridoma Medium (PFMH)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12040077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic Acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>R2625-50mg</td>
			<td>use at 0.5 &#956;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse transcription master mix 
			Brand Name: iScript Reverse Transcription Supermix</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1708840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA extraction kit 
			Brand Name: RNeasy Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SS255-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stem cell growth medium 
			Brand Name: mTeSR1</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Green master mix 
			Brand Name: iTaq Universal SYBR Green Master Mix</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1725121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25299956</td>
			<td>0.25%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF165 (VEGF-A)</td>
			<td>PeproTech</td>
			<td>100-20</td>
			<td>use at 50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-CD31-FITC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>303104</td>
			<td>2 &#956;g/mL*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-CD34-Pacific Blue</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>343512</td>
			<td>2 &#956;g/mL*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-CD45-APC/Cy7</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304014</td>
			<td>2 &#956;g/mL*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-c-Kit-APC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>313206</td>
			<td>2 &#956;g/mL*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Flk-1-PE/Cy7</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>359911</td>
			<td>2 &#956;g/mL*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-VE-Cadherin-PE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>348506</td>
			<td>2 &#956;g/mL*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">* Antibody fluorescent conjugates should be optimized based on the cell sorter used. Presented here are the final concentrations utilized in this study.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

directed differentiation of hemogenic endothelial cells from human pluripotent stem cells

혈관은 신체의 모든 조직에 편재하게 분포되어 있으며 다양한 기능을 수행합니다. 따라서 인간 만능 줄기 세포에서 혈관 내강을 감싸는 성숙한 혈관 내피 세포를 유도하는 것은 다양한 조직 공학 및 재생 응용 분야에 중요합니다. 생체 내에서 원시 내피 세포는 중배엽 계통에서 파생되며 동맥, 정맥, 모세 혈관, 혈구 및 림프를 포함한 특정 하위 유형에 대해 지정됩니다. 혈구 내피 세포는 발달 과정에서 조혈 줄기 및 전구 세포를 생성하여 평생 동안 모든 혈통을 생성하기 때문에 특히 중요합니다. 따라서, 시험관 내에서 혈구 내피 세포를 생성하는 시스템을 만드는 것은 내피에서 조혈로의 전이를 연구할 기회를 제공할 것이며, 인간 혈액 제제의 생체외 생산 및 인간 기증자에 대한 의존도 감소로 이어질 수 있다. 전구 및 원시 내피 세포의 유도를 위한 여러 프로토콜이 존재하지만, 인간 줄기 세포로부터 잘 특성화된 혈구 내피 세포의 생성은 설명되지 않았습니다. 여기에서는 약 1 주일 만에 인간 배아 줄기 세포로부터 조혈 내피 세포를 유도하는 방법을 제시합니다 : GSK3β 억제제 (CHIR99021)에 반응하여 형성된 원시 줄무늬 세포를 이용한 분화 프로토콜, bFGF에 의해 매개되는 중배엽 계통 유도, BMP4 및 VEGF-A에 의해 촉진 된 원시 내피 세포 발달, 마지막으로 레티노 산에 의해 유도 된 혈구 내피 세포 사양. 이 프로토콜은 분자 조절 및 내피에서 조혈로의 전이를 더 이해하는 데 사용할 수 있는 잘 정의된 혈구 내피 세포 집단을 생성하며, 이는 다운스트림 치료 응용 분야에 적용될 가능성이 있습니다.

hESC의 원시 EC 및 호모닉 EC의 사양을 요약한 개략도와 도금 후 24시간 후의 세포의 대표 이미지가 그림 1에 나와 있습니다. 사양에 따라 원시 EC와 호모닉 EC는 각각 5일과 8일에 정제된 FACS입니다. 원시 EC는 CD31+ CD45-로 정의되고 헤모제닉 EC는 CD31+ KDR+ c-키트+ CD34+ VE-카데린-CD45-로 정의됩니다. 원시 EC 및 hemogenic EC ...

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Directed Differentiation of Hemogenic Endothelial Cells from Human Pluripotent Stem Cells

여기에 제시된 것은 약 1 주일 내에 인간 다 능성 줄기 세포로부터 혈구 내피 세포의 유도 분화를위한 간단한 프로토콜이다.

인간 만능 줄기 세포로부터 혈구 내피 세포의 유도 분화

Blood vessels are ubiquitously distributed within all tissues of the body and perform diverse functions. Thus, derivation of mature vascular endothelial ...

이 프로토콜은 인간 혈구 내피 세포의 잘 특성화된 집단을 생성하는 방법을 상세히 설명한다. 이들 세포는 분자 조절 및 내피에서 조혈로의 전이를 연구하는데 활용될 수 있다. 인간 배아 줄기 세포를 4 일 동안 배양하여 원시 내피 세포로 분화시키는 것으로 시작하십시오.5 일째에 세포 위의 배지를 흡인하십시오. 그런 다음 웰당 DMEM/F-12 1밀리리터로 세포를 부드럽게 씻습니다. 웰당 새로 준비된 조혈 내피 세포 분화 배지 1밀리리터를 추가하고 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 24시간 동안 세포를 배양합니다.6일째 및 7일째에 세포 위의 배지를 웰당 새로 준비된 동성 내피 세포 분화 배지 1밀리리터로 교체하고 세포를 추가로 24시간 동안 배양합니다. 여덟 번째 날. 세포를 분리하고 세척 한 후 얼음 위의 미세 원심 분리 튜브로 골고루 나누고 각각 밀리리터 당 1 배 10에서 5 번째 세포의 밀도로 최소 600 마이크로 리터의 세포를 포함합니다.세포를 포함하는 튜브에 항체를 적절하게 추가하고 빛으로부터 보호 된 얼음에서 30 분 동안 배양하십시오. 세포를 1000배 G 및 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리하여 펠릿화한다. 상청액을 제거하고 600 마이크로리터의 얼음처럼 차가운 분류 완충액에 펠릿을 재현탁시킨다.5 밀리리터 FACS 튜브의 메쉬 필터 캡을 통해 샘플을 변형시키고 즉각적인 세포 분류를 위해 빛으로부터 보호 된 얼음에 세포를 보관하십시오. FACS로 혈구 내피 세포를 분리하려면 먼저 CD45 음성 세포 집단을 게이트하십시오. 그런 다음 CD45 음성 집단 내에서 CD31 양성 세포를 게이트합니다.다음으로 CD31 양성 집단 내에서 VE- 카드 헤린 음성 세포 집단에 대한 게이트. 그런 다음 VE- 카드 헤린 음성 집단 내에서 c- 키트 양성 세포에 대한 게이트. c-Kit 양성 집단에서 CD34 양성 세포 집단을 게이트합니다.마지막으로 CD34 양성 세포 집단에서 KDR 양성 세포를 식별하고 수집합니다. 조혈 전구 세포의 성장을 위해 제조된 메틸셀룰로오스 기반 배지에 혈구 내피 세포를 파종한 후, 콜로니 형성 단위-적혈구 콜로니 및 블라스트 형성 단위-적혈구 콜로니가 8일째에 계산됩니다. 집락 형성 단위-과립구-대 식세포 및 집락 형성 단위-과립구, 적혈구, 대 식세포 및 거대 세포.다능성 조혈 전구 콜로니는 14일째에 계산됩니다. 1000개의 혈성 내피 세포가 도금될 때마다 약 20개의 콜로니 형성 단위가 생성됩니다. 내피 세포 형태를 가진 세포도 배양에서 볼 수 있습니다.이들은 단일 세포 수준에서 다중 계통 조혈 전구 세포를 생성하는 혈구 내피 세포입니다. 이 프로토콜은 약 1주일 내에 인간 혈구 내피 세포를 생성할 수 있는 2D 혈청 및 쥐 피더가 없는 배양 시스템입니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells

인간 만능 줄기 세포에서 전사 인자의 과발현에 의해 직접 Hemogenic 내피 세포의 유도 및 혈액

During development, hematopoietic cells arise from a specialized subset of endothelial cells, hemogenic endothelium (HE). Modeling HE development in vitro ...

연구

발생학

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

인간 다 능성 줄기 세포에서 멜라닌 세포의 공급이없는 유도

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

쥐 배아 Hemogenic 내피 세포의 분리

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

고도의 재현 작은 분자 기반의 차별화 프로토콜을 사용하여 인간 다 능성 줄기 세포로부터 심근 세포의 대규모 생산

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

기본 및 확실 한 조 혈 창시자 인간 만능 줄기 세포에서의 감독

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells

인간 다 능성의 체외 분화에서 융모 세포로 줄기 세포

The placenta is the first organ to develop during embryogenesis and is required for the survival of the developing embryo. The placenta is comprised of ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

인간의 배아 또는 유도 만능 줄기 세포에서 망막 안료 상피 세포의 급속 한, 감독 차별화

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Efficient and Scalable Directed Differentiation of Clinically Compatible Corneal Limbal Epithelial Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells

임상 호환 막 Limbal 상피 줄기 세포 인간 만능 줄기 세포에서의 효율적이 고 확장 가능한 감독된 차별화

Corneal limbal epithelial stem cells (LESCs) are responsible for continuously renewing the corneal epithelium, and thus maintaining corneal homeostasis ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

인간 다능성 줄기 세포를 간 세포로 효율적으로 분화

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

인간 유도에서 Somite 파생 상품의 체 외 발생에서 만능 줄기 세포

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...