Name: precision cut lung slices as an efficient tool for ex vivo pulmonary vessel structure and contractility studies
Uploaded: 2021-05-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Precision Cut Lung Slices as an Efficient Tool for Ex vivo Pulmonary Vessel Structure and Contractility Studies at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить докторов Юань Хао и Кайфэн Лю за их техническую поддержку. Эта работа была поддержана NIH 1R01 HL150106-01A1, стипендией Паркера Б. Фрэнсиса и премией Ассоциации исследований легочной гипертензии Aldrighetti для доктора Ке Юаня.

Весь уход за животными соответствовал руководящим принципам Бостонской детской больницы и утвержденным Комитетом по институциональным уходу и использованию животных протоколов. Мыши, используемые в этом исследовании, являются дикими мышами типа C57 / B6 и скрещенными мышами Cdh5-CreERT2 x Ai14 ...

<ol>
	<li>Sparrow, D., Weiss, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+physiology.">Respiratory physiology.</a> Annual Review of Gerontology &amp; Geriatrics. 6, 197-214 (1986).</li><li>Gerckens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+3D+lung+tissue+cultures+(3D-LTCs)+for+disease+modeling.">Generation of human 3D lung tissue cultures (3D-LTCs) for disease modeling.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), e58437 (2019).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preserving+airway+smooth+muscle+contraction+in+precision-cut+lung+slices.">Preserving airway smooth muscle contraction in precision-cut lung slices.</a> Scientific Reports. 10 (1), 6480 (2020).</li><li>Rosales Gerpe, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+precision-cut+lung+slices+as+an+ex+vivo+tool+for+evaluating+viruses+and+viral+vectors+for+gene+and+oncolytic+therapy.">Use of precision-cut lung slices as an ex vivo tool for evaluating viruses and viral vectors for gene and oncolytic therapy.</a> Molecular Therapy: Methods &amp; Clinical Development. 10, 245-256 (2018).</li><li>Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+lung+physiology+in+health+and+disease+with+lung+slices.">Exploring lung physiology in health and disease with lung slices.</a> Pulmonary Pharmacology &amp; Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).</li><li>Liu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+lung+slices:+An+ex+vivo+model+for+the+evaluation+of+antiviral+and+anti-inflammatory+agents+against+influenza+viruses.">Mouse lung slices: An ex vivo model for the evaluation of antiviral and anti-inflammatory agents against influenza viruses.</a> Antiviral Research. 120, 101-111 (2015).</li><li>de Graaf, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+incubation+of+precision-cut+liver+and+intestinal+slices+for+application+in+drug+metabolism+and+toxicity+studies.">Preparation and incubation of precision-cut liver and intestinal slices for application in drug metabolism and toxicity studies.</a> Nature Protocols. 5 (9), 1540-1551 (2010).</li><li>Alsafadi, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+and+approaches+for+three-dimensional+precision-cut+lung+slices.+Disease+modeling+and+drug+discovery.">Applications and approaches for three-dimensional precision-cut lung slices. Disease modeling and drug discovery.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 62 (6), 681-691 (2020).</li><li>Morin, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+cut+lung+slices+as+an+efficient+tool+for+in+vitro+lung+physio-pharmacotoxicology+studies.">Precision cut lung slices as an efficient tool for in vitro lung physio-pharmacotoxicology studies.</a> Xenobiotica. 43 (1), 63-72 (2013).</li><li>Springer, J., Fischer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substance+P-induced+pulmonary+vascular+remodelling+in+precision+cut+lung+slices.">Substance P-induced pulmonary vascular remodelling in precision cut lung slices.</a> The European Respiratory Journal. 22 (4), 596-601 (2003).</li><li>Suleiman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Argon+reduces+the+pulmonary+vascular+tone+in+rats+and+humans+by+GABA-receptor+activation.">Argon reduces the pulmonary vascular tone in rats and humans by GABA-receptor activation.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1902 (2019).</li><li>Rieg, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+agents+affect+the+tone+of+pulmonary+arteries+and+veins+in+precision-cut+lung+slices.">Cardiovascular agents affect the tone of pulmonary arteries and veins in precision-cut lung slices.</a> PLoS One. 6 (12), 29698 (2011).</li><li>Perez, J. F., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+frequency+of+calcium+oscillations+induced+by+5-HT,+ACH,+and+KCl+determine+the+contraction+of+smooth+muscle+cells+of+intrapulmonary+bronchioles.">The frequency of calcium oscillations induced by 5-HT, ACH, and KCl determine the contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary bronchioles.</a> The Journal of General Physiology. 125 (6), 535-553 (2005).</li><li>Deng, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+of+5-hydroxytryptamine+receptor+signaling+in+coronary+arteries+after+organ+culture.">Upregulation of 5-hydroxytryptamine receptor signaling in coronary arteries after organ culture.</a> PLoS One. 9 (9), 107128 (2014).</li><li>Sandker, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adventitial+dissection:+A+simple+and+effective+way+to+reduce+radial+artery+spasm+in+coronary+bypass+surgery.">Adventitial dissection: A simple and effective way to reduce radial artery spasm in coronary bypass surgery.</a> Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 17 (5), 784-789 (2013).</li><li>Naik, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pressure-induced+smooth+muscle+cell+depolarization+in+pulmonary+arteries+from+control+and+chronically+hypoxic+rats+does+not+cause+myogenic+vasoconstriction.">Pressure-induced smooth muscle cell depolarization in pulmonary arteries from control and chronically hypoxic rats does not cause myogenic vasoconstriction.</a> Journal of Applied Physiology. 98 (3), 1119-1124 (2005).</li><li>Lopez-Lopez, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+induces+pulmonary+artery+endothelial+dysfunction+by+NADPH+oxidase+induction.">Diabetes induces pulmonary artery endothelial dysfunction by NADPH oxidase induction.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (5), 727-732 (2008).</li><li>Gonzalez-Tajuelo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+pulmonary+hypertension+associated+with+systemic+sclerosis+in+P-selectin+glycoprotein+Ligand+1-deficient+mice.">Spontaneous pulmonary hypertension associated with systemic sclerosis in P-selectin glycoprotein Ligand 1-deficient mice.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 72 (3), 477-487 (2020).</li><li>Bai, Y., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+Ca2++sensitivity+of+airway+smooth+muscle+cells+in+murine+lung+slices.">Modulation of the Ca2+ sensitivity of airway smooth muscle cells in murine lung slices.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (2), 208-221 (2006).</li><li>Nishiyama, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+function+and+endothelin-1:+tipping+the+balance+between+vasodilation+and+vasoconstriction.">Vascular function and endothelin-1: tipping the balance between vasodilation and vasoconstriction.</a> Journal of Applied Physiology. 122 (2), 354-360 (2017).</li><li>Schneider, M. P., Inscho, E. W., Pollock, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuated+vasoconstrictor+responses+to+endothelin+in+afferent+arterioles+during+a+high-salt+diet.">Attenuated vasoconstrictor responses to endothelin in afferent arterioles during a high-salt diet.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 292 (4), 1208-1214 (2007).</li><li>Inscho, E. W., Imig, J. D., Cook, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Afferent+and+efferent+arteriolar+vasoconstriction+to+angiotensin+II+and+norepinephrine+involves+release+of+Ca2++from+intracellular+stores.">Afferent and efferent arteriolar vasoconstriction to angiotensin II and norepinephrine involves release of Ca2+ from intracellular stores.</a> Hypertension. 29, 222-227 (1997).</li><li>Vecchione, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+from+angiotensin+II-mediated+vasculotoxic+and+hypertensive+response+in+mice+lacking+PI3Kgamma.">Protection from angiotensin II-mediated vasculotoxic and hypertensive response in mice lacking PI3Kgamma.</a> The Journal of Experimental Medicine. 201 (8), 1217-1228 (2005).</li></ol>

В этой рукописи описан усовершенствованный метод получения изображений легочной ткани мыса с высоким разрешением, который сохраняет сосудистую структуру и оптимизирует экспериментальную гибкость, в частности с использованием применения PCLS для получения микросрезов легочной ткани, ...

Достижения в области подготовки и визуализации легочной ткани, которая сохраняет клеточные компоненты без ущерба для анатомической структуры, обеспечивают подробное понимание легочных заболеваний. Способность идентифицировать белки, РНК и другие биологические соединения при сохранении физиологической структуры предлагает жизненно важную информацию о пространственном расположении клеток, которая может расширить понимание патофизиологии при многочисленных легочных заболеваниях. Эти подробные изображения могут привести к лучшему пониманию заболеваний легочных сосудов, таких как гипертония легочной артерии, при применении к животным моделям, что потенциально приводит к улучшению терапевтических стратегий.
Несмотря на достижения в области технологий, получение высококачественных изображений мышиной легочной ткани остается проблемой. Дыхательный цикл обусловлен отрицательным внутриторакальным давлением, создаваемым при вдохе1. При традиционном получении биопсии и подготовке образцов легких к визуализации теряется отрицательный градиент давления, что приводит к коллапсу дыхательных путей и сосудистой среды, которая больше не проявляет себя в своем нынешнем состоянии. Для достижения реалистичных изображений, отражающих текущие условия, легочные дыхательные пути должны быть повторно надуты, а сосудистая система перфузирована, превращая динамическое легкое в статическую арматуру. Применение этих различных методов позволяет сохранить структурную целостность, легочную сосудистую систему и клеточные компоненты, включая иммунные клетки, такие как макрофаги, что позволяет рассматривать легочную ткань как можно ближе к ее физиологическому состоянию.
Прецизионная разрезанная нарезка легких (PCLS) является идеальным инструментом для изучения анатомии и физиологии легочной сосудистой жидкости2. PCLS обеспечивает детальную визуализацию легочной ткани в трех измерениях с сохранением структурных и клеточных компонентов. PCLS был использован в моделях животных и человека, чтобы обеспечить живые изображения клеточных функций с высоким разрешением в трех измерениях, что делает его идеальным инструментом для изучения потенциальных терапевтических целей, измерения небольшого сокращения дыхательных путей и изучения патофизиологии хронических заболеваний легких, таких как ХОБЛ, ILD и рак легких3. Используя аналогичные методы, воздействие образцов PCLS на сосудосуживающих средств может сохранить структуру легких и сократимость сосудов, воспроизводя условия in vitro. Наряду с сохранением сократимости, подготовленные образцы могут подвергаться дополнительному анализу, такому как секвенирование РНК, вестерн-блот и проточная цитометрия при правильном приготовлении. Наконец, клетки с маркировкой репортерного цвета, отмеченные флуоресценцией tdTomato после сбора урожая в легких, могут сохранять маркировку после подготовки микросрезов, что делает ее идеальной для исследований отслеживания клеток. Интеграция этих методов обеспечивает сложную модель, сохраняющую пространственное расположение клеток и сократимость сосудов, что может привести к более детальному пониманию сигнальных каскадов и потенциальных терапевтических вариантов при заболевании легочной сосудистой системы.
В этой рукописи ткань легких мыса PCLS подвергается воздействию сосудосуживающих средств, демонстрируя сохраненную структурную целостность и сократимость сосудов. Исследование показывает, что ткань, подготовленная и обработанная надлежащим образом, может оставаться жизнеспособной в течение 10 дней. Исследование также демонстрирует сохранение клеток с эндогенной флуоресценцией (tdTomato), что позволяет образцам предоставлять изображения с высоким разрешением легочной сосудистой области и архитектуры. Наконец, были описаны способы обработки и подготовки срезов тканей для измерения РНК и вестерн-блотта для исследования основных механизмов.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5cc of fractionated heparin in syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>100 USP units per mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 1/2 inch gauge blunt end needle for trachea cannulation</td>
			<td>Cml Supply</td>
			<td>90120050D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30cc syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Anti solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated vibrating blade microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Viability Reagent (alamarBlue)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>DAL1025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium and GLutaMAX, supplemented with 10% FBS, 1% Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelin-1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mortar and Pestle</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA lysis and extraction buffer</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>89900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical suture 6/0</td>
			<td>FST</td>
			<td>18020-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Invitrogen, Thermofisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Low Melting Point Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>VT1200 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Winged blood collection set (Butterfly needle) 25-30G</td>
			<td>BD</td>
			<td>25-30G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

precision cut lung slices as an efficient tool for ex vivo pulmonary vessel structure and contractility studies

Визуализация мышиной легочной ткани предоставляет ценную структурную и клеточную информацию о нижележащих дыхательных путях и сосудистой сети. Тем не менее, сохранение легочных сосудов, которые действительно представляют физиологические условия, по-прежнему представляет проблемы. Кроме того, деликатная конфигурация мышиных легких приводит к техническим проблемам при подготовке образцов для высококачественных изображений, которые сохраняют как клеточный состав, так и архитектуру. Аналогичным образом, анализы клеточной сократимости могут быть выполнены для изучения потенциала клеток реагировать на сосудосуживатели in vitro,но эти анализы не воспроизводят сложную среду неповрежденного легкого. В отличие от этих технических проблем, метод прецизионного разреза легочного среза (PCLS) может применяться в качестве эффективной альтернативы для визуализации легочной ткани в трех измерениях без регионального смещения и служить живой суррогатной моделью сократимости на срок до 10 дней. Ткань, приготовленная с использованием PCLS, имеет сохраненную структуру и пространственную ориентацию, что делает ее идеальной для изучения болезненных процессов ex vivo. Расположение эндогенных tdTomato-меченых клеток в PCLS, собранных из индуцируемой tdTomato репортерной мышиной модели, может быть успешно визуализировано с помощью конфокальной микроскопии. После воздействия сосудосуживающих средств PCLS демонстрирует сохранение как сократимости сосудов, так и структуры легких, которые могут быть захвачены модулем замедленной съемки. В сочетании с другими процедурами, такими как вестерн-блот и анализ РНК, PCLS может способствовать всестороннему пониманию сигнальных каскадов, которые лежат в основе широкого спектра расстройств и приводят к лучшему пониманию патофизиологии при заболеваниях легочных сосудов.

При добавлении к клеткам или тканям реагент жизнеспособности модифицируется восстанавливающей средой жизнеспособной ткани и становится розовым / красным, становясь высокофлуоресцентным. Репрезентативные изменения цвета, обнаруженные с 0-1 и 9-10 дня, демонстрируются на рису...

Watch this Scientific Journal Video about Precision Cut Lung Slices as an Efficient Tool for Ex vivo Pulmonary Vessel Structure and Contractility Studies at JoVE.com

Precision Cut Lung Slices as an Efficient Tool for Ex vivo Pulmonary Vessel Structure and Contractility Studies

Здесь представлен протокол сохранения сосудистой сократимости ткани легких мышей PCLS, в результате чего получается сложное трехмерное изображение легочной сосудистой системы и дыхательных путей, которое может сохраняться до 10 дней, подверженных многочисленным процедурам.

Прецизионная резка легких срезов как эффективный инструмент для исследования структуры и сократимости легочных сосудов Ex vivo

The visualization of murine lung tissue provides valuable structural and cellular information regarding the underlying airway and vasculature. However, ...

Метод прецизионного разрезания легких позволит сохранить структуру и пространственную ориентацию в трех измерениях без регионального смещения и может служить живой суррогатной моделью для измерений сократимости сосудов и дыхательных путей. В сочетании с покадровой визуализацией, вестерн-блоттом и анализом РНК, прецизионные разрезанные срезы легких способствуют всестороннему пониманию сигнальных каскадов, которые лежат в основе широкого спектра расстройств и приводят к лучшему пониманию патофизиологии при заболеваниях легочных сосудов. Для начала поместите усыпленную взрослую мышь в лежачее положение и закрепите ее на месте, приклеив лапы и нос к столу скотчем.Опрыскиваем брюшную поверхность мыши 70% этанолом. Используйте щипцы, чтобы поднять брюшную кожу мыши в месте расположения мочевого пузыря и хирургические ножницы, чтобы разрезать по средней линии, двигаясь выше шейного отдела, чтобы обнажить трахею. Затем используйте пинцет, чтобы поднять подстилающей слой фасции и используйте хирургические ножницы, чтобы обнажить висцеральные органы и медиастинальный отсек, снова разрезая ниже верхнего.Отрежьте грудину по средней линии, чтобы обнажить сердце и легкие. Тщательно рассекает диафрагму от печени и брюшного отсека. Расположить нижнюю полую вену под кишечником и разрезать ее.После обнаружения правого желудочка используйте иглу бабочки 25-30 калибра, чтобы ввести 0,5 миллилитра 1% фракционированного гепарина в правый желудочек и медленно, но неуклонно промывать его от 10 до 15 миллиметров PBS. После обнаружения гортани используйте тупой пинцет для рассечения окружающей фасции и ткани, затем поместите хирургический шов под трахею и свободно завяжите хирургический узел. Поместите небольшое отверстие в трахее выше струны и канюль с помощью тупой иглы 20 калибра.Затяните шов вокруг иглы и трахеи с помощью хирургического узла. Затем вводят от 2,5 до 4 миллилитров агарозы в трахею и контролируют инфляцию легких. После инъекции агарозы вылейте холодный PBS на легкое, чтобы затвердеть агарозу.Затем разрезают трахею, превосходящую хирургический шов, и рассекли легкие и сердце от средостения путем удаления любых спаек и фасций. После затвердевания поместите ткань в DMEM в чашку Петри на льду и сразу же приступайте к нарезке одной доли с помощью вибратомной машины. Чтобы подготовить легкие ломтики, прикрепите образец к платформе с помощью суперклея, держа медиальную сторону лицом вверх.Затем заполните контейнер для образцов PBS. Наполните контейнер льдом, чтобы сохранить окружающий PBS и образец холодным. Включите вибратом.Отрегулируйте толщину до 300 микрометров, частоту до 100 Гц, амплитуду до 0,6 миллиметра и скорость до пяти микрометров в секунду. Используя гаечный ключ Allen, поверните держатель лезвия в безопасное положение и откройте челюсти, чтобы вставить лезвие. Затем затяните челюсти гаечным ключом Аллена.Поместите образец на коробку, убедив, что он погружен в PBS. Сдвиньте коробку вверх в правильном положении и убедитесь, что она надежно закреплена. Поверните держатель лезвия в соответствующее положение для нарезки.Поднесите лезвие вибратома к краю блока и вручную опустите лезвие до тех пор, пока оно не сравняется с верхней частью образца. Подтвердите настройки и запустите вибратом. После того, как свежие ломтики нарезаны, извлеките образцы из PBS и поместите их в стерильную чашку Петри с 10 миллилитрами DMEM, содержащими одноразовый антимикотический антибиотик.Поместив все ломтики в чашку Петри, полностью втяните лезвие и используйте гаечный ключ Аллена, чтобы поднять лезвие в безопасное положение. Храните образцы в DMEM при 37 градусах Цельсия. И поместите срез вибратома на слайд микроскопа.Используйте чистящую салфетку, чтобы удалить лишнюю среду. Поместите образец на фазовую контрастную микроскопию и используйте увеличение от 10 до 20X для идентификации сосуда. Затем добавьте 500 микролитров сосудосуживающих средств, таких как 60 миллимоляров хлорида калия или один микромолярный эндотелин-1, чтобы полностью погрузить слайд.Наблюдайте и захватывайте видео, записывая в течение 30-60 секунд. Перед началом эксперимента заполните небольшую коробку из пенополистирола одним литром жидкого азота и поместите в емкость с жидким азотом две 1,5-миллилитровые микроцентрифужные трубки. Поместите четыре-пять свежих ломтиков вибратома в миску для раствора.Налейте от 5 до 10 миллилитров жидкого азота поверх ломтиков и быстро используйте пестик, чтобы измельчить ломтики в порошок до того, как жидкий азот испарится. Используйте предварительно охлажденный стальной лабораторный совок, чтобы зачерпнуть порошок в две охлажденные микроцентрифужные трубки и лизировать порошок, добавив 500 микролитров реагента экстракции РНК для выделения РНК или 500 микролитров буфера RIPA для лизиса белка. В репрезентативном эксперименте по жизнеспособности изменение цвета срезов PCLS было обнаружено с нулевого дня до одного и с девятого по 10-й день.Раствор изначально был синим и стал розовым за ночь, демонстрируя жизнеспособность. Изменение цвета обычно происходило в течение одного-четырех часов, но может потребоваться более длительное время. Суточная разница между поглощением на длинах волн 562 и 613 нанометров для ткани, подготовленной вибратомом, показана здесь.Здесь можно визуализировать сужение сосудистой системы в вибратомной легочной ткани с использованием эндотелина-1 и хлорида калия. Сохранение маркировки tdTomato в клетках через неделю после инъекции тамоксифена демонстрируется в этих срезах легких. Наиболее важно хорошо выполнить очистку легких и этап инфляции, чтобы удалить всю кровь из кровообращения перед дополнительными экспериментами и визуализацией.В дополнение к сосудистым заболеваниям, PCLS может применяться для изучения физиобиологии заболеваний, связанных с дыхательными путями, и может быть дополнительно протестирован на легочных тканях человека в клинически значимых сценариях.

Research

JoVE Journal

Medicine

Precision Cut Lung Slices as an Efficient Tool for Ex vivo Pulmonary Vessel Structure and Contractility Studies

Videomorphometric Analysis of Hypoxic Pulmonary Vasoconstriction of Intra-pulmonary Arteries Using Murine Precision Cut Lung Slices

Видеоморфометрический анализ гипоксической легочной сосудоборства внутриположных артерий с использованием Murine Precision Cut Lung Slices

Acute alveolar hypoxia causes pulmonary vasoconstriction (HPV) - also known as von Euler-Liljestrand mechanism - which serves to match lung perfusion to ...

Fundus Photography as a Convenient Tool to Study Microvascular Responses to Cardiovascular Disease Risk Factors in Epidemiological Studies

Fundus фотография как удобный инструмент для изучения микрососудистых Ответы на сердечно-сосудистые заболевания Факторы риска в эпидемиологических исследованиях

The microcirculation consists of blood vessels with diameters less than 150 &#181;m. It makes up a large part of the circulatory system and plays an ...

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

Метод Изолированные<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Легких перфузии в крысиной модели: уроки, извлеченные из Разработка EVLP программы Rat

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed ...

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

Экс Vivo Живая съемка Метастазы в легких и их микроокружения

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular ...

The 4-vessel Sampling Approach to Integrative Studies of Human Placental Physiology In Vivo

The 4-vessel Sampling Approach to Integrative Studies of Human Placental Physiology In Vivo

Подход к выборке с четырьмя сосудами для интегративных исследований физиологии плаценты человека<em&gt; В Виво</em

The human placenta is highly inaccessible for research while still in utero. The current understanding of human placental physiology in vivo is therefore ...

Combining Volumetric Capnography And Barometric Plethysmography To Measure The Lung Structure-function Relationship

Сочетание объемного Capnography и барометрический плетизмографии для измерения связи структура функция легких

Tools to measure lung and airways volume are critical for pulmonary researchers interested in evaluating the impact of disease or novel therapies on the ...

Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

Ex Vivo роговицы орган культуры модель для заживления ран исследований

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

Quantitative Mapping of Specific Ventilation in the Human Lung using Proton Magnetic Resonance Imaging and Oxygen as a Contrast Agent

Количественное картирование специфической вентиляции легких человека с использованием протонного магнитно-резонансной томографии и кислорода в качестве контрастного агента

Specific ventilation imaging (SVI) is a functional magnetic resonance imaging technique capable of quantifying specific ventilation &#8213; the ratio of ...

Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts

Оптокардиография и электрофизиология Исследования Ex Vivo Langendorff-перфизиозных сердец

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to ...

Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology

Murine Точность Cut печени фрагменты, как Ex Vivo Модель печени биологии

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic ...