Name: precision cut lung slices as an efficient tool for ex vivo pulmonary vessel structure and contractility studies
Uploaded: 2021-05-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Precision Cut Lung Slices as an Efficient Tool for Ex vivo Pulmonary Vessel Structure and Contractility Studies at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke Drs. Yuan Hao og Kaifeng Liu for deres tekniske support. Dette arbejde blev støttet af en NIH 1R01 HL150106-01A1, Parker B. Francis Fellowship, og Pulmonal Hypertension Association Aldrighetti Research Award til Dr. Ke Yuan.

Al dyrepleje var i overensstemmelse med retningslinjerne fra Boston Children's Hospital og Institutional Animal Care and Use Committee godkendte protokoller. De mus, der anvendes i denne undersøgelse, er vilde type C57/B6-mus og Cdh5-CreERT2 x Ai14 tdTomato krydsede mus.
1. Udarbejdelse af løsninger
<ol><li>Forbered fosfat buffer løsning (1x PBS) og 2% agarose løsning kræves under forsøget på forhånd.<ol>
<li>Bland 2 g agarosepulver i 100 mL autoklavet vand. Varm det i mikrobølgeovn...

<ol>
	<li>Sparrow, D., Weiss, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+physiology.">Respiratory physiology.</a> Annual Review of Gerontology &amp; Geriatrics. 6, 197-214 (1986).</li><li>Gerckens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+3D+lung+tissue+cultures+(3D-LTCs)+for+disease+modeling.">Generation of human 3D lung tissue cultures (3D-LTCs) for disease modeling.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), e58437 (2019).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preserving+airway+smooth+muscle+contraction+in+precision-cut+lung+slices.">Preserving airway smooth muscle contraction in precision-cut lung slices.</a> Scientific Reports. 10 (1), 6480 (2020).</li><li>Rosales Gerpe, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+precision-cut+lung+slices+as+an+ex+vivo+tool+for+evaluating+viruses+and+viral+vectors+for+gene+and+oncolytic+therapy.">Use of precision-cut lung slices as an ex vivo tool for evaluating viruses and viral vectors for gene and oncolytic therapy.</a> Molecular Therapy: Methods &amp; Clinical Development. 10, 245-256 (2018).</li><li>Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+lung+physiology+in+health+and+disease+with+lung+slices.">Exploring lung physiology in health and disease with lung slices.</a> Pulmonary Pharmacology &amp; Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).</li><li>Liu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+lung+slices:+An+ex+vivo+model+for+the+evaluation+of+antiviral+and+anti-inflammatory+agents+against+influenza+viruses.">Mouse lung slices: An ex vivo model for the evaluation of antiviral and anti-inflammatory agents against influenza viruses.</a> Antiviral Research. 120, 101-111 (2015).</li><li>de Graaf, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+incubation+of+precision-cut+liver+and+intestinal+slices+for+application+in+drug+metabolism+and+toxicity+studies.">Preparation and incubation of precision-cut liver and intestinal slices for application in drug metabolism and toxicity studies.</a> Nature Protocols. 5 (9), 1540-1551 (2010).</li><li>Alsafadi, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+and+approaches+for+three-dimensional+precision-cut+lung+slices.+Disease+modeling+and+drug+discovery.">Applications and approaches for three-dimensional precision-cut lung slices. Disease modeling and drug discovery.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 62 (6), 681-691 (2020).</li><li>Morin, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+cut+lung+slices+as+an+efficient+tool+for+in+vitro+lung+physio-pharmacotoxicology+studies.">Precision cut lung slices as an efficient tool for in vitro lung physio-pharmacotoxicology studies.</a> Xenobiotica. 43 (1), 63-72 (2013).</li><li>Springer, J., Fischer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substance+P-induced+pulmonary+vascular+remodelling+in+precision+cut+lung+slices.">Substance P-induced pulmonary vascular remodelling in precision cut lung slices.</a> The European Respiratory Journal. 22 (4), 596-601 (2003).</li><li>Suleiman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Argon+reduces+the+pulmonary+vascular+tone+in+rats+and+humans+by+GABA-receptor+activation.">Argon reduces the pulmonary vascular tone in rats and humans by GABA-receptor activation.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1902 (2019).</li><li>Rieg, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+agents+affect+the+tone+of+pulmonary+arteries+and+veins+in+precision-cut+lung+slices.">Cardiovascular agents affect the tone of pulmonary arteries and veins in precision-cut lung slices.</a> PLoS One. 6 (12), 29698 (2011).</li><li>Perez, J. F., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+frequency+of+calcium+oscillations+induced+by+5-HT,+ACH,+and+KCl+determine+the+contraction+of+smooth+muscle+cells+of+intrapulmonary+bronchioles.">The frequency of calcium oscillations induced by 5-HT, ACH, and KCl determine the contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary bronchioles.</a> The Journal of General Physiology. 125 (6), 535-553 (2005).</li><li>Deng, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+of+5-hydroxytryptamine+receptor+signaling+in+coronary+arteries+after+organ+culture.">Upregulation of 5-hydroxytryptamine receptor signaling in coronary arteries after organ culture.</a> PLoS One. 9 (9), 107128 (2014).</li><li>Sandker, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adventitial+dissection:+A+simple+and+effective+way+to+reduce+radial+artery+spasm+in+coronary+bypass+surgery.">Adventitial dissection: A simple and effective way to reduce radial artery spasm in coronary bypass surgery.</a> Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 17 (5), 784-789 (2013).</li><li>Naik, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pressure-induced+smooth+muscle+cell+depolarization+in+pulmonary+arteries+from+control+and+chronically+hypoxic+rats+does+not+cause+myogenic+vasoconstriction.">Pressure-induced smooth muscle cell depolarization in pulmonary arteries from control and chronically hypoxic rats does not cause myogenic vasoconstriction.</a> Journal of Applied Physiology. 98 (3), 1119-1124 (2005).</li><li>Lopez-Lopez, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+induces+pulmonary+artery+endothelial+dysfunction+by+NADPH+oxidase+induction.">Diabetes induces pulmonary artery endothelial dysfunction by NADPH oxidase induction.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (5), 727-732 (2008).</li><li>Gonzalez-Tajuelo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+pulmonary+hypertension+associated+with+systemic+sclerosis+in+P-selectin+glycoprotein+Ligand+1-deficient+mice.">Spontaneous pulmonary hypertension associated with systemic sclerosis in P-selectin glycoprotein Ligand 1-deficient mice.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 72 (3), 477-487 (2020).</li><li>Bai, Y., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+Ca2++sensitivity+of+airway+smooth+muscle+cells+in+murine+lung+slices.">Modulation of the Ca2+ sensitivity of airway smooth muscle cells in murine lung slices.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (2), 208-221 (2006).</li><li>Nishiyama, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+function+and+endothelin-1:+tipping+the+balance+between+vasodilation+and+vasoconstriction.">Vascular function and endothelin-1: tipping the balance between vasodilation and vasoconstriction.</a> Journal of Applied Physiology. 122 (2), 354-360 (2017).</li><li>Schneider, M. P., Inscho, E. W., Pollock, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuated+vasoconstrictor+responses+to+endothelin+in+afferent+arterioles+during+a+high-salt+diet.">Attenuated vasoconstrictor responses to endothelin in afferent arterioles during a high-salt diet.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 292 (4), 1208-1214 (2007).</li><li>Inscho, E. W., Imig, J. D., Cook, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Afferent+and+efferent+arteriolar+vasoconstriction+to+angiotensin+II+and+norepinephrine+involves+release+of+Ca2++from+intracellular+stores.">Afferent and efferent arteriolar vasoconstriction to angiotensin II and norepinephrine involves release of Ca2+ from intracellular stores.</a> Hypertension. 29, 222-227 (1997).</li><li>Vecchione, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+from+angiotensin+II-mediated+vasculotoxic+and+hypertensive+response+in+mice+lacking+PI3Kgamma.">Protection from angiotensin II-mediated vasculotoxic and hypertensive response in mice lacking PI3Kgamma.</a> The Journal of Experimental Medicine. 201 (8), 1217-1228 (2005).</li></ol>

I dette manuskript beskrives en forbedret metode til at producere billeder i høj opløsning af murin lungevæv, der bevarer den vaskulære struktur og optimerer eksperimentel fleksibilitet, specifikt ved hjælp af anvendelsen af PCLS for at opnå mikroslices af lungevæv, der kan ses i tre dimensioner med bevaret kontraktilitet af vaskulaturen. Ved hjælp af levedygtighedsreagenset viser protokollen, at omhyggeligt forberedte og konserverede skiver kan bevare levedygtigheden i mere end en uge. Mikroslices bevarede leved...

Fremskridt i forberedelsen og billeddannelsen af lungevæv, der bevarer cellulære komponenter uden at ofre anatomisk struktur, giver en detaljeret forståelse af lungesygdomme. Evnen til at identificere proteiner, RNA og andre biologiske forbindelser og samtidig opretholde fysiologisk struktur giver vigtige oplysninger om det rumlige arrangement af celler, der kan udvide forståelsen af patofysiologien i mange lungesygdomme. Disse detaljerede billeder kan føre til en bedre forståelse af lungesygdomme, såsom lungepulsåren hypertension, når de anvendes på dyremodeller, potentielt fører til forbedrede terapeutiske strategier.
På trods af teknologiske fremskridt er det fortsat en udfordring at få billeder af murin lungevæv af høj kvalitet. Åndedrætscyklussen er drevet af et negativt intrathoracisk tryk, der genereres under indånding1. Når der traditionelt opnås biopsier og forbereder lungeprøver til billeddannelse, går negativtryksgradienten tabt, hvilket resulterer i sammenbruddet af luftvejene og vaskulaturen, som ikke længere repræsenterer sig selv i sin nuværende tilstand. For at opnå realistiske billeder, der afspejler de aktuelle forhold, skal lungeluftvejene genbøjes, og vaskulaturen gennemsyres, ændre den dynamiske lunge til en statisk armatur. Anvendelsen af disse forskellige teknikker gør det muligt at bevare strukturel integritet, lunge-vaskulatur, og cellulære komponenter, herunder immunceller såsom makrofager, så lungevæv, der skal ses så tæt på sin fysiologiske tilstand som muligt.
Præcision skåret lunge udskæring (PCLS) er et ideelt værktøj til at studere anatomi og fysiologi af lunge vasulatur2. PCLS giver detaljeret billeddannelse af lungevævet i tre dimensioner, samtidig med at strukturelle og cellulære komponenter bevares. PCLS er blevet brugt i dyre- og menneskelige modeller for at give mulighed for levende billeder i høj opløsning af cellulære funktioner i tre dimensioner, hvilket gør det til et ideelt værktøj til at studere potentielle terapeutiske mål, måle små luftvejssammentrækning og studere patofysiologien af kroniske lungesygdomme som KOL, ILS og lungekræft3. Ved hjælp af lignende teknikker kan eksponeringen af PCLS-prøver for vasoconstrictors bevare lungestruktur og fartøjskontraktilitet og replikere in vitro-forhold. Sammen med at bevare sammentrækning, forberedte prøver kan gennemgå yderligere analyse såsom RNA sekventering, Vestlige blot, og flow cytometri, når de fremstilles korrekt. Endelig kan reporter farvemærkede celler markeret med tdTomato fluorescens efter lungehøst bevare mærkning efter fremstilling af mikroslices, hvilket gør den ideel til cellesporingsundersøgelser. Integrationen af disse teknikker giver en sofistikeret model, der bevarer den rumlige placering af celler og fartøjskontraktilitet, der kan føre til en mere detaljeret forståelse af signalkaskader og potentielle terapeutiske muligheder i lunge vaskulatursygdom.
I dette manuskript udsættes PCLS murine lungevæv for vasoconstrictors, der demonstrerer bevaret strukturel integritet og fartøjskontraktilitet. Undersøgelsen viser, at vævet, der fremstilles og håndteres korrekt, kan forblive levedygtigt i 10 dage. Undersøgelsen viser også bevarelsen af celler med endogen fluorescens (tdTomato), så prøver kan give billeder i høj opløsning af lungekarkulaturen og arkitekturen. Endelig er der beskrevet måder at håndtere og forberede vævsskiver til RNA-måling og western blot for at undersøge underliggende mekanismer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5cc of fractionated heparin in syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>100 USP units per mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 1/2 inch gauge blunt end needle for trachea cannulation</td>
			<td>Cml Supply</td>
			<td>90120050D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30cc syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Anti solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated vibrating blade microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Viability Reagent (alamarBlue)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>DAL1025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium and GLutaMAX, supplemented with 10% FBS, 1% Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelin-1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mortar and Pestle</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA lysis and extraction buffer</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>89900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical suture 6/0</td>
			<td>FST</td>
			<td>18020-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Invitrogen, Thermofisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Low Melting Point Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>VT1200 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Winged blood collection set (Butterfly needle) 25-30G</td>
			<td>BD</td>
			<td>25-30G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

precision cut lung slices as an efficient tool for ex vivo pulmonary vessel structure and contractility studies

Visualiseringen af murin lungevæv giver værdifulde strukturelle og cellulære oplysninger om de underliggende luftveje og vaskulatur. Men bevarelsen af lungekar, der virkelig repræsenterer fysiologiske forhold, giver stadig udfordringer. Derudover resulterer den delikate konfiguration af murin lunger i tekniske udfordringer med at forberede prøver til billeder af høj kvalitet, der bevarer både cellulær sammensætning og arkitektur. Tilsvarende cellulære kontraktilitet assays kan udføres for at studere potentialet i celler til at reagere på vasoconstrictors in vitro, men disse analyser ikke gengive det komplekse miljø af den intakte lunge. I modsætning til disse tekniske problemer, præcision-cut lunge skive (PCLS) metode kan anvendes som et effektivt alternativ til at visualisere lungevæv i tre dimensioner uden regional bias og tjene som en levende surrogat kontraktilitet model i op til 10 dage. Væv fremstillet ved hjælp af PCLS har bevaret struktur og rumlig orientering, hvilket gør det ideelt at studere sygdomsprocesser ex vivo. Placeringen af endogene tdTomato-mærkede celler i PCLS høstet fra en inucible tdTomato reporter murine model kan med succes visualiseres ved konfokal mikroskopi. Efter eksponering for vasoconstrictors demonstrerer PCLS bevarelsen af både fartøjskontraktilitet og lungestruktur, som kan fanges af et time-lapse-modul. I kombination med de andre procedurer, såsom western blot og RNA-analyse, kan PCLS bidrage til den omfattende forståelse af signaleringskaskader, der ligger til grund for en bred vifte af lidelser og fører til en bedre forståelse af patofysiologien i lungesygdomme.

Når det tilsættes til celler eller væv, ændres levedygtighedsreagenset ved at reducere miljøet af levedygtigt væv og bliver lyserødt / rødt og bliver meget fluorescerende. De repræsentative farveændringer, der registreres fra dag 0-1 og dag 9-10, er vist i figur 3. Som nævnt startede opløsningen blå og blev lyserød natten over, hvilket viser levedygtighed. Farveændring sker typisk inden for 1-4 timer. det kan dog være nødvendigt med længere tid. Til analyse for levedygtighe...

Watch this Scientific Journal Video about Precision Cut Lung Slices as an Efficient Tool for Ex vivo Pulmonary Vessel Structure and Contractility Studies at JoVE.com

Precision Cut Lung Slices as an Efficient Tool for Ex vivo Pulmonary Vessel Structure and Contractility Studies

Præsenteret her er en protokol til bevarelse af vaskulær kontraktilitet AF PCLS murin lungevæv, hvilket resulterer i en sofistikeret tre-dimensionelle billede af lunge vasulatur og luftveje, som kan bevares i op til 10 dage, der er modtagelige for mange procedurer.

Precision Cut Lung Slices som et effektivt værktøj til Ex vivo Pulmonal Vessel Structure og Contractility Studies

The visualization of murine lung tissue provides valuable structural and cellular information regarding the underlying airway and vasculature. However, ...

Præcision skåret lunge skiver metode vil bevare strukturen og rumlige orienteringer i tre dimensioner uden regional bias og kan tjene som en levende surrogat model for fartøjer og luftveje kontraktilitet målinger. I kombination med time-lapse imaging, Western blot, og RNA analyse, præcision skåret lunge skiver bidrage til den omfattende forståelse af signalering kaskader, der ligger til grund for en bred vifte af lidelser og føre til en bedre forståelse af patofysiologi i lungesygdomme. Til at begynde med skal du placere den aflivede voksne mus i en liggende position og fastgøre den på plads ved at tape poterne og næsen til bordet med tape.Spray musens ventrale overflade med 70% ethanol. Brug kraften til at løfte musens mavehud på placeringen af blæren og kirurgisk saks til at skære i midterlinjen, bevæger sig overlegent til livmoderhalskræft regionen for at udsætte luftrøret. Brug derefter pincet til at løfte det underliggende fascialag og bruge kirurgisk saks til at eksponere viscerale organer og middelalderlige rum, igen skære ringere til overlegen.Skær brystbenet i midten af halven for at udsætte hjerte og lunge. Dissekere mellemgulvet forsigtigt fra leveren og maverummet. Find den ringere vena cava under tarmene og skær den.Efter at have lokaliseret højre ventrikel, skal du bruge en 25 til 30 gauge sommerfugl nål til at injicere 0,5 milliliter af 1% fraktioneret heparin i højre ventrikel og skylle det langsomt, men støt med 10 til 15 millimeter PBS. Efter at have lokaliseret strubehovedet, skal du bruge stumpe spids pincet til at dissekere den omgivende fascia og væv, derefter placere den kirurgiske sutur under luftrøret og løst binde en kirurgisk knude. Placer et lille hul i luftrøret overlegen i forhold til strengen og kanyre med en 20 gauge stump-ended nål.Stram suturen omkring nålen og luftrøret ved hjælp af en kirurgisk knude. Derefter injicere 2,5 til 4 milliliter af agarose i luftrøret og overvåge for inflation af lungen. Efter agarose injektion, hælde kold PBS over lungen for at størkne agarose.Skær derefter luftrøret bedre end den kirurgiske sutur og disseker lungen og hjertet fra mediastinum ved at fjerne eventuelle vedhæftninger og fascia. Efter størkning, placere vævet i DMEM i en Petri parabol på is, og straks gå videre til udskæring en lap ved hjælp af en vibratom maskine. For at forberede lungeskiverne fastgøres prøven til platformen med superlim og holder den mediale side i side.Fyld derefter prøvebeholderen med PBS. Fyld beholderen med is for at holde den omgivende PBS og prøve kold. Tænd for vibratomen.Juster tykkelsen til 300 mikrometer, frekvens til 100 Hertz, amplitud til 0,6 millimeter og hastighed til fem mikrometer i sekundet. Ved hjælp af en skruenøgle skal du dreje knivholderen i sikker position og åbne kæberne for at indsætte en klinge. Stram derefter kæberne med en skruenøgle.Placer prøven på kassen, så den er nedsænket i PBS. Skub boksen op i den rigtige position, og sørg for, at den er sikker. Drej knivholderen i den rette position til udskæring.Bring vibratombladet op til kanten af blokken, og sænk klingen manuelt, indtil den er helt oppe i toppen af prøven. Bekræft indstillingerne, og kør vibratomen. Når de friske skiver er skåret, skal du fjerne prøverne fra PBS og placere dem i en steril petriskål med 10 milliliter DMEM, der indeholder engangs antimykotisk antibiotikum.Når du har placeret alle skiverne i en petriskål, trækkes klingen helt tilbage og bruger skruenøglen til at hæve klingen i en sikker position. Opbevar prøverne i DMEM ved 37 grader Celsius. Og læg en vibratom skive på et mikroskop dias.Brug en renses tørre til at fjerne overskydende medium. Sæt prøven på fasekontrastmikroskopien, og brug 10-20X forstørrelse til at identificere et fartøj. Tilsæt derefter 500 mikroliter vasoconstrictors, såsom 60 millimolar kaliumchlorid eller en mikromolar endoothelin-1 for helt at nedsænke diaset.Overhold og tag videoen ved optagelse i 30 til 60 sekunder. Før du begynder forsøget, skal du fylde en lille polystyren skumkasse med en liter flydende nitrogen og placere to 1,5 milliliter mikrocentrifugerør i beholderen med flydende nitrogen. Placer fire til fem friske vibratom skiver i en mørtel skål.Hæld 5 til 10 milliliter flydende nitrogen oven på skiverne og brug hurtigt støderen til at male skiverne i pulver, før det flydende nitrogen fordamper. Brug en prækølet stållaboratorie scooper til at skovle pulveret ind i de to afkølede mikrocentrifugrør og lyse pulveret ved at tilføje 500 mikroliter RNA ekstraktion reagens til RNA isolering eller 500 mikroliter ripa buffer til protein lysis. I det repræsentative levedygtighedseksperiment blev farveændringen af PCLS-skiverne opdaget fra dag nul til en og dag ni til 10.Løsningen var oprindeligt blå og blev lyserød natten over, hvilket viste levedygtighed. Farveændring opstod typisk inden for en til fire timer, men det kan være nødvendigt med længere tid. Den daglige forskel mellem absorbans ved 562 og 613 nanometer bølgelængder for det vibratome-tilberedte væv er vist her.Indsnævring af vaskulaturen i et vibratom-tilberedt lungevæv ved hjælp af endotlin-1 og kaliumchlorid kan visualiseres her. Bevarelsen af tdTomato-mærkning i celler en uge efter tamoxifenin injektion er påvist i disse lungeskiver. Det er vigtigst at udføre lunge clearing og inflation skridt godt at fjerne alt blod fra cirkulation før yderligere eksperimenter og billeddannelse.Ud over vaskulære sygdomme kan PCLS anvendes til at studere physiobiology af luftvejsrelaterede sygdomme og kan yderligere testes på humant lungevæv i klinisk relevante scenarier.

Research

JoVE Journal

Medicine

Precision Cut Lung Slices as an Efficient Tool for Ex vivo Pulmonary Vessel Structure and Contractility Studies

Videomorphometric Analysis of Hypoxic Pulmonary Vasoconstriction of Intra-pulmonary Arteries Using Murine Precision Cut Lung Slices

Videomorfometrisk analyse af hypoxisk lungevakolonstring af intrapulmonære arterier ved hjælp af Murine Precision Cut Lung Slices

Acute alveolar hypoxia causes pulmonary vasoconstriction (HPV) - also known as von Euler-Liljestrand mechanism - which serves to match lung perfusion to ...

Fundus Photography as a Convenient Tool to Study Microvascular Responses to Cardiovascular Disease Risk Factors in Epidemiological Studies

Fundusfotografi som et praktisk værktøj til at studere Mikrovaskulære Responses hjertekarsygdomme Risikofaktorer epidemiologiske undersøgelser

The microcirculation consists of blood vessels with diameters less than 150 &#181;m. It makes up a large part of the circulatory system and plays an ...

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

Metode til isoleret<em&gt; Ex vivo</em&gt; Lung Perfusion i en rotte Model: Erfaringer fra at udvikle en rotte EVLP Program

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed ...

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

Ex vivo Levende Imaging af lungemetastase og deres mikromiljø

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular ...

The 4-vessel Sampling Approach to Integrative Studies of Human Placental Physiology In Vivo

The 4-vessel Sampling Approach to Integrative Studies of Human Placental Physiology In Vivo

4-fartøjets prøveudtagning til integrerende studier af human placental fysiologi<em&gt; In vivo</em

The human placenta is highly inaccessible for research while still in utero. The current understanding of human placental physiology in vivo is therefore ...

Combining Volumetric Capnography And Barometric Plethysmography To Measure The Lung Structure-function Relationship

Kombinere volumetriske Capnography og barometer Plethysmography for at måle lunge struktur-funktion relationer

Tools to measure lung and airways volume are critical for pulmonary researchers interested in evaluating the impact of disease or novel therapies on the ...

Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

Ex Vivo sårheling hornhinde orgel kultur Model for undersøgelser

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

Quantitative Mapping of Specific Ventilation in the Human Lung using Proton Magnetic Resonance Imaging and Oxygen as a Contrast Agent

Kvantitativ kortlægning af specifik ventilation i den menneskelige lunge ved hjælp af Proton magnetisk resonans imaging og ilt som kontrastmiddel

Specific ventilation imaging (SVI) is a functional magnetic resonance imaging technique capable of quantifying specific ventilation &#8213; the ratio of ...

Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts

Optokardiografi og Elektrofysiologi studier af ex vivo Langendorff-perfbrugte hjerter

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to ...

Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology

Murine Precision-Cut Lever skiver som en Ex Vivo Model af leverbiologi

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic ...