Name: precision cut lung slices as an efficient tool for ex vivo pulmonary vessel structure and contractility studies
Uploaded: 2021-05-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Precision Cut Lung Slices as an Efficient Tool for Ex vivo Pulmonary Vessel Structure and Contractility Studies at JoVE.com

Forfatterne vil takke Dr. Yuan Hao og Kaifeng Liu for deres tekniske støtte. Dette arbeidet ble støttet av en NIH 1R01 HL150106-01A1, Parker B. Francis Fellowship, og Pulmonary Hypertension Association Aldrighetti Research Award til Dr. Ke Yuan.

All dyrepleie var i samsvar med retningslinjene fra Boston Children's Hospital og Institutional Animal Care and Use Committee godkjente protokoller. Musene som brukes i denne studien er vill type C57 / B6 mus og Cdh5-CreERT2 x Ai14 tdTomato krysset mus.
1. Utarbeidelse av løsninger
<ol><li>Forbered fosfatbufferløsning (1x PBS) og 2% agarose løsning som kreves under eksperimentet på forhånd.<ol>
<li>Bland 2 g agarosepulver i 100 ml autoklavert vann. Varm den opp i mikrobølgeovnen noen s...

<ol>
	<li>Sparrow, D., Weiss, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+physiology.">Respiratory physiology.</a> Annual Review of Gerontology &amp; Geriatrics. 6, 197-214 (1986).</li><li>Gerckens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+3D+lung+tissue+cultures+(3D-LTCs)+for+disease+modeling.">Generation of human 3D lung tissue cultures (3D-LTCs) for disease modeling.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), e58437 (2019).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preserving+airway+smooth+muscle+contraction+in+precision-cut+lung+slices.">Preserving airway smooth muscle contraction in precision-cut lung slices.</a> Scientific Reports. 10 (1), 6480 (2020).</li><li>Rosales Gerpe, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+precision-cut+lung+slices+as+an+ex+vivo+tool+for+evaluating+viruses+and+viral+vectors+for+gene+and+oncolytic+therapy.">Use of precision-cut lung slices as an ex vivo tool for evaluating viruses and viral vectors for gene and oncolytic therapy.</a> Molecular Therapy: Methods &amp; Clinical Development. 10, 245-256 (2018).</li><li>Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+lung+physiology+in+health+and+disease+with+lung+slices.">Exploring lung physiology in health and disease with lung slices.</a> Pulmonary Pharmacology &amp; Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).</li><li>Liu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+lung+slices:+An+ex+vivo+model+for+the+evaluation+of+antiviral+and+anti-inflammatory+agents+against+influenza+viruses.">Mouse lung slices: An ex vivo model for the evaluation of antiviral and anti-inflammatory agents against influenza viruses.</a> Antiviral Research. 120, 101-111 (2015).</li><li>de Graaf, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+incubation+of+precision-cut+liver+and+intestinal+slices+for+application+in+drug+metabolism+and+toxicity+studies.">Preparation and incubation of precision-cut liver and intestinal slices for application in drug metabolism and toxicity studies.</a> Nature Protocols. 5 (9), 1540-1551 (2010).</li><li>Alsafadi, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+and+approaches+for+three-dimensional+precision-cut+lung+slices.+Disease+modeling+and+drug+discovery.">Applications and approaches for three-dimensional precision-cut lung slices. Disease modeling and drug discovery.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 62 (6), 681-691 (2020).</li><li>Morin, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+cut+lung+slices+as+an+efficient+tool+for+in+vitro+lung+physio-pharmacotoxicology+studies.">Precision cut lung slices as an efficient tool for in vitro lung physio-pharmacotoxicology studies.</a> Xenobiotica. 43 (1), 63-72 (2013).</li><li>Springer, J., Fischer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substance+P-induced+pulmonary+vascular+remodelling+in+precision+cut+lung+slices.">Substance P-induced pulmonary vascular remodelling in precision cut lung slices.</a> The European Respiratory Journal. 22 (4), 596-601 (2003).</li><li>Suleiman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Argon+reduces+the+pulmonary+vascular+tone+in+rats+and+humans+by+GABA-receptor+activation.">Argon reduces the pulmonary vascular tone in rats and humans by GABA-receptor activation.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1902 (2019).</li><li>Rieg, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+agents+affect+the+tone+of+pulmonary+arteries+and+veins+in+precision-cut+lung+slices.">Cardiovascular agents affect the tone of pulmonary arteries and veins in precision-cut lung slices.</a> PLoS One. 6 (12), 29698 (2011).</li><li>Perez, J. F., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+frequency+of+calcium+oscillations+induced+by+5-HT,+ACH,+and+KCl+determine+the+contraction+of+smooth+muscle+cells+of+intrapulmonary+bronchioles.">The frequency of calcium oscillations induced by 5-HT, ACH, and KCl determine the contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary bronchioles.</a> The Journal of General Physiology. 125 (6), 535-553 (2005).</li><li>Deng, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+of+5-hydroxytryptamine+receptor+signaling+in+coronary+arteries+after+organ+culture.">Upregulation of 5-hydroxytryptamine receptor signaling in coronary arteries after organ culture.</a> PLoS One. 9 (9), 107128 (2014).</li><li>Sandker, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adventitial+dissection:+A+simple+and+effective+way+to+reduce+radial+artery+spasm+in+coronary+bypass+surgery.">Adventitial dissection: A simple and effective way to reduce radial artery spasm in coronary bypass surgery.</a> Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 17 (5), 784-789 (2013).</li><li>Naik, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pressure-induced+smooth+muscle+cell+depolarization+in+pulmonary+arteries+from+control+and+chronically+hypoxic+rats+does+not+cause+myogenic+vasoconstriction.">Pressure-induced smooth muscle cell depolarization in pulmonary arteries from control and chronically hypoxic rats does not cause myogenic vasoconstriction.</a> Journal of Applied Physiology. 98 (3), 1119-1124 (2005).</li><li>Lopez-Lopez, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+induces+pulmonary+artery+endothelial+dysfunction+by+NADPH+oxidase+induction.">Diabetes induces pulmonary artery endothelial dysfunction by NADPH oxidase induction.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (5), 727-732 (2008).</li><li>Gonzalez-Tajuelo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+pulmonary+hypertension+associated+with+systemic+sclerosis+in+P-selectin+glycoprotein+Ligand+1-deficient+mice.">Spontaneous pulmonary hypertension associated with systemic sclerosis in P-selectin glycoprotein Ligand 1-deficient mice.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 72 (3), 477-487 (2020).</li><li>Bai, Y., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+Ca2++sensitivity+of+airway+smooth+muscle+cells+in+murine+lung+slices.">Modulation of the Ca2+ sensitivity of airway smooth muscle cells in murine lung slices.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (2), 208-221 (2006).</li><li>Nishiyama, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+function+and+endothelin-1:+tipping+the+balance+between+vasodilation+and+vasoconstriction.">Vascular function and endothelin-1: tipping the balance between vasodilation and vasoconstriction.</a> Journal of Applied Physiology. 122 (2), 354-360 (2017).</li><li>Schneider, M. P., Inscho, E. W., Pollock, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuated+vasoconstrictor+responses+to+endothelin+in+afferent+arterioles+during+a+high-salt+diet.">Attenuated vasoconstrictor responses to endothelin in afferent arterioles during a high-salt diet.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 292 (4), 1208-1214 (2007).</li><li>Inscho, E. W., Imig, J. D., Cook, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Afferent+and+efferent+arteriolar+vasoconstriction+to+angiotensin+II+and+norepinephrine+involves+release+of+Ca2++from+intracellular+stores.">Afferent and efferent arteriolar vasoconstriction to angiotensin II and norepinephrine involves release of Ca2+ from intracellular stores.</a> Hypertension. 29, 222-227 (1997).</li><li>Vecchione, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+from+angiotensin+II-mediated+vasculotoxic+and+hypertensive+response+in+mice+lacking+PI3Kgamma.">Protection from angiotensin II-mediated vasculotoxic and hypertensive response in mice lacking PI3Kgamma.</a> The Journal of Experimental Medicine. 201 (8), 1217-1228 (2005).</li></ol>

I dette manuskriptet beskrives en forbedret metode for å produsere høyoppløselige bilder av murin lungevev som bevarer den vaskulære strukturen og optimaliserer eksperimentell fleksibilitet, spesielt ved bruk av PCLS for å oppnå mikroslikvier av lungevev som kan ses i tre dimensjoner med bevart kontraktilitet av vaskulaturen. Ved hjelp av levedyktighetsreagensen viser protokollen at nøye forberedte og bevarte skiver kan beholde levedyktigheten i mer enn en uke. Bevart levedyktighet av mikroslikviene gjør det muli...

Fremskritt i fremstilling og avbildning av lungevev som bevarer cellulære komponenter uten å ofre anatomisk struktur gir en detaljert forståelse av lungesykdommer. Evnen til å identifisere proteiner, RNA og andre biologiske forbindelser samtidig som man opprettholder fysiologisk struktur, gir viktig informasjon om det romlige arrangementet av celler som kan utvide forståelsen av patofysiologien i mange lungesykdommer. Disse detaljerte bildene kan føre til en bedre forståelse av lungevaskulære sykdommer, som pulmonal arterie hypertensjon, når de brukes på dyremodeller, noe som potensielt fører til forbedrede terapeutiske strategier.
Til tross for fremskritt innen teknologi, er det fortsatt en utfordring å skaffe bilder av murin lungevev av høy kvalitet. Åndedrettssyklusen drives av et negativt intrathoracic trykk generert under innånding1. Når du tradisjonelt skaffer biopsier og forbereder lungeprøver for avbildning, går den negative trykkgradienten tapt, noe som resulterer i sammenbrudd av luftveiene og vaskulaturen, som ikke lenger representerer seg selv i sin nåværende tilstand. For å oppnå realistiske bilder som reflekterer dagens forhold, må lungeveiene fylles opp igjen, og vaskulaturen perfunderes, og endrer den dynamiske lungen til en statisk armatur. Anvendelsen av disse distinkte teknikkene gjør det mulig å bevare strukturell integritet, lungevaskulatur og cellulære komponenter, inkludert immunceller som makrofager, slik at lungevev kan ses så nær sin fysiologiske tilstand som mulig.
Presisjonskuttet lungeslicing (PCLS) er et ideelt verktøy for å studere anatomien og fysiologien til lungevaskulatur2. PCLS gir detaljert bildebehandling av lungevevet i tre dimensjoner samtidig som strukturelle og cellulære komponenter bevares. PCLS har blitt brukt i dyre- og menneskelige modeller for å tillate levende bilder med høy oppløsning av cellulære funksjoner i tre dimensjoner, noe som gjør det til et ideelt verktøy for å studere potensielle terapeutiske mål, måle liten luftveiskontraksjon og studere patofysiologien til kroniske lungesykdommer som KOLS, ILD og lungekreft3. Ved hjelp av lignende teknikker kan eksponeringen av PCLS-prøver til vasokonstriktorer bevare lungestruktur og karkontraktilitet, og gjenskape in vitro-forhold. Sammen med å bevare kontraktilitet, kan forberedte prøver gjennomgå ytterligere analyse som RNA-sekvensering, vestlig blotten og strømningscytometri når de er forberedt riktig. Til slutt kan reporterfargemerkede celler merket med tdTomato-fluorescens etter lungehøst bevare merking etter å ha forberedt mikroslikvier, noe som gjør den ideell for cellesporingsstudier. Integreringen av disse teknikkene gir en sofistikert modell som bevarer det romlige arrangementet av celler og karkontraktilitet som kan føre til en mer detaljert forståelse av signalkaskadene og potensielle terapeutiske alternativer ved lungevaskulatursykdom.
I dette manuskriptet er PCLS murin lungevev utsatt for vasokonstriktorer, som demonstrerer bevart strukturell integritet og karkontraktilitet. Studien viser at vevet som er tilberedt og håndtert på riktig måte, kan forbli levedyktig i 10 dager. Studien viser også bevaring av celler med endogen fluorescens (tdTomato), slik at prøver kan gi høyoppløselige bilder av lungevaskulaturen og arkitekturen. Til slutt er det beskrevet måter å håndtere og klargjøre vevsskiver for RNA-måling og vestlig flekk for å undersøke underliggende mekanismer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5cc of fractionated heparin in syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>100 USP units per mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 1/2 inch gauge blunt end needle for trachea cannulation</td>
			<td>Cml Supply</td>
			<td>90120050D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30cc syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Anti solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated vibrating blade microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Viability Reagent (alamarBlue)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>DAL1025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium and GLutaMAX, supplemented with 10% FBS, 1% Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelin-1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mortar and Pestle</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA lysis and extraction buffer</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>89900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical suture 6/0</td>
			<td>FST</td>
			<td>18020-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Invitrogen, Thermofisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Low Melting Point Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>VT1200 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Winged blood collection set (Butterfly needle) 25-30G</td>
			<td>BD</td>
			<td>25-30G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

precision cut lung slices as an efficient tool for ex vivo pulmonary vessel structure and contractility studies

Visualiseringen av murin lungevev gir verdifull strukturell og cellulær informasjon om underliggende luftvei og vaskulatur. Bevaring av lungefartøy som virkelig representerer fysiologiske forhold gir imidlertid fortsatt utfordringer. I tillegg resulterer den delikate konfigurasjonen av murin lunger i tekniske utfordringer med å forberede prøver for bilder av høy kvalitet som bevarer både cellulær sammensetning og arkitektur. På samme måte kan cellulære kontraktilitetsanalyser utføres for å studere potensialet til celler for å reagere på vasokonstriktorer in vitro, men disse analysene reproduserer ikke det komplekse miljøet i den intakte lungen. I motsetning til disse tekniske problemene kan den presisjonskuttede lungeskiven (PCLS) brukes som et effektivt alternativ til å visualisere lungevev i tre dimensjoner uten regional skjevhet og tjene som en live surrogatkontraktilitetsmodell i opptil 10 dager. Vev tilberedt ved hjelp av PCLS har bevart struktur og romlig orientering, noe som gjør det ideelt å studere sykdomsprosesser ex vivo. Plasseringen av endogene tdTomato-merkede celler i PCLS høstet fra en induserbar tdTomato reporter murine modell kan vellykket visualiseres ved konfikal mikroskopi. Etter eksponering for vasokonstriktorer demonstrerer PCLS bevaring av både karkontraktilitet og lungestruktur, som kan fanges opp av en tidsforløpmodul. I kombinasjon med de andre prosedyrene, som vestlig blot- og RNA-analyse, kan PCLS bidra til den omfattende forståelsen av signalkaskader som ligger til grunn for et bredt spekter av lidelser og fører til en bedre forståelse av patofysiologien i lungevaskulære sykdommer.

Når det legges til celler eller vev, endres levedyktighetsreagenset ved å redusere miljøet av levedyktig vev og blir rosa / rødt, og blir svært fluorescerende. De representative fargeendringene som oppdages fra dag 0-1 og dag 9-10, vises i figur 3. Som nevnt startet løsningen blå og ble rosa over natten, noe som viste levedyktighet. Fargeendring skjer vanligvis innen 1-4 timer. Det kan imidlertid være nødvendig med lengre tid. For å analyse for levedyktighet ble en plateleser brukt...

Watch this Scientific Journal Video about Precision Cut Lung Slices as an Efficient Tool for Ex vivo Pulmonary Vessel Structure and Contractility Studies at JoVE.com

Precision Cut Lung Slices as an Efficient Tool for Ex vivo Pulmonary Vessel Structure and Contractility Studies

Presentert her er en protokoll for å bevare vaskulær kontraktilitet av PCLS murin lungevev, noe som resulterer i et sofistikert tredimensjonalt bilde av lungevaskulaturen og luftveiene, som kan bevares i opptil 10 dager som er utsatt for mange prosedyrer.

Presisjonskuttede lungeskiver som et effektivt verktøy for Ex vivo lungefartøystruktur og kontraktilitetsstudier

The visualization of murine lung tissue provides valuable structural and cellular information regarding the underlying airway and vasculature. However, ...

Presisjonskuttede lungeskiver vil bevare strukturen og romlige orienteringer i tre dimensjoner uten regional skjevhet og kan fungere som en levende surrogatmodell for fartøy og luftveiskontraktilitetsmålinger. I kombinasjon med tidsforløpavbildning, vestlig flekk og RNA-analyse bidrar presisjonskuttede lungeskiver til den omfattende forståelsen av signalkaskader som ligger til grunn for et bredt spekter av lidelser og fører til en bedre forståelse av patofysiologien i lungevaskulære sykdommer. For å begynne med, plasser den euthanized voksne musen i en liggende stilling og fest den på plass ved å tappe potene og nesen til bordet med tape.Spray den ventrale overflaten av musen med 70% etanol. Bruk tang til å løfte bukhuden på musen på plasseringen av blæren og kirurgisk saks for å kutte ved midtlinjen, beveger seg overlegent til livmorhalsområdet for å eksponere luftrøret. Bruk deretter pinsett for å løfte det underliggende fascialaget og bruk kirurgisk saks for å eksponere de viscerale organene og mediastinalrommet, og kutt igjen dårligere til overlegen.Klipp brystbenet i midtlinjen for å eksponere hjertet og lungen. Disseker membranen forsiktig fra leveren og bukrommet. Finn den dårligere vena cava under tarmene og kutt den.Etter å ha funnet høyre ventrikel, bruk en 25 til 30 gauge sommerfuglnål for å injisere 0,5 milliliter 1% fraksjonert heparin i høyre ventrikel og skyll den sakte, men jevnt med 10 til 15 millimeter PBS. Etter å ha funnet strupehodet, bruk stumpe tweezers for å dissekere den omkringliggende fascia og vev, legg deretter den kirurgiske suturen under luftrøret og bind løst en kirurgisk knute. Plasser et lite hull i luftrøret som er overlegen strengen og kanyler med en 20 gauge stump nål.Stram suturen rundt nålen og luftrøret ved hjelp av en kirurgisk knute. Injiser deretter 2,5 til 4 milliliter agarose i luftrøret og overvåk for inflasjonen i lungen. Etter agarose injeksjonen, hell kald PBS over lungen for å størkne agarose.Klipp deretter luftrøret overlegen den kirurgiske suturen og disseker lungen og hjertet fra mediastinum ved å fjerne eventuelle vedheft og fascia. Etter størkning, legg vevet i DMEM i en Petri-tallerken på is, og fortsett umiddelbart å kutte en lobe ved hjelp av en vibratommaskin. For å forberede lungeskivene, fest prøven til plattformen med superlim, og hold medialsiden vendt opp.Fyll deretter prøvebeholderen med PBS. Fyll beholderen med is for å holde den omkringliggende PBS og prøve kald. Slå på vibratomet.Juster tykkelsen til 300 mikrometer, frekvens til 100 Hertz, amplitude til 0,6 millimeter, og hastighet til fem mikrometer per sekund. Bruk en unbrakonøkkel til å dreie bladholderen i sikker posisjon og åpne kjevene for å sette inn et blad. Stram deretter kjevene med en unbrakonøkkel.Plasser prøven på esken, og sørg for at den er nedsenket i PBS. Skyv boksen opp i riktig posisjon, og kontroller at den er sikker. Vri bladholderen i riktig posisjon for kutting.Før vibratombladet opp til kanten av blokken og senk bladet manuelt til det er jevnt med toppen av prøven. Bekreft innstillingene og kjør vibratomet. Etter at de friske skivene er kuttet, fjern prøvene fra PBS og legg dem i en steril Petri-tallerken med 10 milliliter DMEM som inneholder engangs antimykotisk antibiotika.Etter å ha plassert alle skivene i en Petri-tallerken, trekk bladet helt tilbake og bruk unbrakonøkkelen til å heve bladet i en sikker posisjon. Oppbevar prøvene i DMEM ved 37 grader Celsius. Og legg en vibratomskive på et mikroskopsklie.Bruk en rengjøringsserviett for å fjerne overflødig medium. Plasser prøven på fasekontrastmikroskopien og bruk 10 til 20X forstørrelse for å identifisere et fartøy. Tilsett deretter 500 mikroliter vasokonstriktorer, for eksempel 60 millimolar kaliumklorid eller en mikromolar endothelin-1 for å helt nedsenke lysbildet.Observer og ta opp videoen ved å spille inn i 30 til 60 sekunder. Før du begynner eksperimentet, fyll en liten polystyrenskumboks med en liter flytende nitrogen og legg to 1,5 milliliter mikrocentrifugerør i beholderen med flytende nitrogen. Legg fire til fem friske vibratomskiver i en mørtelskål.Hell 5 til 10 milliliter flytende nitrogen på toppen av skivene og bruk raskt pestle til å male skivene i pulver før det flytende nitrogenet fordamper. Bruk en pre-kjølt stål laboratorie scooper å øse pulveret inn i de to kjølte microcentrifuge rør og lyse pulveret ved å legge 500 mikroliters av RNA ekstraksjon reagens for RNA isolasjon eller 500 mikroliter RIPA buffer for protein lysis. I det representative levedyktighetseksperimentet ble fargeendringen av PCLS-skivene oppdaget fra dag null til en og dag ni til 10.Løsningen var i utgangspunktet blå og ble rosa over natten, noe som viste levedyktighet. Fargeendring skjedde vanligvis innen én til fire timer, men det kan være nødvendig med lengre tid. Den daglige forskjellen mellom absorbans ved 562 og 613 nanometerbølgelengder for det vibratome-forberedte vevet er vist her.Innsnevring av vaskulaturen i et vibratom-forberedt lungevev ved hjelp av endothelin-1 og kaliumklorid kan visualiseres her. Bevaring av tdTomato merking i celler en uke etter tamoxifen injeksjon er demonstrert i disse lunge skiver. Det er viktigst å utføre lungeryddingen og inflasjonstrinnet godt for å fjerne alt blod fra sirkulasjonen før ytterligere eksperimenter og avbildning.I tillegg til vaskulære sykdommer kan PCLS brukes til å studere fysiobiologi av luftveisrelatert sykdom, og kan videre testes på humant lungevev i klinisk relevante scenarier.

Research

JoVE Journal

Medicine

Precision Cut Lung Slices as an Efficient Tool for Ex vivo Pulmonary Vessel Structure and Contractility Studies

Videomorphometric Analysis of Hypoxic Pulmonary Vasoconstriction of Intra-pulmonary Arteries Using Murine Precision Cut Lung Slices

Videomorfometrisk analyse av hypoksisk lungevaokonstriksjon av intrapulmonale arterier ved hjelp av murine presisjonskuttede lungeskiver

Acute alveolar hypoxia causes pulmonary vasoconstriction (HPV) - also known as von Euler-Liljestrand mechanism - which serves to match lung perfusion to ...

Fundus Photography as a Convenient Tool to Study Microvascular Responses to Cardiovascular Disease Risk Factors in Epidemiological Studies

Fundusfotografering som et praktisk verktøy for å studere mikrovaskulær Responses to Cardiovascular Disease Risk Factors i epidemiologiske studier

The microcirculation consists of blood vessels with diameters less than 150 &#181;m. It makes up a large part of the circulatory system and plays an ...

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

Måte Isolert<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Lung Perfusjons i en Rat Modell: Erfaringer fra å utvikle en Rat EVLP Program

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed ...

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

Ex vivo Levende Imaging av Lung Metastase og deres mikromiljøet

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular ...

The 4-vessel Sampling Approach to Integrative Studies of Human Placental Physiology In Vivo

The 4-vessel Sampling Approach to Integrative Studies of Human Placental Physiology In Vivo

4-karet prøvetaking til integrative studier av human placental fysiologi<em&gt; In vivo</em

The human placenta is highly inaccessible for research while still in utero. The current understanding of human placental physiology in vivo is therefore ...

Combining Volumetric Capnography And Barometric Plethysmography To Measure The Lung Structure-function Relationship

Kombinere volumetriske Capnography og Barometrisk Plethysmography å måle lunge struktur-funksjon forholdet

Tools to measure lung and airways volume are critical for pulmonary researchers interested in evaluating the impact of disease or novel therapies on the ...

Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

Ex Vivo sårtilheling hornhinnen Organ kultur modell for studier

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

Quantitative Mapping of Specific Ventilation in the Human Lung using Proton Magnetic Resonance Imaging and Oxygen as a Contrast Agent

Kvantitativ kartlegging av spesifikk ventilasjon i Human Lung bruker Proton magnetisk resonans imaging og oksygen som kontrast agent

Specific ventilation imaging (SVI) is a functional magnetic resonance imaging technique capable of quantifying specific ventilation &#8213; the ratio of ...

Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts

Optocardiography og elektrofysiologi studier av ex vivo Langendorff-perfusert Hearts

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to ...

Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology

Murine Precision-Cut Leverskiver som en Ex Vivo-modell av leverbiologi

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic ...