Name: precision cut lung slices as an efficient tool for ex vivo pulmonary vessel structure and contractility studies
Uploaded: 2021-05-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Precision Cut Lung Slices as an Efficient Tool for Ex vivo Pulmonary Vessel Structure and Contractility Studies at JoVE.com

Os autores gostariam de agradecer aos Drs. Yuan Hao e Kaifeng Liu pelo apoio técnico. Este trabalho foi apoiado por um NIH 1R01 HL150106-01A1, a Parker B. Francis Fellowship, e o Prêmio de Pesquisa da Associação de Hipertensão Pulmonar Aldrighetti ao Dr. Ke Yuan.

Todos os cuidados com animais estavam de acordo com as diretrizes do Hospital Infantil de Boston e do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais aprovou protocolos. Os camundongos utilizados neste estudo são ratos do tipo selvagem C57/B6 e camundongos cruzados Cdh5-CreERT2 x Ai14 tdTomato.
1. Preparação de soluções
<ol><li>Prepare a solução tampão fosfato (1x PBS) e a solução de 2% de agarose necessária durante o experimento com antecedência.<ol>
<li>Misture 2 g de pó de...

<ol>
	<li>Sparrow, D., Weiss, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+physiology.">Respiratory physiology.</a> Annual Review of Gerontology &amp; Geriatrics. 6, 197-214 (1986).</li><li>Gerckens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+3D+lung+tissue+cultures+(3D-LTCs)+for+disease+modeling.">Generation of human 3D lung tissue cultures (3D-LTCs) for disease modeling.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), e58437 (2019).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preserving+airway+smooth+muscle+contraction+in+precision-cut+lung+slices.">Preserving airway smooth muscle contraction in precision-cut lung slices.</a> Scientific Reports. 10 (1), 6480 (2020).</li><li>Rosales Gerpe, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+precision-cut+lung+slices+as+an+ex+vivo+tool+for+evaluating+viruses+and+viral+vectors+for+gene+and+oncolytic+therapy.">Use of precision-cut lung slices as an ex vivo tool for evaluating viruses and viral vectors for gene and oncolytic therapy.</a> Molecular Therapy: Methods &amp; Clinical Development. 10, 245-256 (2018).</li><li>Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+lung+physiology+in+health+and+disease+with+lung+slices.">Exploring lung physiology in health and disease with lung slices.</a> Pulmonary Pharmacology &amp; Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).</li><li>Liu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+lung+slices:+An+ex+vivo+model+for+the+evaluation+of+antiviral+and+anti-inflammatory+agents+against+influenza+viruses.">Mouse lung slices: An ex vivo model for the evaluation of antiviral and anti-inflammatory agents against influenza viruses.</a> Antiviral Research. 120, 101-111 (2015).</li><li>de Graaf, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+incubation+of+precision-cut+liver+and+intestinal+slices+for+application+in+drug+metabolism+and+toxicity+studies.">Preparation and incubation of precision-cut liver and intestinal slices for application in drug metabolism and toxicity studies.</a> Nature Protocols. 5 (9), 1540-1551 (2010).</li><li>Alsafadi, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+and+approaches+for+three-dimensional+precision-cut+lung+slices.+Disease+modeling+and+drug+discovery.">Applications and approaches for three-dimensional precision-cut lung slices. Disease modeling and drug discovery.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 62 (6), 681-691 (2020).</li><li>Morin, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+cut+lung+slices+as+an+efficient+tool+for+in+vitro+lung+physio-pharmacotoxicology+studies.">Precision cut lung slices as an efficient tool for in vitro lung physio-pharmacotoxicology studies.</a> Xenobiotica. 43 (1), 63-72 (2013).</li><li>Springer, J., Fischer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substance+P-induced+pulmonary+vascular+remodelling+in+precision+cut+lung+slices.">Substance P-induced pulmonary vascular remodelling in precision cut lung slices.</a> The European Respiratory Journal. 22 (4), 596-601 (2003).</li><li>Suleiman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Argon+reduces+the+pulmonary+vascular+tone+in+rats+and+humans+by+GABA-receptor+activation.">Argon reduces the pulmonary vascular tone in rats and humans by GABA-receptor activation.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1902 (2019).</li><li>Rieg, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+agents+affect+the+tone+of+pulmonary+arteries+and+veins+in+precision-cut+lung+slices.">Cardiovascular agents affect the tone of pulmonary arteries and veins in precision-cut lung slices.</a> PLoS One. 6 (12), 29698 (2011).</li><li>Perez, J. F., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+frequency+of+calcium+oscillations+induced+by+5-HT,+ACH,+and+KCl+determine+the+contraction+of+smooth+muscle+cells+of+intrapulmonary+bronchioles.">The frequency of calcium oscillations induced by 5-HT, ACH, and KCl determine the contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary bronchioles.</a> The Journal of General Physiology. 125 (6), 535-553 (2005).</li><li>Deng, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+of+5-hydroxytryptamine+receptor+signaling+in+coronary+arteries+after+organ+culture.">Upregulation of 5-hydroxytryptamine receptor signaling in coronary arteries after organ culture.</a> PLoS One. 9 (9), 107128 (2014).</li><li>Sandker, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adventitial+dissection:+A+simple+and+effective+way+to+reduce+radial+artery+spasm+in+coronary+bypass+surgery.">Adventitial dissection: A simple and effective way to reduce radial artery spasm in coronary bypass surgery.</a> Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 17 (5), 784-789 (2013).</li><li>Naik, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pressure-induced+smooth+muscle+cell+depolarization+in+pulmonary+arteries+from+control+and+chronically+hypoxic+rats+does+not+cause+myogenic+vasoconstriction.">Pressure-induced smooth muscle cell depolarization in pulmonary arteries from control and chronically hypoxic rats does not cause myogenic vasoconstriction.</a> Journal of Applied Physiology. 98 (3), 1119-1124 (2005).</li><li>Lopez-Lopez, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+induces+pulmonary+artery+endothelial+dysfunction+by+NADPH+oxidase+induction.">Diabetes induces pulmonary artery endothelial dysfunction by NADPH oxidase induction.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (5), 727-732 (2008).</li><li>Gonzalez-Tajuelo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+pulmonary+hypertension+associated+with+systemic+sclerosis+in+P-selectin+glycoprotein+Ligand+1-deficient+mice.">Spontaneous pulmonary hypertension associated with systemic sclerosis in P-selectin glycoprotein Ligand 1-deficient mice.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 72 (3), 477-487 (2020).</li><li>Bai, Y., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+Ca2++sensitivity+of+airway+smooth+muscle+cells+in+murine+lung+slices.">Modulation of the Ca2+ sensitivity of airway smooth muscle cells in murine lung slices.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (2), 208-221 (2006).</li><li>Nishiyama, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+function+and+endothelin-1:+tipping+the+balance+between+vasodilation+and+vasoconstriction.">Vascular function and endothelin-1: tipping the balance between vasodilation and vasoconstriction.</a> Journal of Applied Physiology. 122 (2), 354-360 (2017).</li><li>Schneider, M. P., Inscho, E. W., Pollock, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuated+vasoconstrictor+responses+to+endothelin+in+afferent+arterioles+during+a+high-salt+diet.">Attenuated vasoconstrictor responses to endothelin in afferent arterioles during a high-salt diet.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 292 (4), 1208-1214 (2007).</li><li>Inscho, E. W., Imig, J. D., Cook, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Afferent+and+efferent+arteriolar+vasoconstriction+to+angiotensin+II+and+norepinephrine+involves+release+of+Ca2++from+intracellular+stores.">Afferent and efferent arteriolar vasoconstriction to angiotensin II and norepinephrine involves release of Ca2+ from intracellular stores.</a> Hypertension. 29, 222-227 (1997).</li><li>Vecchione, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+from+angiotensin+II-mediated+vasculotoxic+and+hypertensive+response+in+mice+lacking+PI3Kgamma.">Protection from angiotensin II-mediated vasculotoxic and hypertensive response in mice lacking PI3Kgamma.</a> The Journal of Experimental Medicine. 201 (8), 1217-1228 (2005).</li></ol>

Neste manuscrito, descreve-se um método aprimorado para produzir imagens de alta resolução do tecido pulmonar murino que preserva a estrutura vascular e otimiza a flexibilidade experimental, utilizando especificamente a aplicação do PCLS para obter microsapos de tecido pulmonar que podem ser visualizados em três dimensões com contrariedade preservada da vasculatura. Usando o reagente de viabilidade, o protocolo demonstra que fatias cuidadosamente preparadas e preservadas podem reter viabilidade por mais de uma sem...

Avanços na preparação e imagem do tecido pulmonar que preserva componentes celulares sem sacrificar a estrutura anatômica fornecem uma compreensão detalhada das doenças pulmonares. A capacidade de identificar proteínas, RNA e outros compostos biológicos, mantendo a estrutura fisiológica, oferece informações vitais sobre o arranjo espacial das células que podem ampliar a compreensão da fisiopatologia em inúmeras doenças pulmonares. Essas imagens detalhadas podem levar a uma melhor compreensão de doenças vasculares pulmonares, como a hipertensão arterial pulmonar, quando aplicadas a modelos animais, potencialmente levando a melhores estratégias terapêuticas.
Apesar dos avanços tecnológicos, a obtenção de imagens de alta qualidade do tecido pulmonar murino continua sendo um desafio. O ciclo respiratório é impulsionado por uma pressão intratorácica negativa gerada durante a inalação1. Ao tradicionalmente obter biópsias e preparar amostras pulmonares para imagem, o gradiente de pressão negativa é perdido resultando no colapso das vias aéreas e da vasculatura, que não se representa mais em seu estado atual. Para alcançar imagens realistas refletindo as condições atuais, as vias aéreas pulmonares devem ser reinfladas, e a vasculatura perfundida, transformando o pulmão dinâmico em uma luminária estática. A aplicação dessas técnicas distintas permite a preservação da integridade estrutural, vasculatura pulmonar e componentes celulares, incluindo células imunes, como macrófagos, permitindo que o tecido pulmonar seja visto o mais próximo possível de seu estado fisiológico.
O corte de precisão do corte pulmonar (PCLS) é uma ferramenta ideal para estudar a anatomia e a fisiologia da vasculatura pulmonar2. O PCLS fornece imagens detalhadas do tecido pulmonar em três dimensões, preservando componentes estruturais e celulares. O PCLS tem sido usado em modelos animais e humanos para permitir imagens vivas e de alta resolução de funções celulares em três dimensões, tornando-se uma ferramenta ideal para estudar potenciais alvos terapêuticos, medir a contração das pequenas vias aéreas e estudar a fisiopatologia de doenças pulmonares crônicas como DPOC, ILD e câncer de pulmão3. Utilizando técnicas semelhantes, a exposição de amostras de PCLS a vasoconstritores pode preservar a estrutura pulmonar e a contratilidade do vaso, replicando condições in vitro. Juntamente com a preservação da contratilidade, as amostras preparadas podem passar por análises adicionais, como sequenciamento de RNA, mancha ocidental e citometria de fluxo quando preparadas corretamente. Finalmente, as células rotuladas de cor repórter marcadas com fluorescência tdTomato após a colheita pulmonar podem preservar a rotulagem após o preparo de microslices, tornando-a ideal para estudos de rastreamento celular. A integração dessas técnicas proporciona um modelo sofisticado preservando o arranjo espacial das células e da contratude dos vasos que podem levar a uma compreensão mais detalhada das cascatas sinalizadoras e potenciais opções terapêuticas na doença da vasculatura pulmonar.
Neste manuscrito, o tecido pulmonar murino PCLS é exposto a vasoconstritores, demonstrando integridade estrutural preservada e contratlidade do vaso. O estudo demonstra que o tecido preparado e manuseado adequadamente pode permanecer viável por 10 dias. O estudo também demonstra a preservação de células com fluorescência endógena (tdTomato), permitindo que as amostras forneçam imagens de alta resolução da vasculatura pulmonar e da arquitetura. Finalmente, foram descritas formas de manusear e preparar fatias de tecido para a medição do RNA e da mancha ocidental para investigar mecanismos subjacentes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5cc of fractionated heparin in syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>100 USP units per mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 1/2 inch gauge blunt end needle for trachea cannulation</td>
			<td>Cml Supply</td>
			<td>90120050D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30cc syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Anti solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated vibrating blade microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Viability Reagent (alamarBlue)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>DAL1025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium and GLutaMAX, supplemented with 10% FBS, 1% Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelin-1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mortar and Pestle</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA lysis and extraction buffer</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>89900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical suture 6/0</td>
			<td>FST</td>
			<td>18020-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Invitrogen, Thermofisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Low Melting Point Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>VT1200 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Winged blood collection set (Butterfly needle) 25-30G</td>
			<td>BD</td>
			<td>25-30G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

precision cut lung slices as an efficient tool for ex vivo pulmonary vessel structure and contractility studies

A visualização do tecido pulmonar murino fornece informações estruturais e celulares valiosas sobre as vias aéreas subjacentes e a vasculatura. No entanto, a preservação de vasos pulmonares que realmente representam condições fisiológicas ainda apresenta desafios. Além disso, a delicada configuração dos pulmões murinos resulta em desafios técnicos na preparação de amostras para imagens de alta qualidade que preservam tanto a composição celular quanto a arquitetura. Da mesma forma, ensaios de contrailidade celular podem ser realizados para estudar o potencial das células para responder aos vasoconstritores in vitro,mas esses ensaios não reproduzem o ambiente complexo do pulmão intacto. Em contraste com essas questões técnicas, o método de corte de precisão da fatia pulmonar (PCLS) pode ser aplicado como uma alternativa eficiente para visualizar o tecido pulmonar em três dimensões sem viés regional e servir como um modelo de contração de substituto vivo por até 10 dias. Tecido preparado com PCLS tem estrutura preservada e orientação espacial, tornando-se ideal para estudar processos de doença ex vivo. A localização de células etiquetadas tdTomato endógenas em PCLS colhidas a partir de um modelo de murina tdTomato indutível pode ser visualizada com sucesso por microscopia confocal. Após a exposição aos vasoconstritores, o PCLS demonstra a preservação tanto da contração do vaso quanto da estrutura pulmonar, que pode ser capturada por um módulo de lapso de tempo. Em combinação com os outros procedimentos, como a análise da mancha ocidental e do RNA, o PCLS pode contribuir para a compreensão abrangente das cascatas sinalizadoras que sustentam uma ampla variedade de distúrbios e levam a uma melhor compreensão da fisiopatologia em doenças vasculares pulmonares.

Quando adicionado às células ou tecidos, o reagente de viabilidade é modificado pelo ambiente redutor do tecido viável e fica rosa/vermelho, tornando-se altamente fluorescente. As alterações de cor representativas detectadas a partir do dia 0-1 e do dia 9-10 são demonstradas na Figura 3. Como observado, a solução começou azul e ficou rosa da noite para o dia, demonstrando viabilidade. A mudança de cor normalmente ocorre dentro de 1-4 h; no entanto, um tempo maior pode ser necessá...

Watch this Scientific Journal Video about Precision Cut Lung Slices as an Efficient Tool for Ex vivo Pulmonary Vessel Structure and Contractility Studies at JoVE.com

Precision Cut Lung Slices as an Efficient Tool for Ex vivo Pulmonary Vessel Structure and Contractility Studies

Apresentado aqui é um protocolo para preservar a contração vascular do tecido pulmonar murino PCLS, resultando em uma imagem tridimensional sofisticada da vasculatura pulmonar e das vias aéreas, que pode ser preservada por até 10 dias suscetíveis a inúmeros procedimentos.

Corte de precisão Fatias pulmonares como uma ferramenta eficiente para ex vivo estrutura de vasos pulmonares e estudos de contratibilidade

The visualization of murine lung tissue provides valuable structural and cellular information regarding the underlying airway and vasculature. However, ...

O método de corte de precisão das fatias pulmonares preservará a estrutura e as orientações espaciais em três dimensões sem viés regional e poderá servir como um modelo de substituto vivo para as medidas de contração de vasos e vias aéreas. Em combinação com imagens de lapso de tempo, bolha ocidental e análise de RNA, as fatias pulmonares cortadas com precisão contribuem para a compreensão abrangente das cascatas sinalizadoras que sustentam uma grande variedade de distúrbios e levam a uma melhor compreensão da fisiopatologia em doenças vasculares pulmonares. Para começar, coloque o rato adulto eutanizado em uma posição supina e fixe-o no lugar, gravando as patas e o nariz na mesa com fita adesiva.Pulverize a superfície ventral do mouse com 70% de etanol. Use fórceps para levantar a pele abdominal do camundongo na localização da bexiga e tesoura cirúrgica para cortar na linha média, movendo-se superiormente para a região cervical para expor a traqueia. Em seguida, use pinças para levantar a camada de fáscia subjacente e usar tesoura cirúrgica para expor os órgãos viscerais e compartimento mediastinal, novamente cortando inferiormente para superior.Corte o esterno no meio da linha para expor o coração e o pulmão. Disseca o diafragma cuidadosamente do fígado e do compartimento abdominal. Localize a veia cava inferior sob os intestinos e corte-a.Depois de localizar o ventrículo direito, use uma agulha borboleta de 25 a 30 para injetar 0,5 mililitros de heparina fracionada de 1% no ventrículo direito e lavá-lo lentamente, mas de forma constante, com 10 a 15 milímetros de PBS. Depois de localizar a laringe, use pinças de ponta sem corte para dissecar a fáscia e tecido circundante, em seguida, coloque a sutura cirúrgica sob a traqueia e amarre livremente um nó cirúrgico. Coloque um pequeno orifício na traqueia superior à corda e cannulate com uma agulha de ponta sem corte de 20 bitolas.Aperte a sutura ao redor da agulha e da traqueia usando um nó cirúrgico. Em seguida, injete de 2,5 a 4 mililitros de agarose na traqueia e monitore a inflação do pulmão. Após a injeção de agarose, despeje pbs frio sobre o pulmão para solidificar a agarose.Em seguida, corte a traqueia superior à sutura cirúrgica e disseque o pulmão e o coração do mediastino removendo quaisquer aderências e fáscia. Após a solidificação, coloque o tecido em DMEM em uma placa de Petri no gelo, e imediatamente prossiga para cortar um lobo usando uma máquina de vibratome. Para preparar as fatias pulmonares, conecte a amostra à plataforma com supercola, mantendo o lado medial voltado para cima.Em seguida, encha o recipiente de amostra com PBS. Encha o recipiente com gelo para manter o PBS circundante e prove frio. Ligue o vibratome.Ajuste a espessura para 300 micrômetros, frequência de 100 Hertz, amplitude para 0,6 milímetros e velocidade para cinco micrômetros por segundo. Usando uma chave Allen, gire o suporte da lâmina na posição segura e abra as mandíbulas para inserir uma lâmina. Em seguida, aperte as mandíbulas com uma chave allen.Coloque a amostra sobre a caixa, garantindo que ela esteja submersa em PBS. Deslize a caixa para cima na posição correta e certifique-se de que está segura. Gire o suporte da lâmina na posição apropriada para cortar.Leve a lâmina vibratome até a borda do bloco e baixe manualmente a lâmina até que esteja mesmo com a parte superior da amostra. Confirme as configurações e execute o vibratome. Depois que as fatias frescas forem cortadas, remova as amostras do PBS e coloque-as em uma placa de Petri estéril com 10 mililitros de DMEM contendo antibiótico antimíctico único.Depois de colocar todas as fatias em uma placa de Petri, retraia a lâmina inteiramente e use a chave Allen para levantar a lâmina em uma posição segura. Armazene as amostras em DMEM a 37 graus Celsius. E coloque uma fatia de vibratome em um slide de microscópio.Use uma limpeza para remover o excesso de meio. Coloque a amostra na microscopia de contraste de fase e use ampliação de 10 a 20X para identificar um vaso. Em seguida, adicione 500 microliters de vasoconstritores, como 60 milimolars de cloreto de potássio ou uma endotelina micromolar-1 para submergir completamente o slide.Observe e capture o vídeo gravando por 30 a 60 segundos. Antes de começar o experimento, encha uma pequena caixa de espuma de poliestireno com um litro de nitrogênio líquido e coloque dois tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro no recipiente com nitrogênio líquido. Coloque de quatro a cinco fatias frescas de vibratome em uma tigela de argamassa.Despeje de 5 a 10 mililitros de nitrogênio líquido em cima das fatias e use rapidamente o pilão para moer as fatias em pó antes que o nitrogênio líquido evapora. Use um scooper de laboratório de aço pré-refrigerado para colher o pó nos dois tubos de microcentrifuuge refrigerados e lise o pó adicionando 500 microliters de reagente de extração de RNA para isolamento de RNA ou 500 microliters de tampão RIPA para lise proteica. No experimento de viabilidade representativa, a mudança de cor das fatias do PCLS foi detectada do dia zero ao um e do dia 9 a 10.A solução foi inicialmente azul e ficou rosa da noite para o dia, demonstrando viabilidade. A mudança de cor normalmente ocorreu dentro de uma a quatro horas, mas um tempo maior pode ser necessário. A diferença diária entre a absorvância em 562 e 613 comprimentos de onda nanômetros para o tecido preparado por vibratome é mostrada aqui.A constrição da vasculatura em um tecido pulmonar preparado por vibratome usando endotelina-1 e cloreto de potássio pode ser visualizada aqui. A preservação da rotulagem tdTomato nas células uma semana após a injeção de tamoxifeno é demonstrada nessas fatias pulmonares. É mais importante realizar a limpeza pulmonar e a inflação passo bem para remover todo o sangue de circulação antes de experimentos adicionais e imagens.Além das doenças vasculares, o PCLS pode ser aplicado para estudar fisiobiologia de doenças relacionadas às vias aéreas, podendo ser testado em tecidos pulmonares humanos em cenários clinicamente relevantes.

Research

JoVE Journal

Medicine

Precision Cut Lung Slices as an Efficient Tool for Ex vivo Pulmonary Vessel Structure and Contractility Studies

Videomorphometric Analysis of Hypoxic Pulmonary Vasoconstriction of Intra-pulmonary Arteries Using Murine Precision Cut Lung Slices

Análise videomorfométrica da vasoconstrição pulmonar hipoxica de artérias intra-pulmonares usando fatias pulmonares cortadas por precisão de murina

Acute alveolar hypoxia causes pulmonary vasoconstriction (HPV) - also known as von Euler-Liljestrand mechanism - which serves to match lung perfusion to ...

Medicina

Fundus Photography as a Convenient Tool to Study Microvascular Responses to Cardiovascular Disease Risk Factors in Epidemiological Studies

Retinografia colorida como uma ferramenta conveniente para estudar as respostas microvasculares a doenças cardiovasculares Fatores de Risco em estudos epidemiológicos

The microcirculation consists of blood vessels with diameters less than 150 &#181;m. It makes up a large part of the circulatory system and plays an ...

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

Método de Isolado<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Perfusão pulmonar em um modelo de rato: Lições aprendidas com o desenvolvimento de um Programa PPEV Rat

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed ...

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

Ex vivo de imagens ao vivo de pulmão Metástase e seu microambiente

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular ...

The 4-vessel Sampling Approach to Integrative Studies of Human Placental Physiology In Vivo

The 4-vessel Sampling Approach to Integrative Studies of Human Placental Physiology In Vivo

A abordagem de amostragem de 4 embarcações para estudos integrativos de fisiologia placentária humana<em&gt; In Vivo</em

The human placenta is highly inaccessible for research while still in utero. The current understanding of human placental physiology in vivo is therefore ...

Combining Volumetric Capnography And Barometric Plethysmography To Measure The Lung Structure-function Relationship

Combinando a capnografia volumétrica e pletismografia barométrica para medir a relação estrutura-função do pulmão

Tools to measure lung and airways volume are critical for pulmonary researchers interested in evaluating the impact of disease or novel therapies on the ...

Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

Ex Vivo modelo de cultura órgão da córnea para cicatrização de feridas estudos

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

Quantitative Mapping of Specific Ventilation in the Human Lung using Proton Magnetic Resonance Imaging and Oxygen as a Contrast Agent

Mapeamento quantitativo de ventilação específica no pulmão humano usando ressonância magnética de prótons e oxigênio como agente de contraste

Specific ventilation imaging (SVI) is a functional magnetic resonance imaging technique capable of quantifying specific ventilation &#8213; the ratio of ...

Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts

Estudos de Optocardiografia e Eletrofisiologia de Ex Vivo Langendorff-perfundido Corações

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to ...

Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology

Murine Precision-Cut Liver Slices como um modelo ex vivo de biologia hepática

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic ...