Name: precision cut lung slices as an efficient tool for ex vivo pulmonary vessel structure and contractility studies
Uploaded: 2021-05-24T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Precision Cut Lung Slices as an Efficient Tool for Ex vivo Pulmonary Vessel Structure and Contractility Studies at JoVE.com

Yazarlar Teknik destekleri için Dr. Yuan Hao ve Kaifeng Liu'ya teşekkür eder. Bu çalışma NIH 1R01 HL150106-01A1, Parker B. Francis Bursu ve Dr. Ke Yuan'a Pulmoner Hipertansiyon Derneği Aldrighetti Araştırma Ödülü ile desteklenmiştir.

Tüm hayvan bakımı Boston Çocuk Hastanesi'nin yönergelerine uygundu ve Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi onaylı protokoller. Bu çalışmada kullanılan fareler vahşi tip C57 /B6 fareler ve Cdh5-CreERT2 x Ai14 tdTomato çapraz farelerdir.
1. Çözümlerin hazırlanması
<ol><li>Deney sırasında gerekli olan fosfat tampon çözeltisini (1x PBS) ve% 2 agarose çözeltisini önceden hazırlayın.<ol>
<li>2 g agarose tozunun 100 mL otomatik kapatılmış suya karıştırılmas?...

<ol>
	<li>Sparrow, D., Weiss, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+physiology.">Respiratory physiology.</a> Annual Review of Gerontology &amp; Geriatrics. 6, 197-214 (1986).</li><li>Gerckens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+3D+lung+tissue+cultures+(3D-LTCs)+for+disease+modeling.">Generation of human 3D lung tissue cultures (3D-LTCs) for disease modeling.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), e58437 (2019).</li><li>Li, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preserving+airway+smooth+muscle+contraction+in+precision-cut+lung+slices.">Preserving airway smooth muscle contraction in precision-cut lung slices.</a> Scientific Reports. 10 (1), 6480 (2020).</li><li>Rosales Gerpe, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+precision-cut+lung+slices+as+an+ex+vivo+tool+for+evaluating+viruses+and+viral+vectors+for+gene+and+oncolytic+therapy.">Use of precision-cut lung slices as an ex vivo tool for evaluating viruses and viral vectors for gene and oncolytic therapy.</a> Molecular Therapy: Methods &amp; Clinical Development. 10, 245-256 (2018).</li><li>Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+lung+physiology+in+health+and+disease+with+lung+slices.">Exploring lung physiology in health and disease with lung slices.</a> Pulmonary Pharmacology &amp; Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).</li><li>Liu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+lung+slices:+An+ex+vivo+model+for+the+evaluation+of+antiviral+and+anti-inflammatory+agents+against+influenza+viruses.">Mouse lung slices: An ex vivo model for the evaluation of antiviral and anti-inflammatory agents against influenza viruses.</a> Antiviral Research. 120, 101-111 (2015).</li><li>de Graaf, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+incubation+of+precision-cut+liver+and+intestinal+slices+for+application+in+drug+metabolism+and+toxicity+studies.">Preparation and incubation of precision-cut liver and intestinal slices for application in drug metabolism and toxicity studies.</a> Nature Protocols. 5 (9), 1540-1551 (2010).</li><li>Alsafadi, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+and+approaches+for+three-dimensional+precision-cut+lung+slices.+Disease+modeling+and+drug+discovery.">Applications and approaches for three-dimensional precision-cut lung slices. Disease modeling and drug discovery.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 62 (6), 681-691 (2020).</li><li>Morin, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precision+cut+lung+slices+as+an+efficient+tool+for+in+vitro+lung+physio-pharmacotoxicology+studies.">Precision cut lung slices as an efficient tool for in vitro lung physio-pharmacotoxicology studies.</a> Xenobiotica. 43 (1), 63-72 (2013).</li><li>Springer, J., Fischer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substance+P-induced+pulmonary+vascular+remodelling+in+precision+cut+lung+slices.">Substance P-induced pulmonary vascular remodelling in precision cut lung slices.</a> The European Respiratory Journal. 22 (4), 596-601 (2003).</li><li>Suleiman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Argon+reduces+the+pulmonary+vascular+tone+in+rats+and+humans+by+GABA-receptor+activation.">Argon reduces the pulmonary vascular tone in rats and humans by GABA-receptor activation.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1902 (2019).</li><li>Rieg, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+agents+affect+the+tone+of+pulmonary+arteries+and+veins+in+precision-cut+lung+slices.">Cardiovascular agents affect the tone of pulmonary arteries and veins in precision-cut lung slices.</a> PLoS One. 6 (12), 29698 (2011).</li><li>Perez, J. F., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+frequency+of+calcium+oscillations+induced+by+5-HT,+ACH,+and+KCl+determine+the+contraction+of+smooth+muscle+cells+of+intrapulmonary+bronchioles.">The frequency of calcium oscillations induced by 5-HT, ACH, and KCl determine the contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary bronchioles.</a> The Journal of General Physiology. 125 (6), 535-553 (2005).</li><li>Deng, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upregulation+of+5-hydroxytryptamine+receptor+signaling+in+coronary+arteries+after+organ+culture.">Upregulation of 5-hydroxytryptamine receptor signaling in coronary arteries after organ culture.</a> PLoS One. 9 (9), 107128 (2014).</li><li>Sandker, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adventitial+dissection:+A+simple+and+effective+way+to+reduce+radial+artery+spasm+in+coronary+bypass+surgery.">Adventitial dissection: A simple and effective way to reduce radial artery spasm in coronary bypass surgery.</a> Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 17 (5), 784-789 (2013).</li><li>Naik, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pressure-induced+smooth+muscle+cell+depolarization+in+pulmonary+arteries+from+control+and+chronically+hypoxic+rats+does+not+cause+myogenic+vasoconstriction.">Pressure-induced smooth muscle cell depolarization in pulmonary arteries from control and chronically hypoxic rats does not cause myogenic vasoconstriction.</a> Journal of Applied Physiology. 98 (3), 1119-1124 (2005).</li><li>Lopez-Lopez, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diabetes+induces+pulmonary+artery+endothelial+dysfunction+by+NADPH+oxidase+induction.">Diabetes induces pulmonary artery endothelial dysfunction by NADPH oxidase induction.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (5), 727-732 (2008).</li><li>Gonzalez-Tajuelo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+pulmonary+hypertension+associated+with+systemic+sclerosis+in+P-selectin+glycoprotein+Ligand+1-deficient+mice.">Spontaneous pulmonary hypertension associated with systemic sclerosis in P-selectin glycoprotein Ligand 1-deficient mice.</a> Arthritis &amp; Rheumatology. 72 (3), 477-487 (2020).</li><li>Bai, Y., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+the+Ca2++sensitivity+of+airway+smooth+muscle+cells+in+murine+lung+slices.">Modulation of the Ca2+ sensitivity of airway smooth muscle cells in murine lung slices.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (2), 208-221 (2006).</li><li>Nishiyama, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+function+and+endothelin-1:+tipping+the+balance+between+vasodilation+and+vasoconstriction.">Vascular function and endothelin-1: tipping the balance between vasodilation and vasoconstriction.</a> Journal of Applied Physiology. 122 (2), 354-360 (2017).</li><li>Schneider, M. P., Inscho, E. W., Pollock, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuated+vasoconstrictor+responses+to+endothelin+in+afferent+arterioles+during+a+high-salt+diet.">Attenuated vasoconstrictor responses to endothelin in afferent arterioles during a high-salt diet.</a> American Journal of Physiology. Renal Physiology. 292 (4), 1208-1214 (2007).</li><li>Inscho, E. W., Imig, J. D., Cook, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Afferent+and+efferent+arteriolar+vasoconstriction+to+angiotensin+II+and+norepinephrine+involves+release+of+Ca2++from+intracellular+stores.">Afferent and efferent arteriolar vasoconstriction to angiotensin II and norepinephrine involves release of Ca2+ from intracellular stores.</a> Hypertension. 29, 222-227 (1997).</li><li>Vecchione, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protection+from+angiotensin+II-mediated+vasculotoxic+and+hypertensive+response+in+mice+lacking+PI3Kgamma.">Protection from angiotensin II-mediated vasculotoxic and hypertensive response in mice lacking PI3Kgamma.</a> The Journal of Experimental Medicine. 201 (8), 1217-1228 (2005).</li></ol>

Bu yazıda, özellikle vasküler yapının korunmuş kontrititesi ile üç boyutlu olarak görülebilen akciğer dokusunun mikrosliklerini elde etmek için PCLS uygulaması kullanılarak, vasküler yapıyı koruyan ve deneysel esnekliği optimize eden yüksek çözünürlüklü murine akciğer dokusu görüntüleri üretmek için geliştirilmiş bir yöntem açıklanmıştır. Uygulanabilirlik reaktifini kullanarak, protokol özenle hazırlanmış ve korunmuş dilimlerin bir haftadan fazla yaşayabilirliği koruyabilece?...

Anatomik yapıdan ödün vermeden hücresel bileşenleri koruyan akciğer dokusunun hazırlanması ve görüntülenmesinde meydana gelen gelişmeler pulmoner hastalıkların ayrıntılı bir şekilde anlaşılmasını sağlar. Fizyolojik yapıyı korurken proteinleri, RNA'yı ve diğer biyolojik bileşikleri tanımlama yeteneği, çok sayıda pulmoner hastalıkta patofizyolojinin anlaşılmasını genişletebilecek hücrelerin mekansal düzeni hakkında hayati bilgiler sunar. Bu ayrıntılı görüntüler, hayvan modellerine uygulandığında pulmoner arter hipertansiyonu gibi pulmoner vasküler hastalıkların daha iyi anlaşılmasına yol açabilir ve potansiyel olarak iyileştirilmiş terapötik stratejilere yol açabilir.
Teknolojideki gelişmelere rağmen, murine akciğer dokusunun yüksek kaliteli görüntülerini elde etmek zor olmaya devam ediyor. Solunum döngüsü, inhalasyon sırasında oluşan negatif intratorasik basınç tarafından tahrik edilir1. Geleneksel olarak biyopsiler elde edilirken ve akciğer örnekleri görüntüleme için hazırlanırken, negatif basınç gradyanı kaybolur ve bu da artık mevcut durumunda kendini temsil eden hava yolu ve vaskülatın çökmesine neden olabilir. Mevcut koşulları yansıtan gerçekçi görüntüler elde etmek için, pulmoner hava yolları yeniden şişirilmeli ve vaskülat perfüzyona maruz kalarak dinamik akciğeri statik bir fikstüre dönüştürmelidir. Bu farklı tekniklerin uygulanması, makrofajlar gibi bağışıklık hücreleri de dahil olmak üzere yapısal bütünlüğün, pulmoner vaskülatın ve hücresel bileşenlerin korunmasına izin vererek akciğer dokusunun fizyolojik durumuna mümkün olduğunca yakın görülmesini sağlar.
Hassas kesim akciğer dilimleme (PCLS), pulmoner vaskülat2anatomisini ve fizyolojisini incelemek için ideal bir araçtır. PCLS, yapısal ve hücresel bileşenleri korurken akciğer dokusunun üç boyutlu olarak ayrıntılı görüntülenmesini sağlar. PCLS, hayvan ve insan modellerinde hücresel fonksiyonların canlı, yüksek çözünürlüklü görüntülerinin üç boyutta kullanılmasına izin vermek için kullanılmıştır, bu da potansiyel terapötik hedefleri incelemek, küçük hava yolu kasılmalarını ölçmek ve KOAH, ILD ve akciğer kanseri gibi kronik akciğer hastalıklarının patofizyolojisini incelemek için ideal biraraçtır 3. Benzer teknikler kullanılarak, PCLS örneklerinin vazokonstriktörlere maruz kalması akciğer yapısını ve damar kontrititesini koruyarak in vitro durumları çoğaltabilir. Sözleşmenin korunmasının yanı sıra, hazırlanan numuneler doğru hazırlandığında RNA dizilimi, Batı lekesi ve akış sitometrisi gibi ek analizlerden geçirilebilir. Son olarak, akciğer hasadından sonra tdTomato floresan ile işaretlenmiş muhabir renk etiketli hücreler, mikroslikler hazırladıktan sonra etiketlemeyi koruyabilir ve bu da hücre izleme çalışmaları için idealdir. Bu tekniklerin entegrasyonu, pulmoner vaskülür hastalığında sinyal basamaklarının ve potansiyel terapötik seçeneklerin daha ayrıntılı anlaşılmasına yol açabilecek hücrelerin mekansal düzenini ve damar kontrtinazlığını koruyan sofistike bir model sağlar.
Bu yazıda PCLS murine akciğer dokusu vasokonstriktörlere maruz kalarak korunmuş yapısal bütünlük ve damar kontrititesini ortaya koymuştur. Çalışma, uygun şekilde hazırlanan ve ele alınabilen dokunun 10 gün boyunca canlı kalabileceğini göstermektedir. Çalışma ayrıca endojen floresan (tdTomato) ile hücrelerin korunmasını göstererek, örneklerin pulmoner vaskülat ve mimarinin yüksek çözünürlüklü görüntülerini sağlamasına izin vermektedir. Son olarak, doku dilimlerini RNA ölçümü için ve Batı lekesini alttaki mekanizmaları araştırmak için ele almanın ve hazırlamanın yolları açıklanmıştır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5cc of fractionated heparin in syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>100 USP units per mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>&#160;21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 1/2 inch gauge blunt end needle for trachea cannulation</td>
			<td>Cml Supply</td>
			<td>90120050D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30cc syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti Anti solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated vibrating blade microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Viability Reagent (alamarBlue)</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>DAL1025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium and GLutaMAX, supplemented with 10% FBS, 1% Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelin-1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mortar and Pestle</td>
			<td>Amazon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA lysis and extraction buffer</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>89900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical suture 6/0</td>
			<td>FST</td>
			<td>18020-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>Invitrogen, Thermofisher</td>
			<td>15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Low Melting Point Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>VT1200 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Winged blood collection set (Butterfly needle) 25-30G</td>
			<td>BD</td>
			<td>25-30G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

precision cut lung slices as an efficient tool for ex vivo pulmonary vessel structure and contractility studies

Murine akciğer dokusunun görselleştirilmesi, alttaki hava yolu ve vaskülat ile ilgili değerli yapısal ve hücresel bilgiler sağlar. Bununla birlikte, fizyolojik koşulları gerçekten temsil eden pulmoner damarların korunması hala zorluklar ortaya koyuyor. Ek olarak, murine akciğerlerinin hassas konfigürasyonu, hem hücresel kompozisyonu hem de mimariyi koruyan yüksek kaliteli görüntüler için numuneler hazırlamakta teknik zorluklarla sonuçlanır. Benzer şekilde, hücresel kontritite tahlilleri, hücrelerin vazokonstriktörlere in vitroyanıt verme potansiyelini incelemek için yapılabilir, ancak bu tahliller sağlam akciğerin karmaşık ortamını yeniden üretmez. Bu teknik konuların aksine hassas kesimli akciğer dilimi (PCLS) yöntemi, akciğer dokusunu bölgesel önyargı olmadan üç boyutlu olarak görselleştirmek için etkili bir alternatif olarak uygulanabilir ve 10 güne kadar canlı vekil kontritite modeli olarak hizmet vermektedir. PCLS kullanılarak hazırlanan doku, yapıyı ve mekansal yönelimi korumuştur, bu da hastalık süreçlerinin eks vivoincelenmesini ideal hale getirir. Endojen tdTomato etiketli hücrelerin, indüklenebilir bir tdTomato muhabir murine modelinden elde edilen PCLS'deki konumu konfokal mikroskopi ile başarıyla görselleştirilebilir. Vazokonstriktörlere maruz kalındıktan sonra PCLS, hem damar kontrititesinin hem de zaman atlamalı bir modül tarafından yakalanabilen akciğer yapısının korunmasını gösterir. Batı blot ve RNA analizi gibi diğer prosedürlerle birlikte PCLS, çok çeşitli bozuklukların altında yatan ve pulmoner vasküler hastalıklarda patofizyolojinin daha iyi anlaşılmasına yol açan sinyal basamaklarının kapsamlı bir şekilde anlaşılmasına katkıda bulunabilir.

Hücrelere veya dokuya eklendiğinde, canlılık reaktifi, canlı dokunun azaltıcı ortamı tarafından değiştirilir ve pembe / kırmızıya döner ve yüksek floresan haline gelir. 0-1 ve 9-10. günden itibaren tespit edilen temsili renk değişiklikleri Şekil 3'tegösterilmiştir. Belirtildiği gibi, çözüm maviye başladı ve bir gecede pembeye döndü ve canlılık gösterdi. Renk değişimi genellikle 1-4 saat içinde gerçekleşir; ancak, daha uzun bir süre gerekebilir. Canlıl?...

Watch this Scientific Journal Video about Precision Cut Lung Slices as an Efficient Tool for Ex vivo Pulmonary Vessel Structure and Contractility Studies at JoVE.com

Precision Cut Lung Slices as an Efficient Tool for Ex vivo Pulmonary Vessel Structure and Contractility Studies

Burada sunulan PCLS murine akciğer dokusunun damar kontrititesini korumak için bir protokoldür, bu da pulmoner vaskülat ve hava yolunun sofistike bir üç boyutlu görüntüsü ile sonuçlanır, bu da çok sayıda prosedüre duyarlı 10 güne kadar korunabilir.

Ex vivo Pulmoner Damar Yapısı ve Kontritite Çalışmaları İçin Verimli Bir Araç Olarak Hassas Kesim Akciğer Dilimleri

The visualization of murine lung tissue provides valuable structural and cellular information regarding the underlying airway and vasculature. However, ...

Hassas kesim akciğer dilimleri yöntemi, yapıyı ve mekansal yönelimleri bölgesel önyargı olmadan üç boyutta koruyacak ve damarlar ve hava yolu kontritite ölçümleri için canlı taşıyıcı model görevi görecektir. Zaman atlamalı görüntüleme, Batı lekesi ve RNA analizi ile birlikte, hassas kesilmiş akciğer dilimleri, çok çeşitli bozuklukların altında yatan ve pulmoner vasküler hastalıklarda patofizyolojinin daha iyi anlaşılmasına yol açan sinyal basamaklarının kapsamlı bir şekilde anlaşılmasına katkıda bulunur. Başlamak için, ötenazi yetişkin fareyi bir supine konumuna getirin ve pençeleri ve burnu yapışkan bantla masaya bantlayarak yerine sabitleyin.Farenin ventral yüzeyini% 70 etanol ile püskürtün. Farenin karın derisini mesanenin bulunduğu yerde kaldırmak için önpsezleri ve orta çizgide kesmek için cerrahi makası kullanın, nefes nefese maruz kalmak için servikal bölgeye üstün hareket edin. Daha sonra alttaki fasya tabakasını kaldırmak için cımbız kullanın ve visseral organları ve mediastinal bölmeyi ortaya çıkarmak için cerrahi makas kullanın, yine üstünden daha düşük kesim.Kalbi ve akciğeri açığa çıkarmak için orta çizgideki sternumu kesin. Diyaframı karaciğerden ve karın bölmesinden dikkatlice ayırın. Bağırsakların altındaki alt vena kavayı bulun ve kesin.Sağ ventrikülü bulduktan sonra, 25 ila 30 kalibrelik bir kelebek iğnesi kullanarak sağ ventrikülün içine %1 fraksiyone heparinin 0,5 mililitresini enjekte edin ve 10 ila 15 milimetre PBS ile yavaşça ama istikrarlı bir şekilde yıkayın. Gırtlağın yerini tespit ettikten sonra, çevredeki fasya ve dokuyu parçalamak için künt uçlu cımbız kullanın, ardından cerrahi sütür nefes borusunun altına yerleştirin ve gevşek bir şekilde cerrahi bir düğüm bağlayın. Nefes borusuna ipe göre daha üstün küçük bir delik yerleştirin ve 20 kalibrelik kör uçlu bir iğne ile kanüle edin.Cerrahi bir düğüm kullanarak iğne ve trakea etrafındaki dikişi sıkın. Daha sonra nefes borusuna 2,5 ila 4 mililitre agazo enjekte edin ve akciğerin şişirmesini izleyin. Agarose enjeksiyonundan sonra, agarose katılaştırmak için akciğerin üzerine soğuk PBS dökün.Daha sonra nefes borusu cerrahi dikişten daha üstün kesin ve herhangi bir yapışıklık ve fasyayı çıkararak akciğeri ve kalbi mediastinyumdan kesin. Katılaşmadan sonra, DMEM'deki dokuyu buz üzerindeki bir Petri kabına yerleştirin ve hemen bir vibratom makinesi kullanarak bir lobu dilimleme işlemine devam edin. Akciğer dilimlerini hazırlamak için, örneği platforma süperglue ile takın ve medial tarafı yukarı bakacak şekilde tutun.Ardından örnek kabı PBS ile doldurun. Çevredeki PBS'yi ve numuneyi soğuk tutmak için kabı buzla doldurun. Vibratomu aç.Kalınlığı 300 mikrometreye, frekansı 100 Hertz'e, genliği 0,6 milimetreye ve hızı saniyede beş mikrometreye ayarlayın. Bir Allen anahtarı kullanarak, bıçak tutucuyu güvenli konuma getirin ve bir bıçak yerleştirmek için çeneleri açın. Sonra çeneleri bir Allen anahtarı ile sıkın.Örneği PBS'ye batırıldıklarından emin olarak kutunun üzerine yerleştirin. Kutuyu doğru konuma getirin ve güvenli olduğundan emin olun. Bıçak tutucuyu dilimleme için uygun konuma getirin.Vibratom bıçağını bloğun kenarına getirin ve bıçağı numunenin üst kısmına gelene kadar manuel olarak diraye diri diri dürt. Ayarları onaylayın ve vibratomu çalıştırın. Taze dilimler kesildikten sonra, örnekleri PBS'den çıkarın ve bir kerelik antimykotik antibiyotik içeren 10 mililitre DMEM ile steril bir Petri kabına yerleştirin.Tüm dilimleri bir Petri kabına yerleştirdikten sonra, bıçağı tamamen geri çekin ve bıçağı güvenli bir konuma getirmek için Allen anahtarını kullanın. Örnekleri DMEM'de 37 santigrat derecede saklayın. Ve bir vibratom dilimini mikroskop kaydıranına yerleştirin.Fazla ortamı çıkarmak için bir temizleme mendili kullanın. Numuneyi faz kontrastı mikroskopisine yerleştirin ve bir damarı tanımlamak için 10 ila 20X büyütme kullanın. Daha sonra slaydı tamamen batırmak için 60 milimolar potasyum klorür veya bir mikromoler endotelin-1 gibi 500 mikrolitre vazokonstriktör ekleyin.30 ila 60 saniye kayıt larak videoyu gözlemleyin ve yakalayın. Deneye başlamadan önce, küçük bir polistiren köpük kutusunu bir litre sıvı azotla doldurun ve kabın içine sıvı nitrojen ile iki adet 1,5 mililitre mikrosantrifüj tüpü yerleştirin. Bir harç kabına dört ila beş taze vibratom dilimi yerleştirin.Dilimlerin üzerine 5 ila 10 mililitre sıvı azot dökün ve sıvı nitrojen buharlaşmadan önce dilimleri toz haline getirmek için pestle'yi hızla kullanın. Tozu iki soğutulmuş mikrosantrifüj tüpüne kepçeyle almak için önceden soğutulmuş bir çelik laboratuvar kepçesi kullanın ve RNA izolasyonu için 500 mikrolitre RNA ekstraksiyon reaktifi veya protein liziz için 500 mikrolitre RIPA tamponu ekleyerek tozu izleyin. Temsili canlılık deneyinde, PCLS dilimlerinin renk değişimi sıfırdan bire ve dokuzuncu günden 10'a kadar tespit edildi.Çözüm başlangıçta maviydi ve bir gecede pembeye döndü ve canlılık gösterdi. Renk değişimi genellikle bir ila dört saat içinde meydana geldi, ancak daha uzun bir süre gerekebilir. Vibratomla hazırlanan doku için 562 ve 613 nanometre dalga boylarındaki absorbans arasındaki günlük fark burada gösterilmiştir.Endotelin-1 ve potasyum klorür kullanılarak vibratomla hazırlanmış bir akciğer dokusundaki vaskülatın daralması burada görselleştirilebilir. Tamoksifen enjeksiyonundan bir hafta sonra hücrelerde tdTomato etiketlemesinin korunması bu akciğer dilimlerinde gösterilmiştir. Ek deneyler ve görüntülemelerden önce tüm kanı dolaşımdan çıkarmak için akciğer temizleme ve enflasyon adımını iyi yapmak en önemlisidir.Vasküler hastalıklara ek olarak, PCLS hava yolu ile ilgili hastalığın fizyolojisini incelemek için uygulanabilir ve klinik olarak ilgili senaryolarda insan akciğer dokuları üzerinde daha fazla test edilebilir.

Research

JoVE Journal

Medicine

Precision Cut Lung Slices as an Efficient Tool for Ex vivo Pulmonary Vessel Structure and Contractility Studies

Videomorphometric Analysis of Hypoxic Pulmonary Vasoconstriction of Intra-pulmonary Arteries Using Murine Precision Cut Lung Slices

Murine Hassas Kesim Akciğer Dilimleri Kullanılarak Pulmoner Arterlerin Hipoksik Pulmoner Vazokonstriksiyonunun Videomorfometrik Analizi

Acute alveolar hypoxia causes pulmonary vasoconstriction (HPV) - also known as von Euler-Liljestrand mechanism - which serves to match lung perfusion to ...

Fundus Photography as a Convenient Tool to Study Microvascular Responses to Cardiovascular Disease Risk Factors in Epidemiological Studies

Bir Uygun Aracı Olarak Fundus Fotoğraf Epidemiyolojik Çalışmaların Kardiyovasküler Hastalıklar Risk Faktörleri için Mikrovasküler Cevapları Eğitim için

The microcirculation consists of blood vessels with diameters less than 150 &#181;m. It makes up a large part of the circulatory system and plays an ...

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

İzole Yöntemi<em&gt; Ex vivo</emBir Rat Modelinde&gt; Akciğer Perfüzyon: Sıçan EVLP Programı Geliştirme Öğrenilmiş Dersler

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed ...

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

Ex Akciğer Metastaz ve Bunların mikroçevresinin Canlı Görüntüleme vivo

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular ...

The 4-vessel Sampling Approach to Integrative Studies of Human Placental Physiology In Vivo

The 4-vessel Sampling Approach to Integrative Studies of Human Placental Physiology In Vivo

İnsan vücudunun fizyolojisini bütünleştiren 4 damarlı Örnekleme Yaklaşımı<emIn vivo</em

The human placenta is highly inaccessible for research while still in utero. The current understanding of human placental physiology in vivo is therefore ...

Combining Volumetric Capnography And Barometric Plethysmography To Measure The Lung Structure-function Relationship

Hacimsel Capnography ve barometrik pletismografisi akciğer yapısı işlev ilişki ölçmek için birleştirme

Tools to measure lung and airways volume are critical for pulmonary researchers interested in evaluating the impact of disease or novel therapies on the ...

Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies

Ex vivo kornea Organ kültür modeli için yaranın çalışmaları

The cornea has been used extensively as a model system to study wound healing. The ability to generate and utilize primary mammalian cells in two ...

Quantitative Mapping of Specific Ventilation in the Human Lung using Proton Magnetic Resonance Imaging and Oxygen as a Contrast Agent

Proton manyetik rezonans görüntüleme ve oksijen kontrast ajan olarak kullanarak ınsan akciğerinde spesifik havalandırma niceliksel haritalama

Specific ventilation imaging (SVI) is a functional magnetic resonance imaging technique capable of quantifying specific ventilation &#8213; the ratio of ...

Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts

Ex Vivo Langendorff perfüzyonlu Kalplerin Optokardiyografi ve Elektrofizyoloji Çalışmaları

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to ...

Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology

Karaciğer Biyolojisi Ex Vivo Modeli olarak Murine Precision-Cut Karaciğer Dilimleri

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic ...