Name: in vitro analysis of e3 ubiquitin ligase function
Uploaded: 2021-05-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function at JoVE.com

نشكر أعضاء مختبرنا على المناقشات النقدية والمشورة المفيدة بشأن المخطوطة. نعتذر عن عدم ذكر مساهمات قيمة بسبب الحد من الحجم. ويدعم هذا العمل من قبل دويتشه Forschungsgemeinschaft (DFG، مؤسسة البحوث الألمانية) - SFB 1218 - Projektnumber 269925409 ومجموعة التميز EXC 229 / CECAD إلى TH. تم تمويل هذا العمل من قبل دويتشه فورتشونجسجيمينشافت (DFG، مؤسسة الأبحاث الألمانية) في إطار استراتيجية التميز الألمانية - EXC 2030 - 390661388 و - SFB 1218 - Projektnumber 269925409 إلى T.H. ديسي أربيت ووردي فون دير دويتشن فورتشونغشجيمينشافت (DFG) ايم رحمين دير deutschen Exzellenzstrategie - EXC 2030 - 390661388 أوند - SFB 1218 - Projektnummer: 269925409 gefördert T.H.

1. إعداد المخازن المؤقتة والكواشف
ملاحظة: يتم سرد المخازن المؤقتة والكواشف التي تم إعدادها يدويا في المختبر أدناه. تم شراء جميع المخازن المؤقتة والكواشف الأخرى المستخدمة في البروتوكولات من مصادر مختلفة واستخدامها وفقا لتعليمات المصنعين.
<ol><li>إعداد 10x الفوسفات العازلة الم?...

<ol>
	<li>Kuhlbrodt, K., Mouysset, J., Hoppe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchestra+for+assembly+and+fate+of+polyubiquitin+chains.">Orchestra for assembly and fate of polyubiquitin chains.</a> Essays in Biochemistry. 41, 1-14 (2005).</li><li>Pickart, C. M., Eddins, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin:+structures,+functions,+mechanisms.">Ubiquitin: structures, functions, mechanisms.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1695 (1-3), 55-72 (2004).</li><li>Dye, B. T., Schulman, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanisms+underlying+posttranslational+modification+by+ubiquitin-like+proteins.">Structural mechanisms underlying posttranslational modification by ubiquitin-like proteins.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36, 131-150 (2007).</li><li>Koegl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+ubiquitination+factor,+E4,+is+involved+in+multiubiquitin+chain+assembly.">A novel ubiquitination factor, E4, is involved in multiubiquitin chain assembly.</a> Cell. 96 (5), 635-644 (1999).</li><li>Hoppe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiubiquitylation+by+E4+enzymes:+'one+size'+doesn't+fit+all.">Multiubiquitylation by E4 enzymes: 'one size' doesn't fit all.</a> Trends in Biochemical Sciences. 30 (4), 183-187 (2005).</li><li>Stewart, M. D., Ritterhoff, T., Klevit, R. E., Brzovic, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E2+enzymes:+more+than+just+the+middle+men.">E2 enzymes: more than just the middle men.</a> Cell Research. 26 (4), 423-440 (2016).</li><li>Clague, M. J., Heride, C., Urb&#233;, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+demographics+of+the+ubiquitin+system.">The demographics of the ubiquitin system.</a> Trends in Cell Biology. 25 (7), 417-426 (2015).</li><li>Buetow, L., Huang, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+catalysis+and+regulation+of+E3+ubiquitin+ligases.">Structural insights into the catalysis and regulation of E3 ubiquitin ligases.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (10), 626-642 (2016).</li><li>French, M. E., Koehler, C. F., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+functions+of+branched+ubiquitin+chains.">Emerging functions of branched ubiquitin chains.</a> Cell Discovery. 7, 6 (2021).</li><li>Hatakeyama, S., Yada, M., Matsumoto, M., Ishida, N., Nakayama, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U+box+proteins+as+a+new+family+of+ubiquitin-protein+ligases.">U box proteins as a new family of ubiquitin-protein ligases.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (35), 33111-33120 (2001).</li><li>Herhaus, L., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+ubiquitin+code+through+post-translational+modification.">Expanding the ubiquitin code through post-translational modification.</a> EMBO Reports. 16 (9), 1071-1083 (2015).</li><li>Deshaies, R. J., Joazeiro, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RING+domain+E3+ubiquitin+ligases.">RING domain E3 ubiquitin ligases.</a> Annual Review of Biochemistry. 78, 399-434 (2009).</li><li>Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lingering+mysteries+of+ubiquitin-chain+assembly.">Lingering mysteries of ubiquitin-chain assembly.</a> Cell. 124 (1), 27-34 (2006).</li><li>Hoppe, T., Cohen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organismal+protein+homeostasis+mechanisms.">Organismal protein homeostasis mechanisms.</a> Genetics. 215 (4), 889-901 (2020).</li><li>Okiyoneda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+protein+quality+control+removes+unfolded+CFTR+from+the+plasma+membrane.">Peripheral protein quality control removes unfolded CFTR from the plasma membrane.</a> Science. 329 (5993), 805-810 (1997).</li><li>Tawo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ubiquitin+ligase+CHIP+integrates+proteostasis+and+aging+by+regulation+of+insulin+receptor+turnover.">The Ubiquitin ligase CHIP integrates proteostasis and aging by regulation of insulin receptor turnover.</a> Cell. 169 (3), 470-482 (2017).</li><li>Albert, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHIP+ubiquitylates+NOXA+and+induces+its+lysosomal+degradation+in+response+to+DNA+damage.">CHIP ubiquitylates NOXA and induces its lysosomal degradation in response to DNA damage.</a> Cell Death and Disease. 11 (9), 740 (2020).</li><li>Hoppe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+myosin-directed+chaperone+UNC-45+by+a+novel+E3/E4-multiubiquitylation+complex+in+C.+elegans.">Regulation of the myosin-directed chaperone UNC-45 by a novel E3/E4-multiubiquitylation complex in C. elegans.</a> Cell. 118 (3), 337-349 (2004).</li><li>Kim, J., L&#246;we, T., Hoppe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+quality+control+gets+muscle+into+shape.">Protein quality control gets muscle into shape.</a> Trends in Cell Biology. 18 (6), 264-272 (2008).</li><li>Janiesch, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-selective+chaperone+CDC-48/p97+links+myosin+assembly+to+human+myopathy.">The ubiquitin-selective chaperone CDC-48/p97 links myosin assembly to human myopathy.</a> Nature Cell Biology. 9 (4), 379-390 (2007).</li><li>Donkervoort, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+variants+in+the+myosin+chaperone+UNC-45B+cause+progressive+myopathy+with+eccentric+cores.">Pathogenic variants in the myosin chaperone UNC-45B cause progressive myopathy with eccentric cores.</a> The American Journal of Human Genetics. 107 (6), 1078-1095 (2020).</li><li>Murata, S., Minami, Y., Minami, M., Chiba, T., Tanaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHIP+is+a+chaperone-dependent+E3+ligase+that+ubiquitylates+unfolded+protein.">CHIP is a chaperone-dependent E3 ligase that ubiquitylates unfolded protein.</a> EMBO Reports. 2 (12), 1133-1138 (2001).</li><li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHIP+is+a+U-box-dependent+E3+ubiquitin+ligase:+identification+of+Hsc70+as+a+target+for+ubiquitylation.">CHIP is a U-box-dependent E3 ubiquitin ligase: identification of Hsc70 as a target for ubiquitylation.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (64), 42938-42944 (2001).</li><li>Yang, Y., Yu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+apoptosis:+the+ubiquitous+way.">Regulation of apoptosis: the ubiquitous way.</a> The FASEB Journal. 17 (8), 790-799 (2003).</li><li>Lamothe, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRAF6+ubiquitin+ligase+is+essential+for+RANKL+signaling+and+osteoclast+differentiation.">TRAF6 ubiquitin ligase is essential for RANKL signaling and osteoclast differentiation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communication. 359 (4), 1044-1049 (2007).</li><li>Amemiya, Y., Azmi, P., Seth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoubiquitination+of+BCA2+RING+E3+ligase+regulates+its+own+stability+and+affects+cell+migration.">Autoubiquitination of BCA2 RING E3 ligase regulates its own stability and affects cell migration.</a> Molecular Cancer Research. 6 (9), 1385 (2008).</li><li>Brzovic, P. S., Lissounov, A., Christensen, D. E., Hoyt, D. W., Klevit, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+UbcH5/ubiquitin+noncovalent+complex+is+required+for+processive+BRCA1-directed+ubiquitination.">A UbcH5/ubiquitin noncovalent complex is required for processive BRCA1-directed ubiquitination.</a> Molecular Cell. 21 (6), 873-880 (2006).</li><li>Sakata, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+UbcH5b~ubiquitin+intermediate:+Insight+into+the+formation+of+the+self-assembled+E2~Ub+conjugates.">Crystal structure of UbcH5b~ubiquitin intermediate: Insight into the formation of the self-assembled E2~Ub conjugates.</a> Structure. 18 (1), 138-147 (2010).</li><li>Eddins, M. J., Carlile, C. M., Gomez, K. M., Pickart, C. M., Wolberger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mms2-Ubc13+covalently+bound+to+ubiquitin+reveals+the+structural+basis+of+linkage-specific+polyubiquitin+chain+formation.">Mms2-Ubc13 covalently bound to ubiquitin reveals the structural basis of linkage-specific polyubiquitin chain formation.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 13 (10), 915-920 (2006).</li><li>Buetow, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+a+primed+RING+E3-E2+ubiquitin+complex+by+non-covalent+ubiquitin.">Activation of a primed RING E3-E2 ubiquitin complex by non-covalent ubiquitin.</a> Molecular Cell. 58 (2), 297-310 (2015).</li><li>Dou, H., Buetow, L., Sibbet, G. J., Cameron, K., Huang, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BIRC7-E2+ubiquitin+conjugate+structure+reveals+the+mechanism+of+ubiquitin+transfer+by+a+RING+dimer.">BIRC7-E2 ubiquitin conjugate structure reveals the mechanism of ubiquitin transfer by a RING dimer.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 19 (9), 876-883 (2012).</li><li>McKenna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncovalent+interaction+between+ubiquitin+and+the+human+DNA+repair+protein+Mms2+is+required+for+Ubc13-mediated+polyubiquitination.">Noncovalent interaction between ubiquitin and the human DNA repair protein Mms2 is required for Ubc13-mediated polyubiquitination.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (43), 40120-40125 (2001).</li><li>Plechanovov&#225;, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+ubiquitylation+by+dimeric+RING+ligase+RNF4.">Mechanism of ubiquitylation by dimeric RING ligase RNF4.</a> Nature Structural Biology. 18 (9), 1052-1059 (2011).</li><li>Pierce, N. W., Kleiger, G., Shan, S. O., Deshaies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+sequential+polyubiquitylation+on+a+millisecond+timescale.">Detection of sequential polyubiquitylation on a millisecond timescale.</a> Nature. 462 (7273), 615-619 (2009).</li><li>Jain, A. K., Barton, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+p53:+TRIM24+enters+the+RING.">Regulation of p53: TRIM24 enters the RING.</a> Cell Cycle. 8 (22), 3668-3674 (2009).</li><li>Swatek, K. N., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+modifications.">Ubiquitin modifications.</a> Cell Research. 26, 399-422 (2016).</li><li>Yan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+K63-linked+polyubiquitination+in+cardiac+hypertrophy.">The role of K63-linked polyubiquitination in cardiac hypertrophy.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (10), 4558-4567 (2018).</li><li>Dammer, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyubiquitin+linkage+profiles+in+three+models+of+proteolytic+stress+suggest+the+etiology+of+Alzheimer+disease.">Polyubiquitin linkage profiles in three models of proteolytic stress suggest the etiology of Alzheimer disease.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 10457-10465 (2011).</li></ol>

تصف هذه الورقة طرق التكميل في المختبر الأساسية لتحليل وظيفة E3 ligase. عند إجراء في المختبر في كل مكانالمقايسات, وينبغي النظر في أن بعض الإنزيمات E2 يمكن أن تؤدي لصناعة السيارات في كل مكان بسبب هجوم السيستين النشطة على بقايا ليسين الخاصة بهم التي تقع على مقربة من موقع نشط30</sup...

يوبيكيتيلييشن هي العملية التي يرتبط بها Ub بشكل مشترك ببروتين الركيزة1. يتم تحفيز تعديل Ub من خلال التفاعلات الأنزيمية المتتالية التي تنطوي على عمل ثلاث فئات إنزيم مختلفة ، أيإنزيمات تنشيط Ub (E1s) ، والإنزيمات المصاحبة (E2s) ، وUb ligases (E3s) ، وربما عوامل استطالة سلسلة Ub (E4s)2و3و4و5. بعد الأدينوزين ثلاثي الفوسفات (ATP) - والمغنيسيوم (Mg2+) - تعتمد على تنشيط Ub بواسطة E1 ، يهاجم الموقع النشط سيستين E1 الجليسين C-terminal من Ub ، مما يشكل مجمع ثيوستر (Ub ~ E1). الطاقة المستمدة من التحلل المائي ATP يسبب Ub لتحقيق حالة انتقالية عالية الطاقة، والتي يتم الحفاظ عليها في جميع أنحاء سلسلة الانزيم التالية. بعد ذلك ، ينقل إنزيم E2 Ub المنشط إلى السيستين الحفاز الداخلي ، وبالتالي تشكيل رابطة ثيوستر Ub ~ E2 العابرة. في وقت لاحق، يتم نقل Ub إلى بروتين الركيزة.
ويمكن القيام بذلك بطريقتين. إما أن E3 ligase قد ربط أولا إلى E2، أو يمكن ربط ليغاز E3 مباشرة Ub. نتائج الطريقة الأخيرة في تشكيل وسيط E3 ~ Ub. في كلتا الحالتين، يرتبط Ub إلى بروتين الركيزة عن طريق تشكيل رابطة إيسوببتيد بين مجموعة كاربوكسيل C-terminal من Ub ومجموعة اليسين الأمينية Ɛ من الركيزة6. الجينوم البشري يشفر اثنين من E1s، ما يقرب من 40 E2s، وأكثر من 600 ليغاز في كل مكانالمفترضة 7. استنادا إلى آلية نقل Ub من E3، وتنقسم إلى ثلاث فئات Ub ligases التي تنطوي على Homologous إلى E6AP C-Terminus (HECT) من نوع، جين جديد مثير للاهتمام حقا (RING)/U-مربع من نوع، وRING بين RING (RBR) من نوع ليغاز8. في هذه الدراسة، يتم استخدام U-مربع التي تحتوي على الليغاز، كاربوكسيل تيرمينوس من البروتين HSC70 التفاعل (CHIP)، كما انزيم E3 ممثل. على النقيض من HECT من نوع E3 الإنزيمات التي تشكل Ub ~ E3 thioesters، المجال U-مربع من CHIP يربط E2 ~ Ub ويعزز نقل Ub/substrate اللاحقة مباشرة من إنزيم E28،9. استنادا إلى أهمية U-box للدالة الأنزيمية، يتم استخدام متحولة غير نشطة CHIP U-box، CHIP (H260Q)، كعنصر تحكم. فشل CHIP (H260Q) لربط إلى E2s cognate لها، وبالتالي تفقد نشاطها E3 ligase10.
البروتين في كل مكان يلعب دورا حاسما في تنظيم العديد من الأحداث الخلوية في الخلايا eukaryotic. يمكن أن يعزى تنوع النتائج الخلوية التي يتم تعزيزها من خلال التعلق القابل للعكس لجزيئات Ub إلى بروتينات الركيزة إلى الخصائص الجزيئية ل Ub. كما يحتوي على Ub نفسه سبعة مخلفات ليسين (K) لمزيد من ubiquitylation, هناك مجموعة متنوعة غنية من أنواع سلسلة Ub مع أحجام مختلفة و / أو طبولوجيا11. على سبيل المثال، يمكن تعديل الركائز بواسطة جزيء Ub واحد في واحد (أحادية كل ubiquitylation) أو اليسينات متعددة (متعدد أحادية كل مكان)، وحتى من قبل سلاسل Ub (متعددة في كل مكان)11. تتشكل سلاسل Ub إما homo- أو heterotypically عبر نفس أو مختلف مخلفات ليسين من Ub، والتي يمكن أن تؤدي حتى في سلاسل Ub المتفرعة9. وهكذا، يؤدي انتشار البروتين في كل مكان إلى ترتيبات متنوعة من جزيئات Ub التي توفر معلومات محددة، على سبيل المثال،لتدهور أو تنشيط أو توطين البروتينات المترافقة12و13. وتتيح إشارات Ub المختلفة هذه إعادة برمجة سريعة لمسارات الإشارات الخلوية، وهو مطلب مهم لقدرة الخلية على الاستجابة للاحتياجات البيئية المتغيرة.
يرتبط الجانب المركزي من كل كمية من البروتين بمراقبة الجودة. يجب أن تتحلل البروتينات المطوية أو التالفة بشكل لا رجعة فيه واستبدالها بالبروتينات المركبة حديثا للحفاظ على التوازن البروتيني أو داء البروتيوستاسي14. مراقبة الجودة E3 ligase، CHIP، تتعاون مع المرافقين الجزيئية في تدهور Ub تعتمد على البروتينات التالفة9،15،16،17. وبصرف النظر عن ذلك، ينظم CHIP استقرار المرافق الموجه من الميوزين، UNC-45B (Unc-45 Homolog B)، والذي يتم تنسيقه بإحكام مع وظيفة العضلات والانحرافات عن المستويات المثلى تؤدي إلى اعتلال عضلي الإنسان18،19،20،21. يتم التوسط تدهور UNC-45B بواسطة بروتياسوم 26S بواسطة مرفق سلسلة متعددة Ub مرتبطة K489. في غياب البروتينات الركيزة، CHIP ينفذ لصناعة السيارات في كل مكان10،22،23، والتي هي سمة من RING / U- مربع E3 يوبيكتين ليغاز24،25 وتعتبر لتنظيم نشاط ليغانيس26. ساعد تطبيق طرق فحص الكبد في المختبر الموصوفة في هذه الورقة على تحديد إنزيمات E2 بشكل منهجي التي تتعاون مع CHIP لتعزيز تكوين سلاسل بولي يو بي الحرة و / أو التوائية في كل مكان من CHIP (القسم البروتوكول 2). وعلاوة على ذلك، لوحظ انتشار UNC-45B المعتمد على رقاقة، وهو ركيزة معروفة من اللوغاز E318،19 (القسم البروتوكول 3). وفي نهاية المطاف، تم رصد نقل Ub المنشط من ثيوستر Ub~E2 المعتمد على CHIP (قسم البروتوكول 4).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amershan Protran 0.1 &#181;m NC</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>10600000</td>
			<td>nitrocellulose membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CHIP</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2080</td>
			<td>Monoclonal rabbit anti-CHIP antibody, clone C3B6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MYC</td>
			<td>Roche</td>
			<td>OP10</td>
			<td>Monoclonal mouse anti-MYC antibody, clone 9E10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ubiquitin</td>
			<td>Upstate</td>
			<td>05-944</td>
			<td>Monoclonal mouse anti-Ub antibody, clone P4D1-A11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apyrase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6535-100UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP (10x)</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>12091903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6003-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8043.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6781.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P749.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3904.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDS sample buffer (4x)</td>
			<td>novex</td>
			<td>B0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5501-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4256.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MeOH</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>2,08,47,307</td>
			<td>100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milchpulver</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T145.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P029.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Antioxidant</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>NP0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Transfer buffer (20x)</td>
			<td>novex</td>
			<td>NP0006-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Page ruler plus</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>26619</td>
			<td>Protein ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RotiBlock</td>
			<td>Roth</td>
			<td>A151.1</td>
			<td>Blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (20%)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>1057.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1000 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1852196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1704150EDU</td>
			<td>Transfer system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4855.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9127.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UbcH Enzyme Set</td>
			<td>BostonBiochem</td>
			<td>K-980B</td>
			<td>E2 enzymes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubiquitin</td>
			<td>BostonBiochem</td>
			<td>U-100H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubiquitin-activating enzyme E1</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>BML-UW941U-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubiquitylation buffer (10x)</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>BML-KW9885-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman blotting paper</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1703969</td>
			<td>Extra thick filter paper</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro analysis of e3 ubiquitin ligase function

يمثل الارتباط التساهمي لليوبيكتين (Ub) ببقايا (بقايا) اليسين الداخلية لبروتين الركيزة ، وهي عملية يطلق عليها اسم ubiquitylation ، أحد أهم التعديلات بعد الترجمية في الكائنات الحية النواة. يتم التوسط في كل مكان من خلال سلسلة متتابعة من ثلاث فئات إنزيمية بما في ذلك الإنزيمات المنشطة لكل مكان (إنزيمات E1) ، والإنزيمات المترافقة مع كل مكان (إنزيمات E2) ، وليجات يوبيكتين (إنزيمات E3) ، وفي بعض الأحيان ، عوامل استطالة سلسلة الubiquitin (إنزيمات E4). هنا، يتم توفير بروتوكولات في المختبر لمقايسات كل مكان، والتي تسمح بتقييم نشاط E3 ubiquitin ligase، والتعاون بين أزواج E2-E3، واختيار الركيزة. يمكن فحص أزواج E2-E3 المتعاونة من خلال مراقبة توليد سلاسل متعددة البيكيتين المجانية و / أو التو-يوبيكيتيليج من ليجاز E3. يتم تعريف الركيزة في كل مكان عن طريق الربط الانتقائي لليغاز E3 ويمكن الكشف عنها عن طريق النشاف الغربي من رد الفعل في المختبر. وعلاوة على ذلك، يوصف اختبار تفريغ E2~Ub، وهو أداة مفيدة للتقييم المباشر للتعاون الوظيفي E2-E3. هنا، ويتبع نقل E3 تعتمد على كل مكان من إنزيم E2 المقابلة على الأحماض الأمينية الليسين الحرة (تقليد الركيزة في كل مكان) أو الليسينات الداخلية من ليغاز E3 نفسها (لصناعة السيارات في كل مكان). في الختام، يتم توفير ثلاثة بروتوكولات مختلفة في المختبر التي هي سريعة وسهلة لأداء لمعالجة E3 ligase وظيفة الحفاز.

لتحديد إنزيمات E2 التي تتعاون مع ubiquitin ligase CHIP ، تم اختبار مجموعة من المرشحين E2 في ردود الفعل الفردية في المختبر في كل مكان. تم رصد التعاون E2-E3 أزواج من خلال تشكيل منتجات كل مكان E3 تعتمد، أيلصناعة السيارات في كل مكان من ليغاز E3 وتشكيل البوليمرات Ub الحرة. تم تحليل منتجات كل مكان عن طريق...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function at JoVE.com

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

تقدم هذه الدراسة بروتوكولات مفصلة في اختبار التكميل في المختبر لتحليل النشاط الحفاز E3 ubiquitin ligaalytic. تم التعبير عن البروتينات المؤتلفة باستخدام أنظمة prokaryotic مثل ثقافة الإشريكية القولونية.

في فيترو تحليل E3 يوبيكيتين ليجاز وظيفة

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...

الهدف العام لهذا البروتوكول هو تحليل الجوانب الرئيسية الهامة لوظيفة E3 ligase ، بما في ذلك خصوصية إنزيم E2 ، واختيار الركيزة ونقل كل مكان. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي قابليتها للتطبيق على نطاق واسع ، حيث يمكن التعبير عن البروتينات من جميع المصادر eukaryotic بشكل مضمون ودراستها في المختبر دون الحاجة إلى معدات خاصة. عند استخدام تقنية إفراز الليسين لأول مرة، من المهم تحسين معلمات المقايسة، مثل تركيزات الإنزيم، لتحديد ظروف التصريف المثالية للليغاز E3 المفضل.لإجراء اختبار في المختبر لصناعة السيارات في كل مكان، وإعداد مخطط pipetting لاختبار القدرة الوظيفية لمختلف الإنزيمات E2 وإعداد مزيج رئيسي على الجليد لجميع ردود الفعل في كل مكان بالإضافة إلى رد فعل إضافي واحد. بعد ذلك ، أضف ميكرومولار واحد من إنزيمات E2 إلى الأنابيب المناسبة ، واحتضان العينات في دورة حرارية PCR لمدة ساعتين في ظل الظروف المشار إليها. بعد الحضانة، إضافة المخزن المؤقت عينة SDS إلى كل رد فعل ومزيج عن طريق pipetting عدة مرات.ثم يغلي على الفور العينات في 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق وتخزين البروتينات المشوهة في 20 درجة مئوية. لإجراء اختبار الركيزة في المختبر في كل مكان ، قم بإعداد مخطط الأنابيب لجميع ردود الفعل. بعد حساب كمية المزيج الرئيسي المطلوب لرد فعل واحد، قم بإعداد المزيج الرئيسي لجميع ردود الفعل على الجليد وإضافة المزيج الرئيسي إلى كل أنبوب.إضافة كل من الليجا E3 بشكل فردي. ثم احتضان العينات في دورة PCR الحرارية لمدة ساعتين كما هو موضح. في نهاية الحضانة، إضافة مرتين SDS عينة العازلة لكل رد فعل، مزيج عدة مرات عن طريق pipetting، وغلي العينات لمدة خمس دقائق في 95 درجة مئوية.لإجراء فحص تفريغ الليسين ، قم بإعداد مخطط الأنابيب لرد فعل الشحن واحتضان ردود فعل الشحن لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. لإيقاف رد فعل الشحن، أضف apyrase إلى تركيز نهائي قدره 1.8 وحدة لكل ملليلتر واحتضان التفاعل لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. في نهاية الحضانة، أضف EDTA إلى تركيز نهائي يبلغ 30 ملليمولار واستخدم الماء المقطر المزدوج لضبط حجم التفاعل إلى 30 ميكرولتر.لتفريغ E2 في كل مكان بواسطة E3 ، قم بإعداد خمسة أنابيب مطابقة للنقاط الزمنية للتجربة ، وإضافة 6.7 ميكرولتر من مخزن العينة المؤقت غير المخفض إلى كل أنبوب ، وإزالة ستة ميكرولترات من رد فعل الشحن المتوقفة من أنبوب نقطة الصفر الزمنية ، وضبط الحجم الإجمالي إلى 26.7 ميكرولتر. لإعداد ردود الفعل التفريغ، إضافة المياه المقطرة المزدوجة، عازلة في كل مكان، BSA، ليسين، E3 ligase وE2 اتهم لكل رد فعل. بعد الفترات الزمنية المحددة، نقل عينات 20 ميكرولتر من كل رد فعل التفريغ إلى أنبوب العينة المقابلة.ثم دوامة على الفور العينات، ووضعها في 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. في هذا التحليل التمثيلي الغربي، لم يكن CHIP غير النشط في كل مكان. ومع ذلك ، تم تشكيل منتجات UBIquitin المستقلة E3 في وجود CHIP غير نشط وفي غياب CHIP.تم نقل رقاقة البرية من النوع التلقائي في كل مكان عندما جنبا إلى جنب مع بروتينات UBE2D والأسر UBE2E، في حين تم إنتاج سلاسل البوليبيكيتين مجانا بالتعاون مع بروتينات الأسرة UBE2D ولكن ليس مع بروتينات الأسرة UBE2E. توجيه الربط من ubiquitin بواسطة UBE2N/V1 تشكيل سلاسل ubiquitin الحرة. ولوحظ أن الانتشار التلقائي للمركبات من طراز UNC-45B وانتشارها في كل مكان باستخدام رقاقة من النوع البري ولكن ليس مع المتحول غير النشط ل CHIP، مما يشير إلى أن UNC-45B يعمل كركيزة محفوظة ل CHIP.عندما تم تحليل النشاط الحفاز ل CHIP باستخدام فحص إفرازات اللسين ، كان وزن إنزيم UBE2D2 غير المشحون 17 كيلودالتون ، وكان وزن UBE2D2 المشحون مع جزيء واحد في كل مكان وزنا جزيئيا يبلغ حوالي 26 كيلودالطن. في الوقت 0، لوحظ العائد E2 مشحونة بالكامل. في وجود رقاقة غير نشطة ، تم الكشف عن تفريغ E3 المستقلة E3 باهتة من UBE2D2 ولكن ليس لصناعة السيارات في كل مكان من CHIP.في وجود نوع البرية CHIP، كان تفريغ UBE2D2 سريع والانتهاء في غضون 60 دقيقة، والسيارات في كل مكان من CHIP أشار إلى نقل كل مكان على بقايا ال ليسين الخاصة بها. نظرا لقدرة E2 المحدودة ، اعمل في أسرع وقت ممكن ، ثم تابع على الفور رد فعل التفريغ متبوعا ب SDS-PAGE والنشاف الغربي. بعد بروتوكولات التكتيل في المختبر هذه ، يمكن تحديد أنواع الربط المحددة في كل مكان من خلال فحص البقع الغربية بالأجسام المضادة الخاصة بالروابط.

Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

على أهمية تركيز البروتين الصحيح لحركية وتقارب في تحديد هيكل وظيفة التحليل

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

تحليل للوضع النمط الظاهري المورفولوجية كدالة للتركيز البروتين في الخميرة الناشيء.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

تحليل شفان نجمية طريق التفاعلات في المختبر فحوصات

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

في تحليل المختبر من PDZ التي تعتمد على المجمعات ضخم الجزيئات CFTR اشارة

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

تحليل سريع لالوراثية طلائي-الوسيطة اشارة خلال تجديد الشعر

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer's Vesicle

تحليل وظائف الجينات والتخيل ولدت سيليا من تدفق السوائل في حويصلة كوبفر

Internal organs such as the  heart, brain, and gut develop left-right (LR) asymmetries that are critical for  their normal functions1. Motile cilia are ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

سيرنا فحص لتحديد اليوبيكويتين واليوبيكويتين مثل المنظمين نظام مقررات تمهيدية البيولوجية في خلايا الثدييات مثقف

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

تحليل التركيب كليون وظيفة في الكلى اسماك الزرد الكبار

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

إعادة إعماره الوظيفية وآخر قناة قياسات تنقية Wildtype والمسخ CFTR البروتين

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

بروتوكول الآلي السريع لالعضلات تحليل الألياف السكان في الجرذ العضلات المقاطع العرضية عن طريق سلسلة الميوسين الثقيلة المناعية

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...