Name: precision cut lung slices as an efficient tool for ex vivo pulmonary vessel structure and contractility studies
Uploaded: 2021-05-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Precision Cut Lung Slices as an Efficient Tool for Ex vivo Pulmonary Vessel Structure and Contractility Studies at JoVE.com

ويود المؤلفان أن يشكرا الدكتورين يوان هاو وكايفنغ ليو على دعمهما التقني. تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة 1R01 HL150106-01A1 ، وزمالة باركر ب. فرانسيس ، وجائزة أبحاث رابطة ارتفاع ضغط الدم الرئوي للدكتور كي يوان.

وكانت جميع رعاية الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية لمستشفى بوسطن للأطفال ووافقت اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها على بروتوكولات. الفئران المستخدمة في هذه الدراسة هي الفئران البرية من النوع C57/B6 والفئران المتقاطعة Cdh5-CreERT2 x Ai14 tdTomato.
1. إعداد الحلول
<ol><li>إعداد حل ا?...

<ol>
	<li>Sparrow, D., Weiss, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+physiology.">Respiratory physiology.</a> Annual Review of Gerontology &amp; Geriatrics. 6, 197-214 (1986).</li><li>Gerckens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+3D+lung+tissue+cultures+(3D-LTCs)+for+disease+modeling.">Generation of human 3D lung tissue cultures (3D-LTCs) for disease modeling.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), e58437 (2019).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preserving+airway+smooth+muscle+contraction+in+precision-cut+lung+slices.">Preserving airway smooth muscle contraction in precision-cut lung slices.</a> Scientific Reports. 10 (1), 6480 (2020).</li><li>Rosales Gerpe, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+precision-cut+lung+slices+as+an+ex+vivo+tool+for+evaluating+viruses+and+viral+vectors+for+gene+and+oncolytic+therapy.">Use of precision-cut lung slices as an ex vivo tool for evaluating viruses and viral vectors for gene and oncolytic therapy.</a> Molecular Therapy: Methods &amp; Clinical Development. 10, 245-256 (2018).</li><li>Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+lung+physiology+in+health+and+disease+with+lung+slices.">Exploring lung physiology in health and disease with lung slices.</a> Pulmonary Pharmacology &amp; Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).</li><li>Liu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+lung+slices:+An+ex+vivo+model+for+the+evaluation+of+antiviral+and+anti-inflammatory+agents+against+influenza+viruses.">Mouse lung slices: An ex vivo model for the evaluation of antiviral and anti-inflammatory agents against influenza viruses.</a> Antiviral Research. 120, 101-111 (2015).</li><li>de Graaf, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+incubation+of+precision-cut+liver+and+intestinal+slices+for+application+in+drug+metabolism+and+toxicity+studies.">Preparation and incubation of precision-cut liver and intestinal slices for application in drug metabolism and toxicity studies.</a> Nature Protocols. 5 (9), 1540-1551 (2010).</li><li>Alsafadi, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+and+approaches+for+three-dimensional+precision-cut+lung+slices.+Disease+modeling+and+drug+discovery.">Applications and approaches for three-dimensional precision-cut lung slices. Disease modeling and drug discovery.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 62 (6), 681-691 (2020).</li><li>Morin, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+cut+lung+slices+as+an+efficient+tool+for+in+vitro+lung+physio-pharmacotoxicology+studies.">Precision cut lung slices as an efficient tool for in vitro lung physio-pharmacotoxicology studies.</a> Xenobiotica. 43 (1), 63-72 (2013).</li><li>Springer, J., Fischer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substance+P-induced+pulmonary+vascular+remodelling+in+precision+cut+lung+slices.">Substance P-induced pulmonary vascular remodelling in precision cut lung slices.</a> The European Respiratory Journal. 22 (4), 596-601 (2003).</li><li>Suleiman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Argon+reduces+the+pulmonary+vascular+tone+in+rats+and+humans+by+GABA-receptor+activation.">Argon reduces the pulmonary vascular tone in rats and humans by GABA-receptor activation.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1902 (2019).</li><li>Rieg, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+agents+affect+the+tone+of+pulmonary+arteries+and+veins+in+precision-cut+lung+slices.">Cardiovascular agents affect the tone of pulmonary arteries and veins in precision-cut lung slices.</a> PLoS One. 6 (12), 29698 (2011).</li><li>Perez, J. F., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+frequency+of+calcium+oscillations+induced+by+5-HT,+ACH,+and+KCl+determine+the+contraction+of+smooth+muscle+cells+of+intrapulmonary+bronchioles.">The frequency of calcium oscillations induced by 5-HT, ACH, and KCl determine the contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary bronchioles.</a> The Journal of General Physiology. 125 (6), 535-553 (2005).</li><li>Deng, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+of+5-hydroxytryptamine+receptor+signaling+in+coronary+arteries+after+organ+culture.">Upregulation of 5-hydroxytryptamine receptor signaling in coronary arteries after organ culture.</a> PLoS One. 9 (9), 107128 (2014).</li><li>Sandker, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adventitial+dissection:+A+simple+and+effective+way+to+reduce+radial+artery+spasm+in+coronary+bypass+surgery.">Adventitial dissection: A simple and effective way to reduce radial artery spasm in coronary bypass surgery.</a> Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 17 (5), 784-789 (2013).</li><li>Naik, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pressure-induced+smooth+muscle+cell+depolarization+in+pulmonary+arteries+from+control+and+chronically+hypoxic+rats+does+not+cause+myogenic+vasoconstriction.">Pressure-induced smooth muscle cell depolarization in pulmonary arteries from control and chronically hypoxic rats does not cause myogenic vasoconstriction.</a> Journal of Applied Physiology. 98 (3), 1119-1124 (2005).</li><li>Lopez-Lopez, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+induces+pulmonary+artery+endothelial+dysfunction+by+NADPH+oxidase+induction.">Diabetes induces pulmonary artery endothelial dysfunction by NADPH oxidase induction.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (5), 727-732 (2008).</li><li>Gonzalez-Tajuelo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+pulmonary+hypertension+associated+with+systemic+sclerosis+in+P-selectin+glycoprotein+Ligand+1-deficient+mice.">Spontaneous pulmonary hypertension associated with systemic sclerosis in P-selectin glycoprotein Ligand 1-deficient mice.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 72 (3), 477-487 (2020).</li><li>Bai, Y., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+Ca2++sensitivity+of+airway+smooth+muscle+cells+in+murine+lung+slices.">Modulation of the Ca2+ sensitivity of airway smooth muscle cells in murine lung slices.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (2), 208-221 (2006).</li><li>Nishiyama, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+function+and+endothelin-1:+tipping+the+balance+between+vasodilation+and+vasoconstriction.">Vascular function and endothelin-1: tipping the balance between vasodilation and vasoconstriction.</a> Journal of Applied Physiology. 122 (2), 354-360 (2017).</li><li>Schneider, M. P., Inscho, E. W., Pollock, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuated+vasoconstrictor+responses+to+endothelin+in+afferent+arterioles+during+a+high-salt+diet.">Attenuated vasoconstrictor responses to endothelin in afferent arterioles during a high-salt diet.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 292 (4), 1208-1214 (2007).</li><li>Inscho, E. W., Imig, J. D., Cook, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Afferent+and+efferent+arteriolar+vasoconstriction+to+angiotensin+II+and+norepinephrine+involves+release+of+Ca2++from+intracellular+stores.">Afferent and efferent arteriolar vasoconstriction to angiotensin II and norepinephrine involves release of Ca2+ from intracellular stores.</a> Hypertension. 29, 222-227 (1997).</li><li>Vecchione, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+from+angiotensin+II-mediated+vasculotoxic+and+hypertensive+response+in+mice+lacking+PI3Kgamma.">Protection from angiotensin II-mediated vasculotoxic and hypertensive response in mice lacking PI3Kgamma.</a> The Journal of Experimental Medicine. 201 (8), 1217-1228 (2005).</li></ol>

في هذه المخطوطة، يتم وصف طريقة محسنة لإنتاج صور عالية الدقة لأنسجة الرئة المورين التي تحافظ على بنية الأوعية الدموية وتحسين المرونة التجريبية، وذلك على وجه التحديد باستخدام تطبيق PCLS للحصول على ميكروسيلكات من أنسجة الرئة التي يمكن مشاهدتها في ثلاثة أبعاد مع الانقباض المحفوظة للمحرك الوع...

تقدم في إعداد وتصوير أنسجة الرئة التي تحافظ على المكونات الخلوية دون التضحية الهيكل التشريحي توفير فهم مفصل للأمراض الرئوية. القدرة على تحديد البروتينات والحمرنا الريبي، والمركبات البيولوجية الأخرى مع الحفاظ على الهيكل الفسيولوجي يقدم معلومات حيوية عن الترتيب المكاني للخلايا التي يمكن أن توسع فهم الفيزيولوجيا المرضية في العديد من الأمراض الرئوية. يمكن أن تؤدي هذه الصور التفصيلية إلى فهم أفضل لأمراض الأوعية الدموية الرئوية ، مثل ارتفاع ضغط الدم الشرياني الرئوي ، عند تطبيقها على النماذج الحيوانية ، مما قد يؤدي إلى تحسين الاستراتيجيات العلاجية.
على الرغم من التقدم في التكنولوجيا، والحصول على صور عالية الجودة من أنسجة الرئة مورين لا يزال يشكل تحديا. تحرك الدورة التنفسية ضغط داخلي سلبي يتم توليده أثناء الاستنشاق1. عند الحصول تقليديا الخزعات وإعداد عينات الرئة للتصوير، يتم فقدان الانحدار الضغط السلبي مما أدى إلى انهيار مجرى الهواء وvasculature، والتي لم تعد تمثل نفسها في حالتها الراهنة. لتحقيق صور واقعية تعكس الظروف الحالية ، يجب إعادة تضخم الشعب الهوائية الرئوية ، وثقب الأوعية الدموية ، وتغيير الرئة الديناميكية إلى لاعبا اساسيا ثابتا. يسمح تطبيق هذه التقنيات المتميزة بالحفاظ على السلامة الهيكلية ، والرئة الوعائية ، والمكونات الخلوية ، بما في ذلك الخلايا المناعية مثل الضامة ، مما يسمح بالنظر إلى أنسجة الرئة على أقرب ما يمكن إلى حالته الفسيولوجية.
الدقة قطع تشريح الرئة (PCLS) هو أداة مثالية لدراسة التشريح وعلم وظائف الأعضاء من الأوعية الدموية الرئوية2. PCLS يوفر التصوير التفصيلي للأنسجة الرئة في ثلاثة أبعاد مع الحفاظ على المكونات الهيكلية والخلوية. وقد استخدمت PCLS في النماذج الحيوانية والبشرية للسماح للصور الحية وعالية الدقة من الوظائف الخلوية في ثلاثة أبعاد, مما يجعلها أداة مثالية لدراسة الأهداف العلاجية المحتملة, قياس تقلص مجرى الهواء الصغيرة ودراسة الفيزيولوجيا المرضية لأمراض الرئة المزمنة مثل مرض الانسداد الرئوي المزمن, ILD, وسرطان الرئة3. وباستخدام تقنيات مماثلة، يمكن أن يحافظ تعرض عينات PCLS لمكونات الأوعية على هيكل الرئة وانقباض الأوعية، وتكرارها في ظروف المختبر. جنبا إلى جنب مع الحفاظ على الانقباض، يمكن أن تخضع العينات المعدة لتحليل إضافي مثل تسلسل الحمض النووي الريبي، وصمة عار غربية، وقياس التدفق الخلوي عند إعدادها بشكل صحيح. وأخيرا، يمكن للخلايا المسماة بلون المراسل والتي تحمل علامة تضان tdTomato بعد حصاد الرئة الحفاظ على وضع العلامات بعد إعداد الميكروسليكس، مما يجعلها مثالية لدراسات تتبع الخلايا. يوفر دمج هذه التقنيات نموذجا متطورا يحافظ على الترتيب المكاني للخلايا وانقباض الأوعية التي يمكن أن تؤدي إلى فهم أكثر تفصيلا لسلاسل الإشارات والخيارات العلاجية المحتملة في مرض الأوعية الدموية الرئوية.
في هذه المخطوطة، تتعرض أنسجة الرئة المورين PCLS إلى الأوعية الدموية، مما يدل على السلامة الهيكلية المحفوظة وانقباض الأوعية. وتبين الدراسة أن الأنسجة التي تم إعدادها والتعامل معها بشكل مناسب يمكن أن تظل قابلة للحياة لمدة 10 أيام. كما توضح الدراسة الحفاظ على الخلايا ذات الفلورة الذاتية (tdTomato)، مما يسمح للعينات بتوفير صور عالية الدقة للرئة والعمارة. وأخيرا، تم وصف طرق للتعامل مع شرائح الأنسجة وإعدادها لقياس الحمض النووي الريبي واللطخة الغربية للتحقيق في الآليات الأساسية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5cc of fractionated heparin in syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>100 USP units per mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 1/2 inch gauge blunt end needle for trachea cannulation</td>
			<td>Cml Supply</td>
			<td>90120050D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30cc syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Anti solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated vibrating blade microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Viability Reagent (alamarBlue)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>DAL1025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium and GLutaMAX, supplemented with 10% FBS, 1% Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelin-1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mortar and Pestle</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA lysis and extraction buffer</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>89900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical suture 6/0</td>
			<td>FST</td>
			<td>18020-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Invitrogen, Thermofisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Low Melting Point Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>VT1200 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Winged blood collection set (Butterfly needle) 25-30G</td>
			<td>BD</td>
			<td>25-30G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

precision cut lung slices as an efficient tool for ex vivo pulmonary vessel structure and contractility studies

التصور من أنسجة الرئة مورين يوفر معلومات هيكلية وخليوية قيمة بشأن مجرى الهواء الكامنة وvasculature. ومع ذلك ، فإن الحفاظ على الأوعية الرئوية التي تمثل حقا الظروف الفسيولوجية لا يزال يمثل تحديات. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التكوين الدقيق لرئتي مورين يؤدي إلى تحديات تقنية في إعداد عينات للصور عالية الجودة التي تحافظ على التركيب الخلوي والهندسة المعمارية. وبالمثل ، يمكن إجراء فحوصات الانقباض الخلوي لدراسة إمكانات الخلايا للاستجابة لمغيري الأوعية في المختبر، ولكن هذه المقايسات لا تستنسخ البيئة المعقدة للرئة السليمة. وعلى النقيض من هذه القضايا التقنية، يمكن تطبيق طريقة قطع شريحة الرئة بدقة (PCLS) كبديل فعال لتصور أنسجة الرئة في ثلاثة أبعاد دون تحيز إقليمي وتكون بمثابة نموذج انقباض بديل حي لمدة تصل إلى 10 أيام. وقد حافظت الأنسجة المعدة باستخدام PCLS الهيكل والتوجه المكاني، مما يجعلها مثالية لدراسة عمليات المرض في الجسم الحي السابق. يمكن تصور موقع الخلايا الذاتية التي تحمل علامة tdTomato في PCLS التي يتم حصادها من نموذج مورين مراسل tdTomato غير القابل للاختزال بنجاح عن طريق المجهر الكونفوكوكال. بعد التعرض لمكونات الأوعية الدموية ، يوضح PCLS الحفاظ على كل من انقباض الأوعية وبنية الرئة ، والتي يمكن التقاطها بواسطة وحدة الفاصل الزمني. بالاقتران مع الإجراءات الأخرى، مثل لطخة الغربية وتحليل الحمض النووي الريبي، PCLS يمكن أن تسهم في فهم شامل للشلالات الإشارات التي تكمن وراء مجموعة واسعة من الاضطرابات ويؤدي إلى فهم أفضل للفيزيولوجيا المرضية في أمراض الأوعية الدموية الرئوية.

عند إضافتها إلى الخلايا أو الأنسجة ، يتم تعديل كاشف الجدوى عن طريق تقليل بيئة الأنسجة القابلة للحياة ويتحول إلى اللون الوردي / الأحمر ، ويصبح فلوريا للغاية. تظهر التغييرات اللونية التمثيلية التي تم اكتشافها من اليوم 0-1 واليوم 9-10 في الشكل 3. كما لوحظ، بدأ الحل الأزرق وتحول ال...

Watch this Scientific Journal Video about Precision Cut Lung Slices as an Efficient Tool for Ex vivo Pulmonary Vessel Structure and Contractility Studies at JoVE.com

Precision Cut Lung Slices as an Efficient Tool for Ex vivo Pulmonary Vessel Structure and Contractility Studies

يقدم هنا بروتوكول للحفاظ على انقباض الأوعية الدموية لأنسجة الرئة المورين PCLS ، مما يؤدي إلى صورة ثلاثية الأبعاد متطورة للمجرى الوعائي الرئوي والمجرى الهوائي ، والتي يمكن الحفاظ عليها لمدة تصل إلى 10 أيام عرضة للعديد من الإجراءات.

الدقة قص شرائح الرئة كأداة فعالة لهيكل الأوعية الرئوية في الجسم الحي السابق ودراسات الانقباض

The visualization of murine lung tissue provides valuable structural and cellular information regarding the underlying airway and vasculature. However, ...

وستحافظ طريقة قطع شرائح الرئة الدقيقة على الهيكل والتوجهات المكانية في ثلاثة أبعاد دون تحيز إقليمي ويمكن أن تكون بمثابة نموذج بديل حي للسفن وقياسات انقباض مجرى الهواء. بالاقتران مع التصوير الفاصل الزمني ، واللطخة الغربية ، وتحليل الحمض النووي الريبي ، تساهم شرائح الرئة المقطوعة بدقة في الفهم الشامل لسلاسل الإشارات التي تكمن وراء مجموعة واسعة من الاضطرابات وتؤدي إلى فهم أفضل للفيزيولوجيا المرضية في أمراض الأوعية الدموية الرئوية. للبدء، ضع الماوس البالغ القتل الرحيم في وضع ية وآمنة في مكانها عن طريق تسجيل الكفوف والأنف إلى الطاولة مع شريط لاصق.رش سطح البطن من الماوس مع 70٪ الإيثانول. استخدم ملقط لرفع جلد البطن من الماوس في موقع المثانة ومقص الجراحية لقطع في خط الوسط، والانتقال بشكل متفوق إلى منطقة عنق الرحم لفضح القصبة الهوائية. ثم استخدم الملاقط لرفع طبقة اللفافة الأساسية واستخدام مقص الجراحية لفضح الأعضاء الحشوية ومقصورة الوسطين، وقطع مرة أخرى أقل شأنا إلى متفوقة.قطع القص في منتصف الخط لفضح القلب والرئة. تشريح الحجاب الحاجز بعناية من الكبد ومقصورة البطن. تحديد موقع كافا الوريد السفلي تحت الأمعاء وقطع عليه.بعد تحديد موقع البطين الأيمن، استخدم إبرة فراشة قياس 25 إلى 30 لحقن 0.5 ملليلتر من الهيبارين 1٪ مجزأة في البطين الأيمن وتدفق ببطء ولكن بثبات مع 10 إلى 15 ملليمتر من برنامج تلفزيوني. بعد تحديد موقع الحنجرة، استخدم ملاقط طرف حادة لتشريح اللفافة المحيطة والأنسجة، ثم وضع خياطة الجراحية تحت القصبة الهوائية وربط فضفاضة عقدة الجراحية. وضع ثقب صغير في القصبة الهوائية متفوقة على السلسلة و cannulate مع إبرة قياس 20 حادة النهاية.شد الغرز حول الإبرة والقرصة باستخدام عقدة جراحية. ثم حقن 2.5 إلى 4 ملليلتر من الآغاروز في القصبة الهوائية ورصد التضخم في الرئة. بعد حقن agarose، صب برنامج تلفزيوني الباردة على الرئة لترسيخ agarose.ثم قطع القصبة الهوائية متفوقة على خياطة الجراحية وتشريح الرئة والقلب من mediastinum عن طريق إزالة أي التصاقات واللفافة. بعد التجسيد، ضع الأنسجة في DMEM في طبق بيتري على الجليد، والمضي قدما على الفور إلى تشريح فص واحد باستخدام آلة هزاز. لإعداد شرائح الرئة، قم بإرفاق العينة بالمنصة مع الغراء الفائق، مع الحفاظ على الجانب الوسيط الذي يواجه.ثم ملء حاوية عينة مع برنامج تلفزيوني. ملء الحاوية مع الجليد للحفاظ على برنامج تلفزيوني المحيطة وعينة الباردة. تشغيل الهزاز.ضبط سمك إلى 300 ميكرومتر، والتردد إلى 100 هيرتز، والسعة إلى 0.6 ملليمتر، والسرعة إلى خمسة ميكرومتر في الثانية الواحدة. باستخدام وجع ألين، قم بتحويل حامل النصل إلى الوضع الآمن وافتح الفكين لإدخال شفرة. ثم تشديد الفكين مع وجع ألن.ضع العينة على الصندوق، وتأكد من غمرها في برنامج تلفزيوني. حرك المربع لأعلى في الموضع الصحيح وتأكد من أنه آمن. تحويل حامل النصل إلى الموضع المناسب للتقطيع.جلب شفرة الهزاز تصل إلى حافة الكتلة وخفض يدويا شفرة حتى يكون حتى مع الجزء العلوي من العينة. تأكد من الإعدادات وتشغيل الهزاز. بعد قطع الشرائح الطازجة، قم بإزالة العينات من برنامج تلفزيوني ووضعها في طبق بيتري معقم مع 10 ملليلترات من DMEM تحتوي على مضاد حيوي مضاد للميكوزيلمرة واحدة.بعد وضع جميع الشرائح في طبق بيتري، تراجع عن النصل تماما واستخدم مفتاح ألين لرفع النصل إلى وضع آمن. تخزين العينات في DMEM في 37 درجة مئوية. ووضع شريحة هزاز على شريحة المجهر.استخدم مسح التنظيف لإزالة الوسط الزائد. ضع العينة على المجهري التباين المرحلة واستخدام 10 إلى 20X التكبير لتحديد السفينة. ثم أضف 500 ميكرولتر من أجهزة الأوعية الدموية، مثل كلوريد البوتاسيوم 60 ملليمولار أو واحد الاندوثين-1 ميكرومولار لغمر الشريحة تماما.مراقبة والتقاط الفيديو عن طريق تسجيل لمدة 30 إلى 60 ثانية. قبل بدء التجربة، قم بملء صندوق رغوة البوليسترين الصغير بلتر واحد من النيتروجين السائل ووضع أنبوبين للطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 ملليلتر في الحاوية بالنيتروجين السائل. ضع أربع إلى خمس شرائح هزاز طازجة في وعاء هاون.صب 5 إلى 10 ملليلتر من النيتروجين السائل على رأس شرائح واستخدام الحشرات بسرعة لطحن شرائح إلى مسحوق قبل أن يتبخر النيتروجين السائل. استخدام مغرفة مختبر الصلب المبردة مسبقا لغرف مسحوق في اثنين من أنابيب الطرد الدقيق المبردة وتحلل مسحوق بإضافة 500 ميكرولتر من كاشف استخراج الحمض النووي الريبي لعزل الحمض النووي الريبي أو 500 ميكرولتر من العازلة RIPA لتحلل البروتين. في تجربة الجدوى التمثيلية ، تم الكشف عن تغيير لون شرائح PCLS من اليوم صفر إلى يوم واحد واليوم التاسع إلى العاشر.كان الحل أزرق في البداية وتحول إلى اللون الوردي بين عشية وضحاها ، مما يدل على الجدوى. يحدث تغيير اللون عادة في غضون ساعة إلى أربع ساعات، ولكن قد يكون من الضروري وقتا أطول. يظهر الفرق اليومي بين الامتصاص عند أطوال موجية 562 و613 نانومتر للأنسجة المحضرة بالهزاز هنا.يمكن تصور انقباض الأوعية الدموية في أنسجة الرئة المعدة للهزاز باستخدام الإندوتيلين-1 وكلوريد البوتاسيوم هنا. الحفاظ على وضع العلامات tdTomato في الخلايا بعد أسبوع واحد من حقن تاموكسيفين هو واضح في هذه الشرائح الرئة. من المهم للغاية إجراء تطهير الرئة والتضخم خطوة جيدة لإزالة جميع الدم من الدورة الدموية قبل إجراء تجارب إضافية والتصوير.بالإضافة إلى أمراض الأوعية الدموية ، يمكن تطبيق PCLS لدراسة علم الأحياء الطبيعية للأمراض المرتبطة بالجوي ، ويمكن إجراء المزيد من الاختبار على أنسجة الرئة البشرية في السيناريوهات ذات الصلة سريريا.

Research

JoVE Journal

Medicine

Precision Cut Lung Slices as an Efficient Tool for Ex vivo Pulmonary Vessel Structure and Contractility Studies

Videomorphometric Analysis of Hypoxic Pulmonary Vasoconstriction of Intra-pulmonary Arteries Using Murine Precision Cut Lung Slices

تحليل مجسم الفيديو لنقص الأكسجين الرئوي من الشرايين داخل الرئة باستخدام مورين الدقة قطع شرائح الرئة

Acute alveolar hypoxia causes pulmonary vasoconstriction (HPV) - also known as von Euler-Liljestrand mechanism - which serves to match lung perfusion to ...

Fundus Photography as a Convenient Tool to Study Microvascular Responses to Cardiovascular Disease Risk Factors in Epidemiological Studies

تصوير قاع العين كأداة ملائمة لدراسة الردود الأوعية الدموية الدقيقة في عوامل الخطر مرض القلب والأوعية الدموية في الدراسات الوبائية

The microcirculation consists of blood vessels with diameters less than 150 &#181;m. It makes up a large part of the circulatory system and plays an ...

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

طريقة معزولة<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; الإرواء الرئة في الفئران نموذج: الدروس المستفادة من تطوير برنامج EVLP الجرذ

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed ...

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

فيفو تصوير لايف الرئة ورم خبيث والمكروية بهم

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular ...

The 4-vessel Sampling Approach to Integrative Studies of Human Placental Physiology In Vivo

The 4-vessel Sampling Approach to Integrative Studies of Human Placental Physiology In Vivo

نهج أخذ العينات 4-السفينة إلى الدراسات التكاملية من فسيولوجيا المشيمة الإنسان<em&gt; في فيفو</em

The human placenta is highly inaccessible for research while still in utero. The current understanding of human placental physiology in vivo is therefore ...

Combining Volumetric Capnography And Barometric Plethysmography To Measure The Lung Structure-function Relationship

الجمع بين كابنوجرافي الحجمي وضغطي بليثيسموجرافي لقياس علاقة بنية-وظيفة الرئة

Tools to measure lung and airways volume are critical for pulmonary researchers interested in evaluating the impact of disease or novel therapies on the ...

Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

السابقين فيفو الجهاز القرنية الثقافة النموذجية لالتئام الدراسات

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

Quantitative Mapping of Specific Ventilation in the Human Lung using Proton Magnetic Resonance Imaging and Oxygen as a Contrast Agent

الخرائط الكمية للتهوية الخاصة في الرئة البشرية باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي البروتون والأكسجين كعامل تباين

Specific ventilation imaging (SVI) is a functional magnetic resonance imaging technique capable of quantifying specific ventilation &#8213; the ratio of ...

Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts

دراسات الفيزيولوجيا الكهربية والدراسات الكهربائية السابقة لل فيفو لانغرندوف

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to ...

Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology

المورين الدقة قطع شرائح الكبد كنموذج السابق فيفو بيولوجيا الكبد

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic ...