Name: precision cut lung slices as an efficient tool for ex vivo pulmonary vessel structure and contractility studies
Uploaded: 2021-05-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Precision Cut Lung Slices as an Efficient Tool for Ex vivo Pulmonary Vessel Structure and Contractility Studies at JoVE.com

המחברים רוצים להודות לד"ר יואן האו וקייפנג ליו על התמיכה הטכנית שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי NIH 1R01 HL150106-01A1, מלגת פארקר ב פרנסיס, ואת פרס מחקר אלדריגטי האגודה ליתר לחץ דם ריאתי לד"ר Ke יואן.

כל הטיפול בבעלי חיים היה בהתאם להנחיות של בית החולים לילדים בבוסטון וועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים המוסדית אישרה פרוטוקולים. העכברים המשמשים במחקר זה הם עכברי C57/B6 מסוג בר ו- Cdh5-CreERT2 x Ai14 tdTomato חצה עכברים.
1. הכנת פתרונות
<ol><li>הכן פתרון חיץ פוספט (1x PBS) ופתרון אגרוז 2% הנדרש במהלך...

<ol>
	<li>Sparrow, D., Weiss, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+physiology.">Respiratory physiology.</a> Annual Review of Gerontology &amp; Geriatrics. 6, 197-214 (1986).</li><li>Gerckens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+3D+lung+tissue+cultures+(3D-LTCs)+for+disease+modeling.">Generation of human 3D lung tissue cultures (3D-LTCs) for disease modeling.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), e58437 (2019).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preserving+airway+smooth+muscle+contraction+in+precision-cut+lung+slices.">Preserving airway smooth muscle contraction in precision-cut lung slices.</a> Scientific Reports. 10 (1), 6480 (2020).</li><li>Rosales Gerpe, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+precision-cut+lung+slices+as+an+ex+vivo+tool+for+evaluating+viruses+and+viral+vectors+for+gene+and+oncolytic+therapy.">Use of precision-cut lung slices as an ex vivo tool for evaluating viruses and viral vectors for gene and oncolytic therapy.</a> Molecular Therapy: Methods &amp; Clinical Development. 10, 245-256 (2018).</li><li>Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+lung+physiology+in+health+and+disease+with+lung+slices.">Exploring lung physiology in health and disease with lung slices.</a> Pulmonary Pharmacology &amp; Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).</li><li>Liu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+lung+slices:+An+ex+vivo+model+for+the+evaluation+of+antiviral+and+anti-inflammatory+agents+against+influenza+viruses.">Mouse lung slices: An ex vivo model for the evaluation of antiviral and anti-inflammatory agents against influenza viruses.</a> Antiviral Research. 120, 101-111 (2015).</li><li>de Graaf, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+incubation+of+precision-cut+liver+and+intestinal+slices+for+application+in+drug+metabolism+and+toxicity+studies.">Preparation and incubation of precision-cut liver and intestinal slices for application in drug metabolism and toxicity studies.</a> Nature Protocols. 5 (9), 1540-1551 (2010).</li><li>Alsafadi, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+and+approaches+for+three-dimensional+precision-cut+lung+slices.+Disease+modeling+and+drug+discovery.">Applications and approaches for three-dimensional precision-cut lung slices. Disease modeling and drug discovery.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 62 (6), 681-691 (2020).</li><li>Morin, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+cut+lung+slices+as+an+efficient+tool+for+in+vitro+lung+physio-pharmacotoxicology+studies.">Precision cut lung slices as an efficient tool for in vitro lung physio-pharmacotoxicology studies.</a> Xenobiotica. 43 (1), 63-72 (2013).</li><li>Springer, J., Fischer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substance+P-induced+pulmonary+vascular+remodelling+in+precision+cut+lung+slices.">Substance P-induced pulmonary vascular remodelling in precision cut lung slices.</a> The European Respiratory Journal. 22 (4), 596-601 (2003).</li><li>Suleiman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Argon+reduces+the+pulmonary+vascular+tone+in+rats+and+humans+by+GABA-receptor+activation.">Argon reduces the pulmonary vascular tone in rats and humans by GABA-receptor activation.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1902 (2019).</li><li>Rieg, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+agents+affect+the+tone+of+pulmonary+arteries+and+veins+in+precision-cut+lung+slices.">Cardiovascular agents affect the tone of pulmonary arteries and veins in precision-cut lung slices.</a> PLoS One. 6 (12), 29698 (2011).</li><li>Perez, J. F., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+frequency+of+calcium+oscillations+induced+by+5-HT,+ACH,+and+KCl+determine+the+contraction+of+smooth+muscle+cells+of+intrapulmonary+bronchioles.">The frequency of calcium oscillations induced by 5-HT, ACH, and KCl determine the contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary bronchioles.</a> The Journal of General Physiology. 125 (6), 535-553 (2005).</li><li>Deng, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+of+5-hydroxytryptamine+receptor+signaling+in+coronary+arteries+after+organ+culture.">Upregulation of 5-hydroxytryptamine receptor signaling in coronary arteries after organ culture.</a> PLoS One. 9 (9), 107128 (2014).</li><li>Sandker, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adventitial+dissection:+A+simple+and+effective+way+to+reduce+radial+artery+spasm+in+coronary+bypass+surgery.">Adventitial dissection: A simple and effective way to reduce radial artery spasm in coronary bypass surgery.</a> Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 17 (5), 784-789 (2013).</li><li>Naik, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pressure-induced+smooth+muscle+cell+depolarization+in+pulmonary+arteries+from+control+and+chronically+hypoxic+rats+does+not+cause+myogenic+vasoconstriction.">Pressure-induced smooth muscle cell depolarization in pulmonary arteries from control and chronically hypoxic rats does not cause myogenic vasoconstriction.</a> Journal of Applied Physiology. 98 (3), 1119-1124 (2005).</li><li>Lopez-Lopez, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+induces+pulmonary+artery+endothelial+dysfunction+by+NADPH+oxidase+induction.">Diabetes induces pulmonary artery endothelial dysfunction by NADPH oxidase induction.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (5), 727-732 (2008).</li><li>Gonzalez-Tajuelo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+pulmonary+hypertension+associated+with+systemic+sclerosis+in+P-selectin+glycoprotein+Ligand+1-deficient+mice.">Spontaneous pulmonary hypertension associated with systemic sclerosis in P-selectin glycoprotein Ligand 1-deficient mice.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 72 (3), 477-487 (2020).</li><li>Bai, Y., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+Ca2++sensitivity+of+airway+smooth+muscle+cells+in+murine+lung+slices.">Modulation of the Ca2+ sensitivity of airway smooth muscle cells in murine lung slices.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (2), 208-221 (2006).</li><li>Nishiyama, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+function+and+endothelin-1:+tipping+the+balance+between+vasodilation+and+vasoconstriction.">Vascular function and endothelin-1: tipping the balance between vasodilation and vasoconstriction.</a> Journal of Applied Physiology. 122 (2), 354-360 (2017).</li><li>Schneider, M. P., Inscho, E. W., Pollock, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuated+vasoconstrictor+responses+to+endothelin+in+afferent+arterioles+during+a+high-salt+diet.">Attenuated vasoconstrictor responses to endothelin in afferent arterioles during a high-salt diet.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 292 (4), 1208-1214 (2007).</li><li>Inscho, E. W., Imig, J. D., Cook, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Afferent+and+efferent+arteriolar+vasoconstriction+to+angiotensin+II+and+norepinephrine+involves+release+of+Ca2++from+intracellular+stores.">Afferent and efferent arteriolar vasoconstriction to angiotensin II and norepinephrine involves release of Ca2+ from intracellular stores.</a> Hypertension. 29, 222-227 (1997).</li><li>Vecchione, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+from+angiotensin+II-mediated+vasculotoxic+and+hypertensive+response+in+mice+lacking+PI3Kgamma.">Protection from angiotensin II-mediated vasculotoxic and hypertensive response in mice lacking PI3Kgamma.</a> The Journal of Experimental Medicine. 201 (8), 1217-1228 (2005).</li></ol>

בכתב יד זה, שיטה משופרת לייצר תמונות ברזולוציה גבוהה של רקמת ריאה מורינה המשמרת את מבנה כלי הדם ומייעלת את הגמישות הניסיונית מתוארת, במיוחד באמצעות היישום של PCLS כדי להשיג microslices של רקמת ריאה שניתן לראות בשלושה ממדים עם התכווצות השתמרה של כלי הדם. באמצעות ריאגנט הכדאיות, הפרוטוקול מדגים כי ?...

ההתקדמות בהכנת והדמיה של רקמת ריאה המשמרת רכיבים תאיים מבלי להקריב מבנה אנטומי מספקת הבנה מפורטת של מחלות ריאות. היכולת לזהות חלבונים, RNA ותרכובות ביולוגיות אחרות תוך שמירה על מבנה פיזיולוגי מציעה מידע חיוני על הסידור המרחבי של תאים שיכולים להרחיב את ההבנה של הפתופיזיולוגיה במחלות ריאות רבות. תמונות מפורטות אלה יכולות להוביל להבנה טובה יותר של מחלות כלי דם ריאתיים, כגון יתר לחץ דם בעורק הריאות, כאשר הם מוחלים על מודלים של בעלי חיים, מה שעלול להוביל לאסטרטגיות טיפוליות משופרות.
למרות ההתקדמות הטכנולוגית, השגת תמונות באיכות גבוהה של רקמת ריאה מורינה נותרה אתגר. מחזור הנשימה מונע על ידי לחץ תוך-אתורי שלילי שנוצר במהלך שאיפה1. כאשר באופן מסורתי להשיג ביופסיות והכנת דגימות ריאות להדמיה, שיפוע הלחץ השלילי הולך לאיבוד וכתוצאה מכך קריסת דרכי הנשימה vasculature, אשר כבר לא מייצג את עצמו במצב הנוכחי שלה. כדי להשיג תמונות מציאותיות המשקפות את התנאים הנוכחיים, יש לנפח מחדש את דרכי הנשימה הריאתיות, ואת כלי השיט, שינוי הריאה הדינמית לתוך מתקן סטטי. היישום של טכניקות ייחודיות אלה מאפשר שימור של שלמות מבנית, כלי דם ריאתי, ורכיבים תאיים, כולל תאים חיסוניים כגון מקרופאגים, המאפשר רקמת ריאה להיות גלוי קרוב ככל האפשר למצבה הפיזיולוגי.
חיתוך ריאות מדויק (PCLS) הוא כלי אידיאלי לחקר האנטומיה והפיזיולוגיה של כלי הריאות2. PCLS מספק הדמיה מפורטת של רקמת הריאה בשלושה ממדים תוך שמירה על רכיבים מבניים ותאיים. PCLS שימש במודלים של בעלי חיים ובני אדם כדי לאפשר תמונות חיות ברזולוציה גבוהה של תפקודים תאיים בשלושה ממדים, מה שהופך אותו לכלי אידיאלי לחקר מטרות טיפוליות פוטנציאליות, למדוד התכווצות דרכי הנשימה הקטנות וללמוד את הפתופיזיקה של מחלות ריאות כרוניות כגון COPD, ILD וסרטןריאות 3. באמצעות טכניקות דומות, החשיפה של דגימות PCLS vasoconstrictors יכול לשמר את מבנה הריאות ואת התכווצות כלי הדם, שכפול בתנאי הפריה. יחד עם שמירה על התכווצות, דגימות מוכנות יכולות לעבור ניתוח נוסף כגון רצף RNA, כתם מערבי, וציטומטריית זרימה כאשר הם מוכנים כראוי. לבסוף, כתב צבע מסומן עם פלואורסצנטיות tdTomato לאחר קציר ריאות יכול לשמר תיוג לאחר הכנת microslices, מה שהופך אותו אידיאלי עבור מחקרי מעקב אחר תאים. השילוב של טכניקות אלה מספק מודל מתוחכם המשמר את הסידור המרחבי של תאים והתכווצות כלי שיכול להוביל להבנה מפורטת יותר של מפלי האיתות ואפשרויות טיפוליות פוטנציאליות במחלת כלי הדם הריאתי.
בכתב יד זה, רקמת הריאה המורינה של PCLS נחשפת ל vasoconstrictors, המדגימה שלמות מבנית שמורה והתכווצות כלי. המחקר מדגים כי הרקמה מוכנה ומטופלת כראוי יכול להישאר קיימא במשך 10 ימים. המחקר מדגים גם את שימור התאים עם פלואורסצנטיות אנדוגני (tdTomato), ומאפשר דגימות לספק תמונות ברזולוציה גבוהה של vasculature ריאתי וארכיטקטורה. לבסוף, תוארו דרכים לטפל ולהכין פרוסות רקמות למדידת RNA וכתם מערבי כדי לחקור מנגנונים הבסיסיים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5cc of fractionated heparin in syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>100 USP units per mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 1/2 inch gauge blunt end needle for trachea cannulation</td>
			<td>Cml Supply</td>
			<td>90120050D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30cc syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Anti solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated vibrating blade microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Viability Reagent (alamarBlue)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>DAL1025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium and GLutaMAX, supplemented with 10% FBS, 1% Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelin-1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mortar and Pestle</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA lysis and extraction buffer</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>89900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical suture 6/0</td>
			<td>FST</td>
			<td>18020-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Invitrogen, Thermofisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Low Melting Point Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>VT1200 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Winged blood collection set (Butterfly needle) 25-30G</td>
			<td>BD</td>
			<td>25-30G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

precision cut lung slices as an efficient tool for ex vivo pulmonary vessel structure and contractility studies

ההדמיה של רקמת ריאה מורינית מספקת מידע מבני ותאי בעל ערך לגבי דרכי הנשימה הבסיסיות ו vasculature. עם זאת, שימור כלי הריאות המייצגים באמת תנאים פיזיולוגיים עדיין מציב אתגרים. בנוסף, התצורה העדינה של ריאות מורינה גורמת לאתגרים טכניים בהכנת דגימות לתמונות באיכות גבוהה המשמרות הן את הרכב התאים והן את הארכיטקטורה. באופן דומה, בדיקות התכווצות הסלולר יכולות להתבצע כדי לחקור את הפוטנציאל של תאים להגיב vasoconstrictors במבחנה, אבל בדיקות אלה אינם לשחזר את הסביבה המורכבת של הריאה שלם. בניגוד לבעיות טכניות אלה, ניתן ליישם את שיטת פרוסת הריאה המדויקת (PCLS) כחלופה יעילה להדמיית רקמת ריאה בשלושה ממדים ללא הטיה אזורית ולשמש מודל קבלנות פונדקאית חיה עד 10 ימים. רקמות מוכנות באמצעות PCLS יש מבנה משומר אוריינטציה מרחבית, מה שהופך אותו אידיאלי ללמוד תהליכי מחלה ex vivo. המיקום של תאים אנדוגניים המסומנים ב- PCLS שנקטפו ממודל מורינה של כתב tdTomato שניתן לתמצית יכול להיות חזותי בהצלחה על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. לאחר חשיפה vasoconstrictors, PCLS מדגים את השימור של התכווצות כלי הדם ואת מבנה הריאות, אשר ניתן ללכוד על ידי מודול לשגות זמן. בשילוב עם ההליכים האחרים, כגון כתם מערבי וניתוח RNA, PCLS יכול לתרום להבנה מקיפה של מפלי איתות העומדים בבסיס מגוון רחב של הפרעות ולהוביל להבנה טובה יותר של הפתופיזיולוגיה במחלות כלי דם ריאתיים.

כאשר נוסף לתאים או רקמה, ריאגנט הכדאיות משתנה על ידי הסביבה המפחיתה של רקמה בת קיימא והופך ורוד / אדום, הופך פלואורסצנטי מאוד. שינויי הצבעים המייצגים שזוהו מהיום 0-1 ומהיום 9-10 מוצגים באיור 3. כאמור, הפתרון התחיל בכחול והפך ורוד בן לילה, והפגין כדאיות. שינוי צבע מתרחש בדרך כלל ב?...

Watch this Scientific Journal Video about Precision Cut Lung Slices as an Efficient Tool for Ex vivo Pulmonary Vessel Structure and Contractility Studies at JoVE.com

Precision Cut Lung Slices as an Efficient Tool for Ex vivo Pulmonary Vessel Structure and Contractility Studies

מוצג כאן פרוטוקול לשימור התכווצות כלי הדם של רקמת הריאה המורינית PCLS, וכתוצאה מכך תמונה תלת ממדית מתוחכמת של כלי הדם הריאתי ודרכי הנשימה, אשר ניתן לשמר עד 10 ימים כי הוא רגיש הליכים רבים.

פרוסות ריאות חתוכות מדויקות ככלי יעיל למבנה כלי הריאות Ex vivo ולמחקרי התכווצות

The visualization of murine lung tissue provides valuable structural and cellular information regarding the underlying airway and vasculature. However, ...

שיטת פרוסות ריאות חתוכות מדויקות תשמור על המבנה והכיוון המרחבי בשלושה ממדים ללא הטיה אזורית ויכולה לשמש מודל פונדקאי חי לכלי שיט ומדידות התכווצות דרכי הנשימה. בשילוב עם הדמיה בזמן, כתם מערבי וניתוח RNA, פרוסות ריאות חתוכות במדויק תורמות להבנה המקיפה של מפלי איתות העומדים בבסיס מגוון רחב של הפרעות ומובילות להבנה טובה יותר של הפתופיזיולוגיה במחלות כלי דם ריאתיות. כדי להתחיל, מניחים את העכבר הבוגר המתחסד בתנוחה על-סופית ומאבטחים אותו במקום על ידי הדבקת כפות הרגליים והאף לשולחן עם סרט הדבקה.לרסס את פני השטח הגחון של העכבר עם 70%אתנול. השתמש במלקחיים כדי להרים את עור הבטן של העכבר במיקום של שלפוחית השתן ומספריים כירורגיים לחתוך בקו האמצע, נע מעולה לאזור צוואר הרחם כדי לחשוף את קנה הנשימה. לאחר מכן השתמש פינצטה כדי להרים את שכבת fascia הבסיסית ולהשתמש במספריים כירורגיים כדי לחשוף את האיברים הקרביים ותא mediastinal, שוב חיתוך נחות מעולה.תחתוך את החזה בקו האמצע כדי לחשוף את הלב והריאה. לנתח את הסרעפת בזהירות מהכבד ותא הבטן. אתר את הוועד הנתון הנחות מתחת למעיים וחתוך אותו.לאחר איתור החדר הימני, השתמש במחט פרפר 25 עד 30 מד כדי להזריק 0.5 מיליליטר של 1%הפרין מופרד לחדר הימני לשטוף אותו לאט אבל בהתמדה עם 10 עד 15 מילימטרים של PBS. לאחר איתור הגרון, השתמש פינצטה קצה קהה לנתח את fascia ורקמות שמסביב, ולאחר מכן למקם את התפר הכירורגי מתחת קנה הנשימה ולקשור באופן רופף קשר כירורגי. מניחים חור קטן בקנה הנשימה עדיפה על החוט ומתכרבלים עם מחט באורך 20 מד.הדקו את התיל סביב המחט ו קנה הנשימה באמצעות קשר כירורגי. לאחר מכן הזריקו 2.5 עד 4 מיליליטר של אגרוז לתוך קנה הנשימה ופקחו על אינפלציית הריאה. לאחר הזרקת אגרוז, לשפוך PBS קר על הריאה כדי לחזק את האגורז.לאחר מכן לחתוך את קנה הנשימה מעולה התפר הכירורגי לנתח את הריאה והלב מן mediastinum על ידי הסרת כל הידבקויות fascia. לאחר התגבשות, מניחים את הרקמה ב- DMEM בצלחת פטרי על קרח, ומיד ממשיכים לתוחך אונה אחת באמצעות מכונת ויברטום. כדי להכין את פרוסות הריאה, חבר את הדגימה לפלטפורמה עם דבק-על, תוך שמירה על הצד המהודל פונה כלפי מעלה.לאחר מכן מלא את הגורם המכיל לדוגמה ב- PBS. מלא את המיכל בקרח כדי לשמור על PBS שמסביב לדגום קר. תדליק את הוויברטום.כוונן את העובי ל-300 מיקרומטר, תדירות ל-100 הרץ, משרעת ל-0.6 מילימטרים ומהירות לחמישה מיקרומטר לשנייה. בעזרת מפתח ברגים של אלן, הפכו את מחזיק הלהב לתנוחה הבטוחה ופתחו את הלסתות כדי להכניס להב. ואז להדק את הלסתות עם מפתח ברגים אלן.הנח את הדגימה על הקופסה, והבטח שהיא שקועה ב- PBS. החלק את התיבה למעלה במיקום הנכון וודא שהיא מאובטחת. הפוך את מחזיק הלהב לעמדה המתאימה ל חיתוך.מביאים את להב הוויברטום לקצה הבלוק ומנמיכים ידנית את הלהב עד שהוא אפילו עם החלק העליון של הדגימה. אשר את ההגדרות והפעל את הוויברטום. לאחר פרוסות טריות נחתכות, להסיר את הדגימות מן PBS ומניחים אותם לתוך צלחת פטרי סטרילית עם 10 מיליליטר של DMEM המכיל אנטיביוטיקה אנטי-ממיקוטית חד פעמית.לאחר הנחת כל הפרוסות בצלחת פטרי, לסגת הלהב לחלוטין ולהשתמש מפתח אלן להרים את הלהב למצב בטוח. אחסן את הדגימות ב- DMEM ב 37 מעלות צלזיוס. ומניחים פרוסת ויברטום על שקופית מיקרוסקופ.השתמש במחיקה לניקוי כדי להסיר מדיום עודף. הנח את הדגימה על מיקרוסקופיית ניגודיות הפאזה והשתמש בהגדלה של פי 10 עד 20 כדי לזהות כלי שיט. לאחר מכן להוסיף 500 microliters של vasoconstrictors, כגון 60 מילימולר אשלגן כלורי או אנדותלין מיקרומולרי אחד כדי להטביע לחלוטין את השקופית.צפה ולכוד את הווידאו על-ידי הקלטה למשך 30 עד 60 שניות. לפני תחילת הניסוי, מלאו קופסת קצף פוליסטירן קטנה בליטר אחד של חנקן נוזלי והניחו שתי צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר במיכל עם חנקן נוזלי. מניחים ארבע עד חמש פרוסות רטט טריות בקערת מרגמה.יוצקים 5 עד 10 מיליליטר של חנקן נוזלי על גבי הפרוסות ולהשתמש במהירות עלה לטחון את הפרוסות לאבקה לפני החנקן הנוזלי מתאדה. השתמשו בסקופ מעבדת פלדה מצוננת מראש כדי לגרוף את האבקה לתוך שני צינורות מיקרוצנטריפוגה צוננים ולזר את האבקה על ידי הוספת 500 מיקרוליטרים של ריאגנט מיצוי RNA לבידוד RNA או 500 מיקרוליטרים של חיץ RIPA לתסיסת חלבון. בניסוי הכדאיות הייצוגית, שינוי הצבע של פרוסות PCLS זוהה מיום אפס ליום אחד ויום תשע עד 10.הפתרון היה בתחילה כחול והפך ורוד בן לילה, והפגין כדאיות. שינוי צבע מתרחש בדרך כלל בתוך שעה עד ארבע שעות, אך ייתכן שיהיה צורך בזמן ארוך יותר. ההבדל היומי בין ספיגה ב 562 ו 613 אורכי גל ננומטר עבור הרקמה מוכנה רטט מוצג כאן.התכווצות כלי העיון ברקמת ריאה מוכנה רטט באמצעות אנדותלין-1 ואשלגן כלורי ניתן לדמיין כאן. שימור תיוג tdTomato בתאים שבוע לאחר הזרקת טמוקסיפן מוכח בפרוסות ריאות אלה. חשוב ביותר לבצע את ניקוי הריאות ואת צעד האינפלציה היטב כדי להסיר את כל הדם מהמחזור לפני ניסויים נוספים והדמיה.בנוסף למחלות כלי דם, ניתן ליישם PCLS כדי לחקור פיזיוביולוגיה של מחלות הקשורות דרכי הנשימה, וניתן לבדוק עוד יותר על רקמות הריאה האנושית בתרחישים רלוונטיים מבחינה קלינית.

Research

JoVE Journal

Medicine

Precision Cut Lung Slices as an Efficient Tool for Ex vivo Pulmonary Vessel Structure and Contractility Studies

Videomorphometric Analysis of Hypoxic Pulmonary Vasoconstriction of Intra-pulmonary Arteries Using Murine Precision Cut Lung Slices

ניתוח וידאומורפומטרי של Vasoconstriction ריאתי היפוקסי של עורקים תוך ריאתי באמצעות מוריס דיוק לחתוך פרוסות ריאות

Acute alveolar hypoxia causes pulmonary vasoconstriction (HPV) - also known as von Euler-Liljestrand mechanism - which serves to match lung perfusion to ...

Fundus Photography as a Convenient Tool to Study Microvascular Responses to Cardiovascular Disease Risk Factors in Epidemiological Studies

צילום קרקעית העין ככלי נוח ללמוד תגובות כלי הדם לגורמי סיכון קרדיווסקולריים מחלות באפידמיולוגיים לימודים

The microcirculation consists of blood vessels with diameters less than 150 &#181;m. It makes up a large part of the circulatory system and plays an ...

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

שיטה של ​​מבודד<em&gt; Ex Vivo</em&gt; ריאות זלוף במודל עכברוש: ​​לקחים מפיתוח תכנית EVLP עכברוש

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed ...

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

Ex vivo הדמיה חיה של ריאות גרורה microenvironment שלהם

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular ...

The 4-vessel Sampling Approach to Integrative Studies of Human Placental Physiology In Vivo

The 4-vessel Sampling Approach to Integrative Studies of Human Placental Physiology In Vivo

4-כלי דגימה גישה ללימודים אינטגרטיביים של הפיזיולוגיה השליה האדם<em&gt; בויבו</em

The human placenta is highly inaccessible for research while still in utero. The current understanding of human placental physiology in vivo is therefore ...

Combining Volumetric Capnography And Barometric Plethysmography To Measure The Lung Structure-function Relationship

שילוב Capnography נפח Plethysmography הברומטרי כדי למדוד את מערכת היחסים מבנה-פונקציית ריאות

Tools to measure lung and airways volume are critical for pulmonary researchers interested in evaluating the impact of disease or novel therapies on the ...

Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

Ex-Vivo איברים הקרנית מודל תרבות עבור ריפוי פצעים מחקרים

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

Quantitative Mapping of Specific Ventilation in the Human Lung using Proton Magnetic Resonance Imaging and Oxygen as a Contrast Agent

מיפוי כמותי של אוורור ספציפי בריאה האנושית באמצעות דימות תהודה מגנטית פרוטון וחמצן כסוכן ניגודיות

Specific ventilation imaging (SVI) is a functional magnetic resonance imaging technique capable of quantifying specific ventilation &#8213; the ratio of ...

Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts

אופקרדיוגרפיה ולימודי אלקטרופיזיולוגיה של לשעבר Vivo נגדורף

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to ...

Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology

מורנה דיוק-גזור פרוסות הכבד כמודל Vivo Ex של ביולוגיה של הכבד

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic ...