Name: in vitro analysis of e3 ubiquitin ligase function
Uploaded: 2021-05-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function at JoVE.com

Vi takker medlemmerne af vores laboratorium for kritisk diskussion og nyttige råd om manuskriptet. Vi beklager, at vi ikke har citeret værdifulde bidrag på grund af størrelsesbegrænsning. Dette arbejde støttes af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) - SFB 1218 - Projektnumber 269925409 og Cluster of Excellence EXC 229/ CECAD til TH. Dette arbejde blev finansieret af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) under Tysklands Excellence Strategy - EXC 2030 - 390661388 og - SFB 1218 - Projektnumber 269925409 til T.H. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der deutschen Exzellenzstrategie - EXC 2030 - 390661388 und - SFB 1218 - Projektnummer: 269925409 en T.H. gefördert.

1. Udarbejdelse af buffere og reagenser
BEMÆRK: Buffere og reagenser, der er manuelt forberedt i laboratoriet, er angivet nedenfor. Alle andre buffere og reagenser, der anvendes i protokollerne, blev købt fra forskellige kilder og anvendt i henhold til producentens anvisninger.
<ol><li>Forbered 10x fosfat-buffered saltvand (10x PBS). Til dette formål blandes 1,37 M natriumchlorid (NaCl), 27 mM kaliumchlorid (KCl), 80 mM disodium-hydrogen-fosfatdihydrat (Na2HPO4,2H<su...

<ol>
	<li>Kuhlbrodt, K., Mouysset, J., Hoppe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchestra+for+assembly+and+fate+of+polyubiquitin+chains.">Orchestra for assembly and fate of polyubiquitin chains.</a> Essays in Biochemistry. 41, 1-14 (2005).</li><li>Pickart, C. M., Eddins, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin:+structures,+functions,+mechanisms.">Ubiquitin: structures, functions, mechanisms.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1695 (1-3), 55-72 (2004).</li><li>Dye, B. T., Schulman, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanisms+underlying+posttranslational+modification+by+ubiquitin-like+proteins.">Structural mechanisms underlying posttranslational modification by ubiquitin-like proteins.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36, 131-150 (2007).</li><li>Koegl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+ubiquitination+factor,+E4,+is+involved+in+multiubiquitin+chain+assembly.">A novel ubiquitination factor, E4, is involved in multiubiquitin chain assembly.</a> Cell. 96 (5), 635-644 (1999).</li><li>Hoppe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiubiquitylation+by+E4+enzymes:+'one+size'+doesn't+fit+all.">Multiubiquitylation by E4 enzymes: 'one size' doesn't fit all.</a> Trends in Biochemical Sciences. 30 (4), 183-187 (2005).</li><li>Stewart, M. D., Ritterhoff, T., Klevit, R. E., Brzovic, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E2+enzymes:+more+than+just+the+middle+men.">E2 enzymes: more than just the middle men.</a> Cell Research. 26 (4), 423-440 (2016).</li><li>Clague, M. J., Heride, C., Urb&#233;, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+demographics+of+the+ubiquitin+system.">The demographics of the ubiquitin system.</a> Trends in Cell Biology. 25 (7), 417-426 (2015).</li><li>Buetow, L., Huang, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+catalysis+and+regulation+of+E3+ubiquitin+ligases.">Structural insights into the catalysis and regulation of E3 ubiquitin ligases.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (10), 626-642 (2016).</li><li>French, M. E., Koehler, C. F., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+functions+of+branched+ubiquitin+chains.">Emerging functions of branched ubiquitin chains.</a> Cell Discovery. 7, 6 (2021).</li><li>Hatakeyama, S., Yada, M., Matsumoto, M., Ishida, N., Nakayama, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U+box+proteins+as+a+new+family+of+ubiquitin-protein+ligases.">U box proteins as a new family of ubiquitin-protein ligases.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (35), 33111-33120 (2001).</li><li>Herhaus, L., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+ubiquitin+code+through+post-translational+modification.">Expanding the ubiquitin code through post-translational modification.</a> EMBO Reports. 16 (9), 1071-1083 (2015).</li><li>Deshaies, R. J., Joazeiro, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RING+domain+E3+ubiquitin+ligases.">RING domain E3 ubiquitin ligases.</a> Annual Review of Biochemistry. 78, 399-434 (2009).</li><li>Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lingering+mysteries+of+ubiquitin-chain+assembly.">Lingering mysteries of ubiquitin-chain assembly.</a> Cell. 124 (1), 27-34 (2006).</li><li>Hoppe, T., Cohen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organismal+protein+homeostasis+mechanisms.">Organismal protein homeostasis mechanisms.</a> Genetics. 215 (4), 889-901 (2020).</li><li>Okiyoneda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+protein+quality+control+removes+unfolded+CFTR+from+the+plasma+membrane.">Peripheral protein quality control removes unfolded CFTR from the plasma membrane.</a> Science. 329 (5993), 805-810 (1997).</li><li>Tawo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ubiquitin+ligase+CHIP+integrates+proteostasis+and+aging+by+regulation+of+insulin+receptor+turnover.">The Ubiquitin ligase CHIP integrates proteostasis and aging by regulation of insulin receptor turnover.</a> Cell. 169 (3), 470-482 (2017).</li><li>Albert, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHIP+ubiquitylates+NOXA+and+induces+its+lysosomal+degradation+in+response+to+DNA+damage.">CHIP ubiquitylates NOXA and induces its lysosomal degradation in response to DNA damage.</a> Cell Death and Disease. 11 (9), 740 (2020).</li><li>Hoppe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+myosin-directed+chaperone+UNC-45+by+a+novel+E3/E4-multiubiquitylation+complex+in+C.+elegans.">Regulation of the myosin-directed chaperone UNC-45 by a novel E3/E4-multiubiquitylation complex in C. elegans.</a> Cell. 118 (3), 337-349 (2004).</li><li>Kim, J., L&#246;we, T., Hoppe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+quality+control+gets+muscle+into+shape.">Protein quality control gets muscle into shape.</a> Trends in Cell Biology. 18 (6), 264-272 (2008).</li><li>Janiesch, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-selective+chaperone+CDC-48/p97+links+myosin+assembly+to+human+myopathy.">The ubiquitin-selective chaperone CDC-48/p97 links myosin assembly to human myopathy.</a> Nature Cell Biology. 9 (4), 379-390 (2007).</li><li>Donkervoort, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+variants+in+the+myosin+chaperone+UNC-45B+cause+progressive+myopathy+with+eccentric+cores.">Pathogenic variants in the myosin chaperone UNC-45B cause progressive myopathy with eccentric cores.</a> The American Journal of Human Genetics. 107 (6), 1078-1095 (2020).</li><li>Murata, S., Minami, Y., Minami, M., Chiba, T., Tanaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHIP+is+a+chaperone-dependent+E3+ligase+that+ubiquitylates+unfolded+protein.">CHIP is a chaperone-dependent E3 ligase that ubiquitylates unfolded protein.</a> EMBO Reports. 2 (12), 1133-1138 (2001).</li><li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHIP+is+a+U-box-dependent+E3+ubiquitin+ligase:+identification+of+Hsc70+as+a+target+for+ubiquitylation.">CHIP is a U-box-dependent E3 ubiquitin ligase: identification of Hsc70 as a target for ubiquitylation.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (64), 42938-42944 (2001).</li><li>Yang, Y., Yu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+apoptosis:+the+ubiquitous+way.">Regulation of apoptosis: the ubiquitous way.</a> The FASEB Journal. 17 (8), 790-799 (2003).</li><li>Lamothe, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRAF6+ubiquitin+ligase+is+essential+for+RANKL+signaling+and+osteoclast+differentiation.">TRAF6 ubiquitin ligase is essential for RANKL signaling and osteoclast differentiation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communication. 359 (4), 1044-1049 (2007).</li><li>Amemiya, Y., Azmi, P., Seth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoubiquitination+of+BCA2+RING+E3+ligase+regulates+its+own+stability+and+affects+cell+migration.">Autoubiquitination of BCA2 RING E3 ligase regulates its own stability and affects cell migration.</a> Molecular Cancer Research. 6 (9), 1385 (2008).</li><li>Brzovic, P. S., Lissounov, A., Christensen, D. E., Hoyt, D. W., Klevit, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+UbcH5/ubiquitin+noncovalent+complex+is+required+for+processive+BRCA1-directed+ubiquitination.">A UbcH5/ubiquitin noncovalent complex is required for processive BRCA1-directed ubiquitination.</a> Molecular Cell. 21 (6), 873-880 (2006).</li><li>Sakata, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+UbcH5b~ubiquitin+intermediate:+Insight+into+the+formation+of+the+self-assembled+E2~Ub+conjugates.">Crystal structure of UbcH5b~ubiquitin intermediate: Insight into the formation of the self-assembled E2~Ub conjugates.</a> Structure. 18 (1), 138-147 (2010).</li><li>Eddins, M. J., Carlile, C. M., Gomez, K. M., Pickart, C. M., Wolberger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mms2-Ubc13+covalently+bound+to+ubiquitin+reveals+the+structural+basis+of+linkage-specific+polyubiquitin+chain+formation.">Mms2-Ubc13 covalently bound to ubiquitin reveals the structural basis of linkage-specific polyubiquitin chain formation.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 13 (10), 915-920 (2006).</li><li>Buetow, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+a+primed+RING+E3-E2+ubiquitin+complex+by+non-covalent+ubiquitin.">Activation of a primed RING E3-E2 ubiquitin complex by non-covalent ubiquitin.</a> Molecular Cell. 58 (2), 297-310 (2015).</li><li>Dou, H., Buetow, L., Sibbet, G. J., Cameron, K., Huang, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BIRC7-E2+ubiquitin+conjugate+structure+reveals+the+mechanism+of+ubiquitin+transfer+by+a+RING+dimer.">BIRC7-E2 ubiquitin conjugate structure reveals the mechanism of ubiquitin transfer by a RING dimer.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 19 (9), 876-883 (2012).</li><li>McKenna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncovalent+interaction+between+ubiquitin+and+the+human+DNA+repair+protein+Mms2+is+required+for+Ubc13-mediated+polyubiquitination.">Noncovalent interaction between ubiquitin and the human DNA repair protein Mms2 is required for Ubc13-mediated polyubiquitination.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (43), 40120-40125 (2001).</li><li>Plechanovov&#225;, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+ubiquitylation+by+dimeric+RING+ligase+RNF4.">Mechanism of ubiquitylation by dimeric RING ligase RNF4.</a> Nature Structural Biology. 18 (9), 1052-1059 (2011).</li><li>Pierce, N. W., Kleiger, G., Shan, S. O., Deshaies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+sequential+polyubiquitylation+on+a+millisecond+timescale.">Detection of sequential polyubiquitylation on a millisecond timescale.</a> Nature. 462 (7273), 615-619 (2009).</li><li>Jain, A. K., Barton, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+p53:+TRIM24+enters+the+RING.">Regulation of p53: TRIM24 enters the RING.</a> Cell Cycle. 8 (22), 3668-3674 (2009).</li><li>Swatek, K. N., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+modifications.">Ubiquitin modifications.</a> Cell Research. 26, 399-422 (2016).</li><li>Yan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+K63-linked+polyubiquitination+in+cardiac+hypertrophy.">The role of K63-linked polyubiquitination in cardiac hypertrophy.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (10), 4558-4567 (2018).</li><li>Dammer, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyubiquitin+linkage+profiles+in+three+models+of+proteolytic+stress+suggest+the+etiology+of+Alzheimer+disease.">Polyubiquitin linkage profiles in three models of proteolytic stress suggest the etiology of Alzheimer disease.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 10457-10465 (2011).</li></ol>

Dette papir beskriver grundlæggende in vitro allestedsnærværende metoder til analyse af E3 ligase funktion. Når der udføres in vitro allestedsnærværende assays, Bør det overvejes, at nogle E2 enzymer kan udføre auto-allestedsnærværende på grund af angrebet af deres aktive cystein på deres egne lysin rester, der er placeret i nærheden af det aktive sted30. For at omgå dette problem anbefales brugen af en E2-mutant, hvor de respektive lysinrester udveksles til argini...

Allestedsnærværende er den proces, hvorved Ub er kovalent forbundet med et substratprotein1. Ub-modifikationen katalyseres af successive enzymatiske reaktioner, der involverer virkningen af tre forskellige enzymklasser, dvs.Ub-aktiverende enzymer (E1'er), Ub-konjugaterende enzymer (E2s), Ub ligaser (E3'er) og muligvis Ub kædeforlængelsesfaktorer (E4s)2,3,4,5. Efter adenosin triphosphat (ATP) - og magnesium (Mg2 +)-afhængige aktivering af Ub ved E1, det aktive sted cystein af E1 angriber C-terminal glycin af Ub, danner en thioester kompleks (Ub ~ E1). Den energi, der trækkes fra ATP hydrolyse forårsager Ub at opnå en høj energi overgangstilstand, som opretholdes i hele følgende enzym kaskade. Dernæst overfører E2-enzymet den aktiverede Ub til sin indre katalytiske cystein og danner derved en forbigående Ub ~ E2 thioesterbinding. Efterfølgende overføres Ub til substrateproteinet.
Dette kan gøres på to måder. Enten E3 ligase kan først binde sig til E2, eller E3 ligase kan direkte binde Ub. Sidstnævnte måde resulterer i dannelsen af en E3 ~ Ub mellemliggende. I begge tilfælde er Ub forbundet med substrateproteinet ved dannelse af en isopeptidbinding mellem C-terminal carboxylgruppen af Ub og lysin Ɛ-aminogruppen af substratet6. Det menneskelige genom koder to E1'ere, ca. 40 E2'ere og mere end 600 putative ubiquitin ligaser7. Baseret på Ub overførsel mekanisme af E3, Ub ligaser er opdelt i tre kategorier, der involverer Homologe til E6AP C-Terminus (HECT)-type, Virkelig interessant nyt gen (RING)/U-box-type, og RING mellem RING (RBR)-type ligaser8. I denne undersøgelse anvendes U-boxen, der indeholder ligase, Carboxyl Terminus af HSC70-interacting Protein (CHIP), som et repræsentativt E3-enzym. I modsætning til HECT-type E3 enzymer, der danner Ub ~ E3 thioesters, U-box domæne CHIP binder E2 ~ Ub og fremmer den efterfølgende Ub / substrat overførsel direkte fra E2 enzym8,9. Baseret på U-boxens betydning for enzymatisk funktion anvendes en inaktiv CHIP U-box mutant, CHIP (H260Q), som en kontrol. CHIP(H260Q) undlader at binde sig til sin cognate E2s, og dermed mister sin E3 ligase aktivitet10.
Protein allestedsnærværende spiller en afgørende rolle i reguleringen af et væld af cellulære begivenheder i eukaryote celler. Mangfoldigheden af cellulære resultater, der fremmes af den reversible fastgørelse af Ub molekyler til substratproteiner, kan tilskrives Ub's molekylære egenskaber. Da Ub selv indeholder syv lysin (K) rester til yderligere allestedsnærværende, er der et rigt udvalg af Ub kædetyper med forskellige størrelser og / eller topologier11. For eksempel kan substrater ændres af et enkelt Ub-molekyle ved en (mono-allestedsnærværende) eller flere lysiner (multi mono-allestedsnærværende) og endda af Ub-kæder (poly-allestedsnærværende)11. Ub kæder dannes enten homo- eller heterotypisk via de samme eller forskellige lysinrester af Ub, hvilket endda kan resultere i forgrenede Ub-kæder9. Således fører protein allestedsnærværende til forskellige arrangementer af Ub molekyler, der giver specifikke oplysninger, f.eks.,for nedbrydning, aktivering eller lokalisering af konjugerede proteiner12,13. Disse forskellige Ub-signaler muliggør hurtig omprogrammering af cellulære signalveje, hvilket er et vigtigt krav for cellens evne til at reagere på skiftende miljøbehov.
Et centralt aspekt af allestedsnærværende er relateret til protein kvalitetskontrol. Misfoldede eller uigenkaldeligt beskadigede proteiner skal nedbrydes og erstattes af nyligt syntetiserede proteiner for at opretholde protein homøostase eller proteostase14. Kvalitetskontrol E3 ligase, CHIP, samarbejder med molekylære chaperoner i Ub-afhængige nedbrydning af beskadigede proteiner9,15,16,17. Bortset fra det regulerer CHIP stabiliteten af den myosin-ledede chaperone, UNC-45B (Unc-45 Homolog B), som er tæt koordineret med muskelfunktion og afvigelser fra de optimale niveauer fører til menneskelig myopati18,19,20,21. Nedbrydning af UNC-45B ved 26S proteasomet medieres ved fastgørelse af en K48-forbundet poly-Ub kæde9. I mangel af substratproteiner udfører CHIP auto-allestedsnærværende10,22,23, som er karakteristisk for RING /U-box E3 ubiquitin ligaser24,25 og anses for at regulere ligaseaktivitet26. Anvendelse af in vitro allestedsnærværende assay metoder beskrevet i dette papir bidraget til systematisk at identificere E2 enzymer, der går sammen med CHIP til at fremme dannelsen af frie poly-Ub kæder og / eller auto-allestedsnærværende af CHIP (protokol afsnit 2). Desuden blev CHIP-afhængige allestedsnærværende UNC-45B observeret, som er et kendt substrat af E3 ligase18,19 (protokol afsnit 3). I sidste ende blev CHIP-afhængig overførsel af aktiveret Ub fra Ub ~ E2 thioester overvåget (protokolafsnit 4).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amershan Protran 0.1 &#181;m NC</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>10600000</td>
			<td>nitrocellulose membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CHIP</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2080</td>
			<td>Monoclonal rabbit anti-CHIP antibody, clone C3B6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MYC</td>
			<td>Roche</td>
			<td>OP10</td>
			<td>Monoclonal mouse anti-MYC antibody, clone 9E10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ubiquitin</td>
			<td>Upstate</td>
			<td>05-944</td>
			<td>Monoclonal mouse anti-Ub antibody, clone P4D1-A11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apyrase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6535-100UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP (10x)</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>12091903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6003-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8043.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6781.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P749.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3904.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDS sample buffer (4x)</td>
			<td>novex</td>
			<td>B0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5501-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4256.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MeOH</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>2,08,47,307</td>
			<td>100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milchpulver</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T145.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P029.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Antioxidant</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>NP0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Transfer buffer (20x)</td>
			<td>novex</td>
			<td>NP0006-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Page ruler plus</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>26619</td>
			<td>Protein ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RotiBlock</td>
			<td>Roth</td>
			<td>A151.1</td>
			<td>Blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (20%)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>1057.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1000 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1852196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1704150EDU</td>
			<td>Transfer system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4855.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9127.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UbcH Enzyme Set</td>
			<td>BostonBiochem</td>
			<td>K-980B</td>
			<td>E2 enzymes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubiquitin</td>
			<td>BostonBiochem</td>
			<td>U-100H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubiquitin-activating enzyme E1</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>BML-UW941U-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubiquitylation buffer (10x)</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>BML-KW9885-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman blotting paper</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1703969</td>
			<td>Extra thick filter paper</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro analysis of e3 ubiquitin ligase function

Den kovalente fastgørelse af allestedsnærværende (Ub) til indre lysinrester (r) af et substratprotein, en proces, der kaldes allestedsnærværende, repræsenterer en af de vigtigste postoversættelsesmæssige modifikationer i eukaryote organismer. Allestedsnærværende ubiquitylation medieres af en sekventiel kaskade af tre enzymklasser, herunder allestedsnærværende aktiverende enzymer (E1 enzymer), allestedsnærværende konjugaterende enzymer (E2 enzymer) og allestedsnærværende ligaser (E3 enzymer), og nogle gange, ubiquitin-kæde forlængelse faktorer (E4 enzymer). Her leveres in vitro-protokoller for allestedsnærværende analyser, som gør det muligt at vurdere E3-ubiquitin ligaseaktivitet, samarbejdet mellem E2-E3-par og substratvalg. Samarbejdende E2-E3 par kan screenes ved at overvåge dannelsen af frie poly-ubiquitin kæder og / eller auto-allestedsnærværende af E3 ligase. Substrat allestedsnærværende er defineret ved selektiv binding af E3 ligase og kan påvises ved vestlig blotting af in vitro reaktion. Desuden er der beskrevet en E2~Ub-udledningsanalyse, som er et nyttigt redskab til direkte vurdering af funktionelt E2-E3-samarbejde. Her følges den E3-afhængige overførsel af allestedsnærværende fra det tilsvarende E2-enzym til frie lysin aminosyrer (efterligne substrat allestedsnærværende) eller interne lysiner af selve E3 ligase (auto-allestedsnærværende). Afslutningsvis er tre forskellige in vitro protokoller, der er hurtige og nemme at udføre for at løse E3 ligase katalytisk funktionalitet.

For at identificere E2 enzymer, der samarbejder med ubiquitin ligase CHIP, blev et sæt E2-kandidater testet i individuelle in vitro allestedsnærværende reaktioner. Samarbejdende E2-E3 par blev overvåget af dannelsen af E3-afhængige allestedsnærværende produkter, dvs.auto-allestedsnærværende af E3 ligase og dannelsen af frie Ub polymerer. Allestedsnærværende produkter blev analyseret ved vestlig blotting. Datafortolkning er baseret på størrelsessammenligningen af de resulterende proteinbånd...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function at JoVE.com

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

Denne undersøgelse giver detaljerede in vitro allestedsnærværende assay protokoller til analyse af E3 ubiquitin ligase katalytisk aktivitet. Rekombinante proteiner blev udtrykt ved hjælp af prokaryote systemer såsom Escherichia coli kultur.

In vitro Analyse af E3 Ubiquitin Ligase Funktion

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...

Det overordnede mål med denne protokol er at analysere vigtige nøgleaspekter af E3 ligase funktion, herunder E2 enzym specificitet, substrat udvælgelse og ubiquitin overførsel. Den største fordel ved denne teknik er dens brede anvendelighed, da proteiner fra alle eukaryotekilder kan rekombinant udtrykkes og studeres in vitro uden behov for specielt udstyr. Når du bruger lysin udledning teknik for første gang, Er det vigtigt at optimere assay parametre, såsom enzym koncentrationer, at identificere de ideelle udledning betingelser for E3 ligase valg.For at udføre en in vitro auto-allestedsnærværende assay, oprette en pipetter ordning for at teste den funktionelle evne af forskellige E2 enzymer og forberede en master mix på is for alle de allestedsnærværende reaktioner plus en ekstra reaktion. Derefter tilsættes en mikromolar af E2-enzymer til de relevante rør og inkuberes prøverne i en PCR termisk cycler i to timer under de angivne forhold. Efter inkubationen tilsættes SDS-prøvebufferen til hver reaktion og blandes ved pipetter flere gange.Derefter koges prøverne straks ved 95 grader Celsius i fem minutter og opbevar de denaturerede proteiner ved 20 grader Celsius. For at udføre en in vitro substrat allestedsnærværende analyse, forberede pipetter ordningen for alle de reaktioner. Efter beregning af mængden af master mix kræves for en reaktion, forberede master mix for alle de reaktioner på is og tilføje master mix til hvert rør.Tilføj de respektive E3 ligaser individuelt. Inkuber derefter prøverne i PCR-termisk cycler i to timer som demonstreret. Ved inkubationens afslutning tilsættes to gange SDS-prøvebufferen til hver reaktion, blandes flere gange ved pipettering og koger prøverne i fem minutter ved 95 grader Celsius.For at udføre en lysinudladningsanalyse skal du konfigurere pipetterordningen til opladningsreaktionen og inkubere opladningsreaktionerne i 15 minutter ved 37 grader Celsius. For at stoppe opladningsreaktionen tilsættes apyras til en endelig koncentration på 1,8 enheder pr. milliliter og inkuberes reaktionen i fem minutter ved stuetemperatur. Ved inkubationens afslutning tilsættes EDTA til en endelig koncentration på 30 millimolar og bruger dobbeltdestilleret vand til at justere reaktionens volumen til 30 mikroliter.For at aflade E2 allestedsnærværende med E3, oprette fem rør svarende til tidpunkterne for eksperimentet, tilføje 6,7 mikroliter af ikke-reducerende prøvebuffer til hvert rør, fjerne seks mikroliters af den standsede opladningsreaktion fra tidspunktet nul rør og justere det samlede volumen til 26,7 mikroliter. For at opsætte udledningsreaktionerne tilsættes dobbeltdestilleret vand, allestedsnærværende ærnærværende buffer, BSA, lysin, E3 ligase og den ladede E2 til hver reaktion. Efter de valgte tidsperioder overføres 20 mikroliterprøver fra hver udledningsreaktion til det tilsvarende prøverør.Derefter straks hvirvle prøverne, og læg dem på 70 grader Celsius i 10 minutter. I denne repræsentative Western blot-analyse blev den inaktive CHIP ikke auto-allestedsnærværende. De E3-uafhængige allestedsnærværende produkter blev imidlertid dannet i nærværelse af inaktiv CHIP og i mangel af CHIP.Den vilde CHIP blev auto-allestedsnærværende, når den kombineres med proteinerne i UBE2D- og UBE2E-familierne, mens de frie polyubiquitinkæder blev produceret i samarbejde med proteinerne i UBE2D-familien, men ikke med proteinerne i UBE2E-familien. Bindingen af ubiquitin af UBE2N/V1 rettet dannelsen af frie allestedsnærværende kæder. Auto-allestedsnærværende og allestedsnærværende UNC-45B blev observeret med vilde-type CHIP, men ikke med den inaktive mutant af CHIP, hvilket indikerer, at UNC-45B fungerer som en konserveret substrat for CHIP.Når den katalytiske aktivitet chip blev analyseret ved hjælp af en lysin udledning assay, den urpladede UBE2D2 enzym havde en molekylvægt på 17 kilodaltons og den ladede UBE2D2 med en enkelt allestedsnærværende molekyle havde en molekylvægt på ca 26 kilodaltons. På tidspunkt 0 blev hele det opkrævede E2-udbytte observeret. I nærværelse af inaktiv CHIP blev der fundet en svag E3 ligase-uafhængig udledning af UBE2D2, men ikke auto-allestedsnærværende chip.I nærværelse af wild-type CHIP, udledning af UBE2D2 var hurtig og afsluttet inden for 60 minutter, og auto-allestedsnærværende CHIP angivet en overførsel af allestedsnærværende på sine egne lysin rester. På grund af den begrænsede E2-evne skal du arbejde så hurtigt som muligt og straks fortsætte med udledningsreaktionen efterfulgt af SDS-PAGE og Western blotting. Efter disse in vitro allestedsnærværende protokoller, de specifikke allestedsnærværende forbindelsestyper kan identificeres ved sondering de vestlige blots med linkage-specifikke antistoffer.

Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

In vitro-analyse af PDZ-afhængige CFTR Makromolekylære signalering Komplekser

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hurtig genetisk analyse af Epithelial-mesenkyme Signaling Under Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer's Vesicle

Analyse af genfunktioner og Visualisering af Cilia er genereret Fluid Flow i Kupffer s vesikel

Internal organs such as the  heart, brain, and gut develop left-right (LR) asymmetries that are critical for  their normal functions1. Motile cilia are ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

siRNA Screening at identificere Ubiquitin og ubiquitinlignende System Regulators Biologisk Pathways i dyrkede pattedyrceller

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

Analyse af Nephron opbygning og funktion i Voksen Zebrafisk Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

Funktionel Opløsning og kanalaktivitet Målinger af renset Vildtype og Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

En hurtig Automatiseret Protokol for muskelfiber Population Analysis i rottemuskel tværsnit Brug af myosin Heavy Chain Immunhistokemi

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...