Name: precision cut lung slices as an efficient tool for ex vivo pulmonary vessel structure and contractility studies
Uploaded: 2021-05-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Precision Cut Lung Slices as an Efficient Tool for Ex vivo Pulmonary Vessel Structure and Contractility Studies at JoVE.com

Författarna vill tacka Drs. Yuan Hao och Kaifeng Liu för deras tekniska support. Detta arbete stöddes av en NIH 1R01 HL150106-01A1, Parker B. Francis Fellowship och Pulmonary Hypertension Association Aldrighetti Research Award till Dr. Ke Yuan.

All djurvård var i enlighet med riktlinjerna från Boston Children's Hospital och Institutional Animal Care and Use Committee godkända protokoll. Mössen som används i denna studie är vilda typ C57/B6 möss och Cdh5-CreERT2 x Ai14 tdTomato korsade möss.
1. Utarbetande av lösningar
<ol><li>Förbered fosfatbuffertlösning (1x PBS) och 2% agaroslösning som krävs under försöket i förväg.<ol>
<li>Blanda 2 g agarospulver i 100 ml autoklaverat vatten. Värm den i mikrovågsugnen några ...

<ol>
	<li>Sparrow, D., Weiss, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+physiology.">Respiratory physiology.</a> Annual Review of Gerontology &amp; Geriatrics. 6, 197-214 (1986).</li><li>Gerckens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+3D+lung+tissue+cultures+(3D-LTCs)+for+disease+modeling.">Generation of human 3D lung tissue cultures (3D-LTCs) for disease modeling.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), e58437 (2019).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preserving+airway+smooth+muscle+contraction+in+precision-cut+lung+slices.">Preserving airway smooth muscle contraction in precision-cut lung slices.</a> Scientific Reports. 10 (1), 6480 (2020).</li><li>Rosales Gerpe, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+precision-cut+lung+slices+as+an+ex+vivo+tool+for+evaluating+viruses+and+viral+vectors+for+gene+and+oncolytic+therapy.">Use of precision-cut lung slices as an ex vivo tool for evaluating viruses and viral vectors for gene and oncolytic therapy.</a> Molecular Therapy: Methods &amp; Clinical Development. 10, 245-256 (2018).</li><li>Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+lung+physiology+in+health+and+disease+with+lung+slices.">Exploring lung physiology in health and disease with lung slices.</a> Pulmonary Pharmacology &amp; Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).</li><li>Liu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+lung+slices:+An+ex+vivo+model+for+the+evaluation+of+antiviral+and+anti-inflammatory+agents+against+influenza+viruses.">Mouse lung slices: An ex vivo model for the evaluation of antiviral and anti-inflammatory agents against influenza viruses.</a> Antiviral Research. 120, 101-111 (2015).</li><li>de Graaf, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+incubation+of+precision-cut+liver+and+intestinal+slices+for+application+in+drug+metabolism+and+toxicity+studies.">Preparation and incubation of precision-cut liver and intestinal slices for application in drug metabolism and toxicity studies.</a> Nature Protocols. 5 (9), 1540-1551 (2010).</li><li>Alsafadi, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+and+approaches+for+three-dimensional+precision-cut+lung+slices.+Disease+modeling+and+drug+discovery.">Applications and approaches for three-dimensional precision-cut lung slices. Disease modeling and drug discovery.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 62 (6), 681-691 (2020).</li><li>Morin, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+cut+lung+slices+as+an+efficient+tool+for+in+vitro+lung+physio-pharmacotoxicology+studies.">Precision cut lung slices as an efficient tool for in vitro lung physio-pharmacotoxicology studies.</a> Xenobiotica. 43 (1), 63-72 (2013).</li><li>Springer, J., Fischer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substance+P-induced+pulmonary+vascular+remodelling+in+precision+cut+lung+slices.">Substance P-induced pulmonary vascular remodelling in precision cut lung slices.</a> The European Respiratory Journal. 22 (4), 596-601 (2003).</li><li>Suleiman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Argon+reduces+the+pulmonary+vascular+tone+in+rats+and+humans+by+GABA-receptor+activation.">Argon reduces the pulmonary vascular tone in rats and humans by GABA-receptor activation.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1902 (2019).</li><li>Rieg, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+agents+affect+the+tone+of+pulmonary+arteries+and+veins+in+precision-cut+lung+slices.">Cardiovascular agents affect the tone of pulmonary arteries and veins in precision-cut lung slices.</a> PLoS One. 6 (12), 29698 (2011).</li><li>Perez, J. F., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+frequency+of+calcium+oscillations+induced+by+5-HT,+ACH,+and+KCl+determine+the+contraction+of+smooth+muscle+cells+of+intrapulmonary+bronchioles.">The frequency of calcium oscillations induced by 5-HT, ACH, and KCl determine the contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary bronchioles.</a> The Journal of General Physiology. 125 (6), 535-553 (2005).</li><li>Deng, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+of+5-hydroxytryptamine+receptor+signaling+in+coronary+arteries+after+organ+culture.">Upregulation of 5-hydroxytryptamine receptor signaling in coronary arteries after organ culture.</a> PLoS One. 9 (9), 107128 (2014).</li><li>Sandker, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adventitial+dissection:+A+simple+and+effective+way+to+reduce+radial+artery+spasm+in+coronary+bypass+surgery.">Adventitial dissection: A simple and effective way to reduce radial artery spasm in coronary bypass surgery.</a> Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 17 (5), 784-789 (2013).</li><li>Naik, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pressure-induced+smooth+muscle+cell+depolarization+in+pulmonary+arteries+from+control+and+chronically+hypoxic+rats+does+not+cause+myogenic+vasoconstriction.">Pressure-induced smooth muscle cell depolarization in pulmonary arteries from control and chronically hypoxic rats does not cause myogenic vasoconstriction.</a> Journal of Applied Physiology. 98 (3), 1119-1124 (2005).</li><li>Lopez-Lopez, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+induces+pulmonary+artery+endothelial+dysfunction+by+NADPH+oxidase+induction.">Diabetes induces pulmonary artery endothelial dysfunction by NADPH oxidase induction.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (5), 727-732 (2008).</li><li>Gonzalez-Tajuelo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+pulmonary+hypertension+associated+with+systemic+sclerosis+in+P-selectin+glycoprotein+Ligand+1-deficient+mice.">Spontaneous pulmonary hypertension associated with systemic sclerosis in P-selectin glycoprotein Ligand 1-deficient mice.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 72 (3), 477-487 (2020).</li><li>Bai, Y., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+Ca2++sensitivity+of+airway+smooth+muscle+cells+in+murine+lung+slices.">Modulation of the Ca2+ sensitivity of airway smooth muscle cells in murine lung slices.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (2), 208-221 (2006).</li><li>Nishiyama, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+function+and+endothelin-1:+tipping+the+balance+between+vasodilation+and+vasoconstriction.">Vascular function and endothelin-1: tipping the balance between vasodilation and vasoconstriction.</a> Journal of Applied Physiology. 122 (2), 354-360 (2017).</li><li>Schneider, M. P., Inscho, E. W., Pollock, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuated+vasoconstrictor+responses+to+endothelin+in+afferent+arterioles+during+a+high-salt+diet.">Attenuated vasoconstrictor responses to endothelin in afferent arterioles during a high-salt diet.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 292 (4), 1208-1214 (2007).</li><li>Inscho, E. W., Imig, J. D., Cook, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Afferent+and+efferent+arteriolar+vasoconstriction+to+angiotensin+II+and+norepinephrine+involves+release+of+Ca2++from+intracellular+stores.">Afferent and efferent arteriolar vasoconstriction to angiotensin II and norepinephrine involves release of Ca2+ from intracellular stores.</a> Hypertension. 29, 222-227 (1997).</li><li>Vecchione, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+from+angiotensin+II-mediated+vasculotoxic+and+hypertensive+response+in+mice+lacking+PI3Kgamma.">Protection from angiotensin II-mediated vasculotoxic and hypertensive response in mice lacking PI3Kgamma.</a> The Journal of Experimental Medicine. 201 (8), 1217-1228 (2005).</li></ol>

I detta manuskript beskrivs en förbättrad metod för att producera högupplösta bilder av murin lungvävnad som bevarar kärlstrukturen och optimerar experimentell flexibilitet, särskilt med hjälp av PCLS för att erhålla mikroslices av lungvävnad som kan ses i tre dimensioner med bevarad kontraktilitet av vaskulaturen. Med hjälp av reagenset visar protokollet att noggrant förberedda och konserverade skivor kan behålla livskraften i mer än en vecka. Bevarad livskraft hos mikroslices gör det möjligt för fler...

Framsteg i beredning och avbildning av lungvävnad som bevarar cellulära komponenter utan att offra anatomisk struktur ger en detaljerad förståelse av lungsjukdomar. Förmågan att identifiera proteiner, RNA och andra biologiska föreningar samtidigt som fysiologisk struktur upprätthålls erbjuder viktig information om cellernas rumsliga arrangemang som kan bredda förståelsen av patofysiologin vid många lungsjukdomar. Dessa detaljerade bilder kan leda till en bättre förståelse av pulmonell vaskulär sjukdomar, såsom pulmonell gatan hypertoni, när tillämpas på djurmodeller, vilket potentiellt leder till förbättrade terapeutiska strategier.
Trots tekniska framsteg är det fortfarande en utmaning att få högkvalitativa bilder av murin lungvävnad. Andningscykeln drivs av ett negativt intratroriskt tryck som genereras vid inandning1. När man traditionellt erhåller tarmbiopsier och förbereder lungprover för avbildning går den negativa tryckgradienten förlorad vilket resulterar i att luftvägarna och vaskulaturen kollapsar, vilket inte längre representerar sig självt i sitt nuvarande tillstånd. För att uppnå realistiska bilder som återspeglar nuvarande förhållanden måste lung luftvägarna återfvämmas och vaskulaturen perfunderas, ändra den dynamiska lungan till en statisk fixtur. Tillämpningen av dessa distinkta tekniker gör det möjligt att bevara strukturell integritet, lungvaskulatur och cellulära komponenter, inklusive immunceller som makrofager, så att lungvävnad kan ses så nära sitt fysiologiska tillstånd som möjligt.
Precisionsskuren lungslicing (PCLS) är ett idealiskt verktyg för att studera anatomin och fysiologin hos lungvaskulatur2. PCLS ger detaljerad avbildning av lungvävnaden i tre dimensioner samtidigt som strukturella och cellulära komponenter bevaras. PCLS har använts i djur- och mänskliga modeller för att möjliggöra levande, högupplösta bilder av cellulära funktioner i tre dimensioner, vilket gör det till ett idealiskt verktyg för att studera potentiella terapeutiska mål, mäta liten luftvägskontraktion och studera patofysiologi av kroniska lungsjukdomar som KOL, ILD och lungcancer3. Med hjälp av liknande tekniker kan exponeringen av PCLS-prover för vasoconstrictors bevara lungstruktur och kärlkontraktilitet, replikera in vitro-förhållanden. Tillsammans med att bevara kontraktilitet kan beredda prover genomgå ytterligare analys som RNA-sekvensering, västerländsk blot och flödescytometri när de bereds korrekt. Slutligen kan reporter färgmärkta celler märkta med tdTomato fluorescence efter lungskörd bevara märkning efter att ha förberett mikroslices, vilket gör den idealisk för cellspårningsstudier. Integrationen av dessa tekniker ger en sofistikerad modell bevara det rumsliga arrangemanget av celler och fartyg contractility som kan leda till en mer detaljerad förståelse av signalering kaskader och potentiella terapeutiska alternativ i pulmonell vaskulatur sjukdom.
I detta manuskript utsätts PCLS murin lungvävnad för vasoconstrictors, vilket visar bevarad strukturell integritet och fartyg kontraktilitet. Studien visar att den vävnad som beretts och hanteras på lämpligt sätt kan förbli livskraftig i 10 dagar. Studien visar också bevarandet av celler med endogen fluorescens (tdTomato), vilket gör det möjligt för prover att ge högupplösta bilder av lungvaskulaturen och arkitekturen. Slutligen har sätt att hantera och förbereda vävnadsskivor för RNA-mätning och western blot för att undersöka underliggande mekanismer beskrivits.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5cc of fractionated heparin in syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>100 USP units per mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 1/2 inch gauge blunt end needle for trachea cannulation</td>
			<td>Cml Supply</td>
			<td>90120050D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30cc syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Anti solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated vibrating blade microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Viability Reagent (alamarBlue)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>DAL1025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium and GLutaMAX, supplemented with 10% FBS, 1% Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelin-1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mortar and Pestle</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA lysis and extraction buffer</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>89900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical suture 6/0</td>
			<td>FST</td>
			<td>18020-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Invitrogen, Thermofisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Low Melting Point Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>VT1200 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Winged blood collection set (Butterfly needle) 25-30G</td>
			<td>BD</td>
			<td>25-30G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

precision cut lung slices as an efficient tool for ex vivo pulmonary vessel structure and contractility studies

Visualisering av murine lungvävnad ger värdefull strukturell och cellulär information om underliggande luftvägarna och vaskulatur. Bevarandet av lungkärl som verkligen representerar fysiologiska förhållanden innebär dock fortfarande utmaningar. Dessutom resulterar den känsliga konfigurationen av murin lungor i tekniska utmaningar att förbereda prover för högkvalitativa bilder som bevarar både cellulär sammansättning och arkitektur. På samma sätt kan cellulära kontraktilitetsanalyser utföras för att studera cellernas potential att svara på vasoconstrictors in vitro, men dessa analyser reproducerar inte den komplexa miljön i den intakta lungan. I motsats till dessa tekniska problem kan precisionsskuren lungskiva (PCLS) användas som ett effektivt alternativ för att visualisera lungvävnad i tre dimensioner utan regional partiskhet och fungera som en levande surrogatkontraktilitetsmodell i upp till 10 dagar. Vävnad som framställs med PCLS har bevarat struktur och rumslig orientering, vilket gör det idealiskt att studera sjukdomsprocesser ex vivo. Placeringen av endogena tdTomato-märkta celler i PCLS skördas från en inducible tdTomato reporter murine modell kan framgångsrikt visualiseras av confocal mikroskopi. Efter exponering för vasoconstrictors visar PCLS bevarandet av både fartygets kontraktilitet och lungstruktur, som kan fångas upp av en tidsfördröjningsmodul. I kombination med andra procedurer, såsom western blot och RNA-analys, kan PCLS bidra till den omfattande förståelsen av signalkaskader som ligger till grund för en mängd olika sjukdomar och leda till en bättre förståelse för patofysiologin vid lungvaskulära sjukdomar.

När det tillsätts till celler eller vävnad modifieras livskraftreagenset genom den reducerande miljön för livskraftig vävnad och blir rosa/röd och blir mycket fluorescerande. De representativa färgförändringar som detekteras från dag 0-1 och dag 9-10 visas i figur 3. Som nämnts började lösningen blått och blev rosa över natten, vilket visade livskraft. Färgförändring sker vanligtvis inom 1-4 h; En längre tid kan dock bli nödvändig. För att analysera livsduglighet anvä...

Watch this Scientific Journal Video about Precision Cut Lung Slices as an Efficient Tool for Ex vivo Pulmonary Vessel Structure and Contractility Studies at JoVE.com

Precision Cut Lung Slices as an Efficient Tool for Ex vivo Pulmonary Vessel Structure and Contractility Studies

Presenteras här är ett protokoll för att bevara vaskulär kontraktiliteten av PCLS murine lung vävnad, vilket resulterar i en sofistikerad tredimensionell bild av pulmonell vaskulatur och luftvägarna, som kan bevaras i upp till 10 dagar som är mottagliga för många förfaranden.

Precisionsskurna lungskivor som ett effektivt verktyg för ex vivo pulmonellkärlsstruktur och kontraktilitetsstudier

The visualization of murine lung tissue provides valuable structural and cellular information regarding the underlying airway and vasculature. However, ...

Precisionsskurna lungskivor kommer att bevara strukturen och rumsliga orienteringar i tre dimensioner utan regional partiskhet och kan fungera som en levande surrogatmodell för fartyg och mätningar av luftvägskontraktilitet. I kombination med time-lapse imaging, Western blot och RNA analys, precisionsskurna lungskivor bidrar till den omfattande förståelsen av signalerande kaskader som ligger till grund för en mängd olika sjukdomar och leder till en bättre förståelse av patofysiologi i pulmonell vaskulär sjukdomar. Till att börja med, placera den avlivade vuxna musen i en supin position och säkra den på plats genom att tejpa tassarna och näsan på bordet med tejp.Spraya musens ventrala yta med 70% etanol. Använd tång för att lyfta musens bukhud på platsen för urinblåsan och kirurgisk sax för att skära vid mittlinjen och flytta överlägsen till livmoderhalsregionen för att exponera luftstrupen. Använd sedan pincett för att lyfta det underliggande fasciaskiktet och använda kirurgisk sax för att exponera viscerala organ och mediastinal fack, återigen skära inferiorly till överlägsen.Skär bröstbenet vid mittlinjen för att exponera hjärtat och lungan. Dissekera membranet försiktigt från levern och bukutrymmet. Hitta den sämre vena cava under tarmarna och skär den.Efter att ha lokaliserat höger ventrikel, använd en 25 till 30 gauge fjärilsnål för att injicera 0,5 milliliter 1% fraktionerad heparin i höger ventrikel och spola den långsamt men stadigt med 10 till 15 millimeter PBS. Efter att ha lokaliserat struphuvudet, använd trubbiga spets pincett för att dissekera den omgivande fascian och vävnaden, placera sedan den kirurgiska suturen under luftstrupen och löst knyta en kirurgisk knut. Placera ett litet hål i luftstrupen som är överlägsen strängen och kanylera med en 20 gauge trubbig nål.Dra åt suturen runt nålen och luftstrupen med hjälp av en kirurgisk knut. Injicera sedan 2,5 till 4 milliliter agaros i luftstrupen och övervaka för uppblåsning av lungan. Efter agarose injektionen, häll kalla PBS över lungan för att stelna agaros.Skär sedan luftstrupen överlägsen den kirurgiska suturen och dissekera lungan och hjärtat från mediastinum genom att ta bort eventuella vidhäftningar och fascia. Efter stelning, placera vävnaden i DMEM i en Petri-skål på is och fortsätt omedelbart att skära en lob med hjälp av en vibratommaskin. För att förbereda lungskivorna, fäst provet på plattformen med superlim, håll den mediala sidan vänd uppåt.Fyll sedan provbehållaren med PBS. Fyll behållaren med is för att hålla den omgivande PBS och ta ett prov kallt. Slå på vibratomen.Justera tjockleken till 300 mikrometer, frekvens till 100 Hertz, amplitud till 0,6 millimeter och hastighet till fem mikrometer per sekund. Använd en insexnyckel och vrid bladhållaren i säkert läge och öppna käftarna för att sätta in ett blad. Dra sedan åt käftarna med en insexnyckel.Placera provet på lådan och se till att det är nedsänkt i PBS. Skjut upp rutan i rätt läge och se till att den är säker. Vrid bladhållaren i lämpligt läge för skivning.För upp vibratombladet till blockets kant och sänk bladet manuellt tills det är jämnt med toppen av provet. Bekräfta inställningarna och kör vibratomen. När de färska skivorna har skurits, ta bort proverna från PBS och placera dem i en steril Petri-skål med 10 ml DMEM som innehåller en gång antimykotiskt antibiotikum.När du har placerat alla skivor i en Petri-skål, dra tillbaka bladet helt och använd insexnyckeln för att höja bladet i ett säkert läge. Förvara proverna i DMEM vid 37 grader Celsius. Och placera en vibratomskiva på en mikroskopbild.Använd en rengöringsservett för att avlägsna överflödigt medium. Placera provet på faskontrastmikroskopin och använd 10 till 20X förstoring för att identifiera ett kärl. Tillsätt sedan 500 mikroliter vasoconstrictors, såsom 60 millimolar kaliumklorid eller en mikromolär endothelin-1 för att helt sänka bilden.Observera och fånga videon genom att spela in i 30 till 60 sekunder. Innan du börjar experimentet, fyll en liten polystyrenskumlåda med en liter flytande kväve och placera två 1,5 milliliter mikrocentrifugerör i behållaren med flytande kväve. Lägg fyra till fem färska vibratomskivor i en mortelskål.Häll 5 till 10 ml flytande kväve ovanpå skivorna och använd snabbt mortel för att mala skivorna till pulver innan det flytande kvävet avdunstar. Använd en förkyld laboratoriekopa av stål för att skopa pulvret i de två kylda mikrocentrifugerören och lysa pulvret genom att tillsätta 500 mikroliter RNA-extraktionsreagens för RNA-isolering eller 500 mikroliter RIPA-buffert för proteinlys. I det representativa livskraftsexperimentet upptäcktes färgförändringen av PCLS-segmenten från dag noll till en och dag nio till 10.Lösningen var ursprungligen blå och blev rosa över natten, vilket visade livskraft. Färgförändringen inträffade vanligtvis inom en till fyra timmar, men en längre tid kan vara nödvändig. Den dagliga skillnaden mellan absorbans vid våglängder på 562 och 613 nanometer för den vibratompreberade vävnaden visas här.Förträngningen av vaskulaturen i en vibratom-förberedd lungvävnad med endothelin-1 och kaliumklorid kan visualiseras här. Bevarandet av tdTomato märkning i celler en vecka efter tamoxifen injektion visas i dessa lungskivor. Det är viktigast att utföra lungrensningen och inflationen steg bra för att ta bort allt blod från cirkulationen före ytterligare experiment och avbildning.Förutom kärlsjukdomar kan PCLS tillämpas för att studera fysiobiologi av luftvägsrelaterad sjukdom och kan testas ytterligare på mänskliga lungvävnader i kliniskt relevanta scenarier.

Research

JoVE Journal

Medicine

Precision Cut Lung Slices as an Efficient Tool for Ex vivo Pulmonary Vessel Structure and Contractility Studies

Videomorphometric Analysis of Hypoxic Pulmonary Vasoconstriction of Intra-pulmonary Arteries Using Murine Precision Cut Lung Slices

Videomorfetrisk analys av hypoxisk lungvasokonstriktion av intrapulmonella artärer med hjälp av murinprecisionsskurna lungskivor

Acute alveolar hypoxia causes pulmonary vasoconstriction (HPV) - also known as von Euler-Liljestrand mechanism - which serves to match lung perfusion to ...

Fundus Photography as a Convenient Tool to Study Microvascular Responses to Cardiovascular Disease Risk Factors in Epidemiological Studies

Ögonbottenfotografering som ett praktiskt verktyg för att studera Mikrovaskulära Svaren till Cardiovascular Disease Risk Factors i epidemiologiska studier

The microcirculation consists of blood vessels with diameters less than 150 &#181;m. It makes up a large part of the circulatory system and plays an ...

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

Metod för Isolerad<em&gt; Ex vivo</em&gt; Lung Perfusion i en råttmodell: Lärdomar från Utveckla en Rat EVLP Program

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed ...

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

Ex vivo Live avbildning av lungmetastas och deras mikromiljö

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular ...

The 4-vessel Sampling Approach to Integrative Studies of Human Placental Physiology In Vivo

The 4-vessel Sampling Approach to Integrative Studies of Human Placental Physiology In Vivo

4-kärlprovtagningsstrategin för integrationsstudier av human placentalfysiologi<em&gt; In vivo</em

The human placenta is highly inaccessible for research while still in utero. The current understanding of human placental physiology in vivo is therefore ...

Combining Volumetric Capnography And Barometric Plethysmography To Measure The Lung Structure-function Relationship

Kombinera volymetrisk Capnography och barometrisk pletysmografi för att mäta förhållandet Lung struktur och funktion

Tools to measure lung and airways volume are critical for pulmonary researchers interested in evaluating the impact of disease or novel therapies on the ...

Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

Ex Vivo sårläkning korneal orgel kultur modell för studier

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

Quantitative Mapping of Specific Ventilation in the Human Lung using Proton Magnetic Resonance Imaging and Oxygen as a Contrast Agent

Kvantitativ kart läggning av specifik ventilation i Human lung med Proton Magnetic resonanstomografi och syre som kontrast medel

Specific ventilation imaging (SVI) is a functional magnetic resonance imaging technique capable of quantifying specific ventilation &#8213; the ratio of ...

Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts

Optokardiografi och elektrofysiologi studier av ex vivo Langendorff-parfymera hjärtan

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to ...

Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology

Murine Precision-Cut leverskivor som en Ex Vivo modell av leverbiologi

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic ...