Name: precision cut lung slices as an efficient tool for ex vivo pulmonary vessel structure and contractility studies
Uploaded: 2021-05-24T13:00:00
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저자들은 위안하오 박사와 카이펑 리우 박사의 기술 지원에 감사드립니다. 이 작품은 NIH 1R01 HL150106-01A1, 파커 B. 프랜시스 펠로우십, 그리고 폐 고혈압 협회 Aldrighetti 연구 상 박사 케위안에 의해 지원되었다.

모든 동물 치료는 보스턴 아동 병원과 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인 프로토콜의 지침에 따라했다. 이 연구에서 사용되는 마우스는 야생 형 C57/B6 마우스와 Cdh5-CreERT2 x Ai14 tdTomato 교차 마우스입니다.
1. 솔루션 준비
<ol><li>실험 중에 필요한 인산염 완충액(1x PBS) 및 2% 아가로즈 용액을 미리 준비한다.<ol>
<li>아가로즈 파우더 2g을 100mL의 오토클레이브 워터에 섞습니다. 용?...

<ol>
	<li>Sparrow, D., Weiss, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+physiology.">Respiratory physiology.</a> Annual Review of Gerontology &amp; Geriatrics. 6, 197-214 (1986).</li><li>Gerckens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+3D+lung+tissue+cultures+(3D-LTCs)+for+disease+modeling.">Generation of human 3D lung tissue cultures (3D-LTCs) for disease modeling.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), e58437 (2019).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preserving+airway+smooth+muscle+contraction+in+precision-cut+lung+slices.">Preserving airway smooth muscle contraction in precision-cut lung slices.</a> Scientific Reports. 10 (1), 6480 (2020).</li><li>Rosales Gerpe, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+precision-cut+lung+slices+as+an+ex+vivo+tool+for+evaluating+viruses+and+viral+vectors+for+gene+and+oncolytic+therapy.">Use of precision-cut lung slices as an ex vivo tool for evaluating viruses and viral vectors for gene and oncolytic therapy.</a> Molecular Therapy: Methods &amp; Clinical Development. 10, 245-256 (2018).</li><li>Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+lung+physiology+in+health+and+disease+with+lung+slices.">Exploring lung physiology in health and disease with lung slices.</a> Pulmonary Pharmacology &amp; Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).</li><li>Liu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+lung+slices:+An+ex+vivo+model+for+the+evaluation+of+antiviral+and+anti-inflammatory+agents+against+influenza+viruses.">Mouse lung slices: An ex vivo model for the evaluation of antiviral and anti-inflammatory agents against influenza viruses.</a> Antiviral Research. 120, 101-111 (2015).</li><li>de Graaf, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+incubation+of+precision-cut+liver+and+intestinal+slices+for+application+in+drug+metabolism+and+toxicity+studies.">Preparation and incubation of precision-cut liver and intestinal slices for application in drug metabolism and toxicity studies.</a> Nature Protocols. 5 (9), 1540-1551 (2010).</li><li>Alsafadi, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+and+approaches+for+three-dimensional+precision-cut+lung+slices.+Disease+modeling+and+drug+discovery.">Applications and approaches for three-dimensional precision-cut lung slices. Disease modeling and drug discovery.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 62 (6), 681-691 (2020).</li><li>Morin, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+cut+lung+slices+as+an+efficient+tool+for+in+vitro+lung+physio-pharmacotoxicology+studies.">Precision cut lung slices as an efficient tool for in vitro lung physio-pharmacotoxicology studies.</a> Xenobiotica. 43 (1), 63-72 (2013).</li><li>Springer, J., Fischer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substance+P-induced+pulmonary+vascular+remodelling+in+precision+cut+lung+slices.">Substance P-induced pulmonary vascular remodelling in precision cut lung slices.</a> The European Respiratory Journal. 22 (4), 596-601 (2003).</li><li>Suleiman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Argon+reduces+the+pulmonary+vascular+tone+in+rats+and+humans+by+GABA-receptor+activation.">Argon reduces the pulmonary vascular tone in rats and humans by GABA-receptor activation.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1902 (2019).</li><li>Rieg, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+agents+affect+the+tone+of+pulmonary+arteries+and+veins+in+precision-cut+lung+slices.">Cardiovascular agents affect the tone of pulmonary arteries and veins in precision-cut lung slices.</a> PLoS One. 6 (12), 29698 (2011).</li><li>Perez, J. F., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+frequency+of+calcium+oscillations+induced+by+5-HT,+ACH,+and+KCl+determine+the+contraction+of+smooth+muscle+cells+of+intrapulmonary+bronchioles.">The frequency of calcium oscillations induced by 5-HT, ACH, and KCl determine the contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary bronchioles.</a> The Journal of General Physiology. 125 (6), 535-553 (2005).</li><li>Deng, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+of+5-hydroxytryptamine+receptor+signaling+in+coronary+arteries+after+organ+culture.">Upregulation of 5-hydroxytryptamine receptor signaling in coronary arteries after organ culture.</a> PLoS One. 9 (9), 107128 (2014).</li><li>Sandker, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adventitial+dissection:+A+simple+and+effective+way+to+reduce+radial+artery+spasm+in+coronary+bypass+surgery.">Adventitial dissection: A simple and effective way to reduce radial artery spasm in coronary bypass surgery.</a> Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 17 (5), 784-789 (2013).</li><li>Naik, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pressure-induced+smooth+muscle+cell+depolarization+in+pulmonary+arteries+from+control+and+chronically+hypoxic+rats+does+not+cause+myogenic+vasoconstriction.">Pressure-induced smooth muscle cell depolarization in pulmonary arteries from control and chronically hypoxic rats does not cause myogenic vasoconstriction.</a> Journal of Applied Physiology. 98 (3), 1119-1124 (2005).</li><li>Lopez-Lopez, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+induces+pulmonary+artery+endothelial+dysfunction+by+NADPH+oxidase+induction.">Diabetes induces pulmonary artery endothelial dysfunction by NADPH oxidase induction.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (5), 727-732 (2008).</li><li>Gonzalez-Tajuelo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+pulmonary+hypertension+associated+with+systemic+sclerosis+in+P-selectin+glycoprotein+Ligand+1-deficient+mice.">Spontaneous pulmonary hypertension associated with systemic sclerosis in P-selectin glycoprotein Ligand 1-deficient mice.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 72 (3), 477-487 (2020).</li><li>Bai, Y., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+Ca2++sensitivity+of+airway+smooth+muscle+cells+in+murine+lung+slices.">Modulation of the Ca2+ sensitivity of airway smooth muscle cells in murine lung slices.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (2), 208-221 (2006).</li><li>Nishiyama, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+function+and+endothelin-1:+tipping+the+balance+between+vasodilation+and+vasoconstriction.">Vascular function and endothelin-1: tipping the balance between vasodilation and vasoconstriction.</a> Journal of Applied Physiology. 122 (2), 354-360 (2017).</li><li>Schneider, M. P., Inscho, E. W., Pollock, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuated+vasoconstrictor+responses+to+endothelin+in+afferent+arterioles+during+a+high-salt+diet.">Attenuated vasoconstrictor responses to endothelin in afferent arterioles during a high-salt diet.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 292 (4), 1208-1214 (2007).</li><li>Inscho, E. W., Imig, J. D., Cook, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Afferent+and+efferent+arteriolar+vasoconstriction+to+angiotensin+II+and+norepinephrine+involves+release+of+Ca2++from+intracellular+stores.">Afferent and efferent arteriolar vasoconstriction to angiotensin II and norepinephrine involves release of Ca2+ from intracellular stores.</a> Hypertension. 29, 222-227 (1997).</li><li>Vecchione, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+from+angiotensin+II-mediated+vasculotoxic+and+hypertensive+response+in+mice+lacking+PI3Kgamma.">Protection from angiotensin II-mediated vasculotoxic and hypertensive response in mice lacking PI3Kgamma.</a> The Journal of Experimental Medicine. 201 (8), 1217-1228 (2005).</li></ol>

본 원고에서, 혈관 구조를 보존하고 실험적 유연성을 최적화하는 뮤린 폐 조직의 고해상도 이미지를 생성하는 향상된 방법이 설명되고, 특히 PCLS의 적용을 사용하여 혈관의 수축도 보존된 3차원에서 볼 수 있는 폐 조직의 미세 슬라이스를 얻을 수 있다. 이 프로토콜은 생존 가능성 시약을 사용하여 신중하게 준비되고 보존된 슬라이스가 1주일 이상 생존력을 유지할 수 있음을 보여줍니다. 마이크?...

해부학 구조를 희생하지 않고 세포 구성 요소를 보존하는 폐 조직의 준비 및 이미징의 발전은 폐 질환에 대한 상세한 이해를 제공합니다. 생리구조를 유지하면서 단백질, RNA 및 기타 생물학적 화합물을 식별하는 능력은 수많은 폐 질환에서 병리학의 이해를 넓힐 수 있는 세포의 공간 적 배치에 대한 중요한 정보를 제공한다. 이 상세한 심상은 폐 동맥 고혈압과 같은 폐 혈관 질병의 더 나은 이해로 이끌어 낼 수 있습니다, 동물 모형에 적용될 때, 잠재적으로 향상한 치료 전략으로 이끌어 냅니다.
기술의 진보에도 불구하고, 뮤린 폐 조직의 고품질 이미지를 얻는 것은 여전히 도전남아있다. 호흡 주기는 흡입1도중 생성된 음성 내측 압력에 의해 구동됩니다. 전통적으로 생검을 얻고 화상 진찰을 위한 폐 견본을 준비하는 때, 음성 압력 그라데이션은 기도와 혈관의 붕괴의 결과로 손실됩니다, 이는 더 이상 현재 상태에서 자신을 나타내지 않습니다. 현재 상태를 반영하는 사실적인 이미지를 얻으려면 폐기도를 다시 팽창해야 하며, 혈관이 침투하여 동적 폐를 정적 설비로 변경해야 합니다. 이러한 뚜렷한 기술의 적용은 대식세포와 같은 면역 세포를 포함하여 구조적 무결성, 폐 혈관 및 세포 성분을 보존할 수 있게 하여 폐 조직이 가능한 한 생리적 상태에 가깝게 볼 수 있게 합니다.
정밀 절단 폐 슬라이스 (PCLS)는 폐 혈관2의해부학 및 생리학을 연구하기위한 이상적인 도구입니다. PCLS는 구조 및 세포 성분을 보존하면서 폐 조직의 상세한 이미징을 3차원으로 제공합니다. PCLS는 동물 및 인간 모델에서 3차원으로 세포 기능의 생생, 고해상도 이미지를 허용하여 잠재적인 치료 목표를 연구하고, 작은 기도 수축을 측정하고, COPD, ILD 및 폐암3과같은 만성 폐 질환의 병리생리학을 연구하는 이상적인 도구입니다. 유사한 기술을 사용하여, 혈관 수축에 PCLS 견본의 노출은 폐 구조물 및 혈관 수축을 보존할 수 있습니다, 체외 조건에서 복제. 수축을 보존하는 것과 함께, 준비된 견본은 정확하게 준비될 때 RNA 시퀀싱, 서양 얼룩 및 유혈 세포측정과 같은 추가 분석을 겪을 수 있습니다. 마지막으로, 폐 수확 후 tdTomato 형광으로 표시된 리포터 색 표시 세포는 마이크로 슬라이스를 준비한 후 라벨을 보존할 수 있어 세포 추적 연구에 이상적입니다. 이러한 기술의 통합은 폐 혈관 질환에서 신호 캐스케이드 및 잠재적 치료 옵션에 대한 보다 상세한 이해로 이어질 수있는 세포 및 혈관 수축의 공간 배열을 보존하는 정교한 모델을 제공합니다.
이 원고에서 PCLS 뮤린 폐 조직은 혈관 수축에 노출되어 보존된 구조적 무결성과 혈관 수축을 입증합니다. 연구 결과는 적당히 준비되고 취급된 조직이 10 일 동안 실행 가능한 남아 있다는 것을 보여줍니다. 이 연구는 또한 내인성 형광(tdTomato)을 가진 세포의 보존을 보여 주며, 샘플이 폐 혈관 및 건축의 고해상도 이미지를 제공할 수 있도록 합니다. 마지막으로, RNA 측정및 근본적인 기계장치를 조사하기 위하여 서쪽 얼룩을 위한 조직 조각을 취급하고 준비하는 쪽이 기술되었습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5cc of fractionated heparin in syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>100 USP units per mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 1/2 inch gauge blunt end needle for trachea cannulation</td>
			<td>Cml Supply</td>
			<td>90120050D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30cc syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Anti solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated vibrating blade microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Viability Reagent (alamarBlue)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>DAL1025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium and GLutaMAX, supplemented with 10% FBS, 1% Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelin-1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mortar and Pestle</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA lysis and extraction buffer</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>89900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical suture 6/0</td>
			<td>FST</td>
			<td>18020-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Invitrogen, Thermofisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Low Melting Point Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>VT1200 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Winged blood collection set (Butterfly needle) 25-30G</td>
			<td>BD</td>
			<td>25-30G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

precision cut lung slices as an efficient tool for ex vivo pulmonary vessel structure and contractility studies

뮤린 폐 조직의 시각화는 기본 기도 및 혈관에 관한 귀중한 구조 및 세포 정보를 제공합니다. 그러나, 진정으로 생리 조건을 나타내는 폐 혈관의 보존은 여전히 도전을 제시한다. 또한, 뮤린 폐의 섬세한 구성은 세포 구성과 아키텍처를 모두 보존하는 고품질 이미지에 대한 샘플을 준비하는 기술적 과제를 초래합니다. 유사하게, 세포 수축성 검사는 체외에서혈관 수축에 반응하는 세포의 잠재력을 연구하기 위하여 수행될 수 있습니다, 그러나 이 소약은 그대로 폐의 복잡한 환경을 재현하지 않습니다. 이러한 기술적 문제와는 달리, 정밀 절단 폐 슬라이스(PCLS) 방법은 지역적 편견 없이 폐 조직을 3차원으로 시각화하고 최대 10일 동안 살아있는 대리 수축 모델로 작용할 수 있는 효율적인 대안으로 적용될 수 있다. PCLS를 사용하여 제조된 조직은 구조와 공간 방향을 보존하여 질병 과정을연구하는 것이 이상적입니다. 유도성 tdTomato 리포터 뮤린 모델에서 수확한 PCLS내 내인성 tdTomato 표지 세포의 위치는 공초점 현미경 검사법에 의해 성공적으로 시각화될 수 있다. 혈관 수축에 노출 된 후, PCLS는 시간 경과 모듈에 의해 포착 될 수있는 혈관 수축과 폐 구조 모두의 보존을 보여줍니다. 서부 블롯 및 RNA 분석과 같은 다른 절차와 함께 PCLS는 다양한 장애의 근간을 겪고 폐 혈관 질환의 병리생리학에 대한 더 나은 이해로 이어지는 신호 캐스케이드의 포괄적 인 이해에 기여할 수 있습니다.

세포 또는 조직에 추가될 때, 생존성 시약은 실행 가능한 조직의 감소 환경에 의해 수정되고 분홍색/빨갛게 되어 높은 형광이 됩니다. 0-1일 및 9-10일째부터 감지된 대표적인 색상 변화는 도 3에서입증된다. 언급했듯이, 솔루션은 파란색으로 시작하여 하룻밤 사이에 분홍색으로 변하여 생존가능성을 보여주었습니다. 색상 변경은 일반적으로 1-4 시간 이내에 발생합니다. 그러?...

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Precision Cut Lung Slices as an Efficient Tool for Ex vivo Pulmonary Vessel Structure and Contractility Studies

여기에 제시된 PCLS 뮤린 폐 조직의 혈관 수축을 보존하기 위한 프로토콜이 있으며, 그 결과 수많은 절차에 취약한 최대 10일 동안 보존될 수 있는 폐 혈관 및 기도의 정교한 입체 이미지가 생성된다.

정밀 절단 폐 슬라이스는 전 생체 폐 혈관 구조 및 수축 연구를위한 효율적인 도구로

The visualization of murine lung tissue provides valuable structural and cellular information regarding the underlying airway and vasculature. However, ...

정밀 절단 폐 슬라이스 방법은 지역 적 편견없이 3 차원으로 구조 와 공간 방향을 보존하고 선박 및 기도 수축 측정을위한 라이브 대리 모델로 사용될 수 있습니다. 시간 경과 화상 진찰, 서양 얼룩 및 RNA 분석과 결합하여, 정밀 절단 폐 조각은 다양한 무질서의 기초에 근거하고 폐 혈관 질병의 병리학의 더 나은 이해로 이끌어 내는 신호 캐스케이드의 포괄적인 이해에 기여합니다. 먼저 안락사된 성인 마우스를 supine 위치에 놓고 발과 코를 접착제 테이프로 테이블에 테이프로 테이프로 눌러 제자리에 고정하십시오.70%에탄올로 마우스의 복부 표면을 분사합니다. 집게를 사용하여 방광 및 수술 가위의 위치에서 마우스의 복부 피부를 들어 올려 중간라인에서 절단하고 자궁 경부 부위로 우월하게 이동하여 기관지를 노출시합니다. 그런 다음 핀셋을 사용하여 기본 근막 층을 들어 올리고 외과 가위를 사용하여 내장 장기와 근간 구획을 노출하고 다시 열등하게 절단하여 우수한 것으로 절단하십시오.심장과 폐를 드러내기 위해 중간선에서 흉골을 자른다. 간 및 복부 구획에서 다이어프램을 조심스럽게 해부하십시오. 창자 아래에 열등한 베나 카바를 찾아 잘라냅니다.오른쪽 심실을 찾은 후, 25 내지 30 게이지 나비 바늘을 사용하여 오른쪽 심실에 1%분획 된 헤파린의 0.5 밀리리터를 주입하고 PBS의 10 ~ 15 밀리미터로 천천히 그러나 꾸준히 씻어 내립니다. 후두를 찾은 후 무딘 팁 핀셋을 사용하여 주변 근막과 조직을 해부한 다음 수술 봉합사를 기관 아래에 놓고 수술 매듭을 느슨하게 묶습니다. 끈보다 우수한 기관지에 작은 구멍을 놓고 20 게이지 무딘 엔드 바늘로 캔터레이.수술 매듭을 사용하여 바늘과 기관 주위의 봉합사를 조입니다. 그런 다음 기관으로 아가로오스 2.5 ~4 밀리리터를 주입하고 폐의 인플레이션을 모니터링합니다. 아가로즈 주입 후, 아가로즈를 고화시키기 위해 폐에 차가운 PBS를 붓습니다.그런 다음 수술 봉합사보다 우수한 기관지를 자르고 접착및 근막을 제거하여 폐와 심장을 중진에서 해부합니다. 응고 후, DMEM에 티슈를 얼음 위에 페트리 접시에 놓고 즉시 진동 기계를 사용하여 한 엽을 자르는 것을 진행합니다. 폐 슬라이스를 준비하려면 시료를 슈퍼 접착제로 플랫폼에 부착하여 내측을 향하게 합니다.그런 다음 샘플 용기를 PBS로 채웁니다. 주변 PBS를 유지하고 차가운 샘플을 유지하기 위해 얼음으로 용기를 채웁니다. 진동을 켭니다.두께를 300 마이크로미터로 조정하고, 주파수를 100 헤르츠로, 진폭은 0.6밀리미터로, 초당 5마이크로미터로 속도를 조절한다. 알렌 렌치를 사용하여 블레이드 홀더를 안전한 위치로 바꾸고 턱을 열어 블레이드를 삽입합니다. 그런 다음 알렌 렌치로 턱을 조입니다.샘플을 상자에 놓아 PBS에 침수되도록 합니다. 상자를 올바른 위치에 밀어 놓고 안전한지 확인합니다. 블레이드 홀더를 슬라이스에 적합한 위치로 바꿔놓습니다.진동 블레이드를 블록 가장자리까지 가져와서 샘플 상단이 될 때까지 블레이드를 수동으로 낮춥습니다. 설정을 확인하고 진동을 실행합니다. 신선한 슬라이스를 절단 한 후, PBS에서 샘플을 제거하고 일회성 항mycotic 항생제를 포함하는 DMEM의 10 밀리리터와 멸균 페트리 접시에 배치합니다.페트리 접시에 모든 조각을 넣은 후 블레이드를 완전히 철회하고 알렌 렌치를 사용하여 블레이드를 안전한 위치로 올립니다. 샘플을 섭씨 37도에 DMEM에 보관하십시오. 그리고 현미경 슬라이드에 진동 조각을 놓습니다.클리닝 와이프를 사용하여 과도한 매체를 제거하십시오. 상 대비 현미경 검사법에 샘플을 배치하고 혈관을 식별하기 위해 10 ~ 20배 배율을 사용합니다. 그런 다음 60 밀리알륨 염화 칼륨 또는 1 개의 미세 몰린-1과 같은 혈관 수축기 500 마이크로 리터를 추가하여 슬라이드를 완전히 잠급합니다.30~60초 동안 녹화하여 비디오를 관찰하고 캡처합니다. 실험을 시작하기 전에 작은 폴리스티렌 폼 박스에 액체 질소 1리터를 채우고 액체 질소가 있는 용기에 1.5밀리리터 미세원심분리기 튜브 2개를 놓습니다. 박격포 그릇에 4-5개의 신선한 진동 조각을 넣습니다.슬라이스 위에 액체 질소 5~10밀리리터를 붓고 유봉을 사용하여 액체 질소가 증발하기 전에 조각을 분말로 분쇄합니다. 미리 차가운 강철 실험실 스쿠퍼를 사용하여 두 개의 차가운 미세 원심 분리 튜브에 분말을 스쿱하고 RNA 절연을위한 RNA 추출 시약 500 마이크로 리터 또는 단백질 용 용 RIPA 버퍼 500 마이크로 리터를 추가하여 분말을 lyse하십시오. 대표적인 생존능력 실험에서는 PCLS 슬라이스의 색상 변화가 0일에서 1일 및 10일째까지 검출되었다.이 솔루션은 처음에는 파란색으로 되어 하룻밤 사이에 분홍색으로 변하여 생존가능성을 보여주었습니다. 색상 변경은 일반적으로 1~4시간 이내에 발생했지만 더 긴 시간이 필요할 수 있습니다. 진동방지조직을 위한 562 나노미터 파장의 흡광도와 613나노미터파장의 일일 차이는 여기에 도시된다.내피-1 및 염화칼륨을 사용하여 진동기가 준비된 폐 조직에서 혈관의 수축을 시각화할 수 있다. 타목시펜 주입 후 1 주일 세포에서 tdTomato 라벨링의 보존은 이 폐 조각에서 입증된다. 추가 실험 및 화상 진찰 의 앞에 순환에서 모든 혈액을 제거하기 위하여 폐 정리 및 인플레이션 단계를 잘 수행하는 것이 가장 중요합니다.혈관 질환 외에도, PCLS는 기도 관련 질병의 생리학을 연구하기 위하여 적용될 수 있고, 임상적으로 관련있는 시나리오에서 인간 폐 조직에 추가 시험될 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Medicine

Precision Cut Lung Slices as an Efficient Tool for Ex vivo Pulmonary Vessel Structure and Contractility Studies

Videomorphometric Analysis of Hypoxic Pulmonary Vasoconstriction of Intra-pulmonary Arteries Using Murine Precision Cut Lung Slices

Murine 정밀 절단 폐 슬라이스를 사용하여 폐 내 동맥의 저산소 폐 혈관 수축의 비디오 형태 측정 분석

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연구

의학

Fundus Photography as a Convenient Tool to Study Microvascular Responses to Cardiovascular Disease Risk Factors in Epidemiological Studies

편리한 도구로 안저 사진은 역학 연구에서 심혈관 질환의 위험 요인에 대한 미세 혈관 응답을 연구하기 위해

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