Name: in vitro analysis of e3 ubiquitin ligase function
Uploaded: 2021-05-14T14:00:00
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Wir danken den Mitgliedern unseres Labors für die kritische Diskussion und hilfreiche Beratung zum Manuskript. Wir entschuldigen uns dafür, dass wir aufgrund von Größenbeschränkungen keine wertvollen Beiträge zitiert haben. Diese Arbeit wird gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) - SFB 1218 - Projektnummer 269925409 und Exzellenzcluster EXC 229/ CECAD bis TH. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der Exzellenzstrategie - EXC 2030 - 390661388 und - SFB 1218 - Projektnummer 269925409 to T.H. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der deutschen Exzellenzstrategie - EXC 2030 - 390661388 und - SFB 1218 - Projektnummer: 269925409 an T.H. gefördert.

1. Herstellung von Puffern und Reagenzien
HINWEIS: Puffer und Reagenzien, die manuell im Labor hergestellt wurden, sind unten aufgeführt. Alle anderen Puffer und Reagenzien, die in den Protokollen verwendet wurden, wurden aus verschiedenen Quellen gekauft und gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet.
<ol><li>10x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (10x PBS) zubereiten. Zu diesem Zweck mischen Sie 1,37 M Natriumchlorid (NaCl), 27 mM Kaliumchlorid (KCl), 80 mM Dinatrium-Wasserstoffpho...

<ol>
	<li>Kuhlbrodt, K., Mouysset, J., Hoppe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchestra+for+assembly+and+fate+of+polyubiquitin+chains.">Orchestra for assembly and fate of polyubiquitin chains.</a> Essays in Biochemistry. 41, 1-14 (2005).</li><li>Pickart, C. M., Eddins, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin:+structures,+functions,+mechanisms.">Ubiquitin: structures, functions, mechanisms.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1695 (1-3), 55-72 (2004).</li><li>Dye, B. T., Schulman, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanisms+underlying+posttranslational+modification+by+ubiquitin-like+proteins.">Structural mechanisms underlying posttranslational modification by ubiquitin-like proteins.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36, 131-150 (2007).</li><li>Koegl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+ubiquitination+factor,+E4,+is+involved+in+multiubiquitin+chain+assembly.">A novel ubiquitination factor, E4, is involved in multiubiquitin chain assembly.</a> Cell. 96 (5), 635-644 (1999).</li><li>Hoppe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiubiquitylation+by+E4+enzymes:+'one+size'+doesn't+fit+all.">Multiubiquitylation by E4 enzymes: 'one size' doesn't fit all.</a> Trends in Biochemical Sciences. 30 (4), 183-187 (2005).</li><li>Stewart, M. D., Ritterhoff, T., Klevit, R. E., Brzovic, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E2+enzymes:+more+than+just+the+middle+men.">E2 enzymes: more than just the middle men.</a> Cell Research. 26 (4), 423-440 (2016).</li><li>Clague, M. J., Heride, C., Urb&#233;, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+demographics+of+the+ubiquitin+system.">The demographics of the ubiquitin system.</a> Trends in Cell Biology. 25 (7), 417-426 (2015).</li><li>Buetow, L., Huang, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+catalysis+and+regulation+of+E3+ubiquitin+ligases.">Structural insights into the catalysis and regulation of E3 ubiquitin ligases.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (10), 626-642 (2016).</li><li>French, M. E., Koehler, C. F., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+functions+of+branched+ubiquitin+chains.">Emerging functions of branched ubiquitin chains.</a> Cell Discovery. 7, 6 (2021).</li><li>Hatakeyama, S., Yada, M., Matsumoto, M., Ishida, N., Nakayama, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U+box+proteins+as+a+new+family+of+ubiquitin-protein+ligases.">U box proteins as a new family of ubiquitin-protein ligases.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (35), 33111-33120 (2001).</li><li>Herhaus, L., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+ubiquitin+code+through+post-translational+modification.">Expanding the ubiquitin code through post-translational modification.</a> EMBO Reports. 16 (9), 1071-1083 (2015).</li><li>Deshaies, R. J., Joazeiro, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RING+domain+E3+ubiquitin+ligases.">RING domain E3 ubiquitin ligases.</a> Annual Review of Biochemistry. 78, 399-434 (2009).</li><li>Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lingering+mysteries+of+ubiquitin-chain+assembly.">Lingering mysteries of ubiquitin-chain assembly.</a> Cell. 124 (1), 27-34 (2006).</li><li>Hoppe, T., Cohen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organismal+protein+homeostasis+mechanisms.">Organismal protein homeostasis mechanisms.</a> Genetics. 215 (4), 889-901 (2020).</li><li>Okiyoneda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+protein+quality+control+removes+unfolded+CFTR+from+the+plasma+membrane.">Peripheral protein quality control removes unfolded CFTR from the plasma membrane.</a> Science. 329 (5993), 805-810 (1997).</li><li>Tawo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ubiquitin+ligase+CHIP+integrates+proteostasis+and+aging+by+regulation+of+insulin+receptor+turnover.">The Ubiquitin ligase CHIP integrates proteostasis and aging by regulation of insulin receptor turnover.</a> Cell. 169 (3), 470-482 (2017).</li><li>Albert, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHIP+ubiquitylates+NOXA+and+induces+its+lysosomal+degradation+in+response+to+DNA+damage.">CHIP ubiquitylates NOXA and induces its lysosomal degradation in response to DNA damage.</a> Cell Death and Disease. 11 (9), 740 (2020).</li><li>Hoppe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+myosin-directed+chaperone+UNC-45+by+a+novel+E3/E4-multiubiquitylation+complex+in+C.+elegans.">Regulation of the myosin-directed chaperone UNC-45 by a novel E3/E4-multiubiquitylation complex in C. elegans.</a> Cell. 118 (3), 337-349 (2004).</li><li>Kim, J., L&#246;we, T., Hoppe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+quality+control+gets+muscle+into+shape.">Protein quality control gets muscle into shape.</a> Trends in Cell Biology. 18 (6), 264-272 (2008).</li><li>Janiesch, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-selective+chaperone+CDC-48/p97+links+myosin+assembly+to+human+myopathy.">The ubiquitin-selective chaperone CDC-48/p97 links myosin assembly to human myopathy.</a> Nature Cell Biology. 9 (4), 379-390 (2007).</li><li>Donkervoort, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+variants+in+the+myosin+chaperone+UNC-45B+cause+progressive+myopathy+with+eccentric+cores.">Pathogenic variants in the myosin chaperone UNC-45B cause progressive myopathy with eccentric cores.</a> The American Journal of Human Genetics. 107 (6), 1078-1095 (2020).</li><li>Murata, S., Minami, Y., Minami, M., Chiba, T., Tanaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHIP+is+a+chaperone-dependent+E3+ligase+that+ubiquitylates+unfolded+protein.">CHIP is a chaperone-dependent E3 ligase that ubiquitylates unfolded protein.</a> EMBO Reports. 2 (12), 1133-1138 (2001).</li><li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHIP+is+a+U-box-dependent+E3+ubiquitin+ligase:+identification+of+Hsc70+as+a+target+for+ubiquitylation.">CHIP is a U-box-dependent E3 ubiquitin ligase: identification of Hsc70 as a target for ubiquitylation.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (64), 42938-42944 (2001).</li><li>Yang, Y., Yu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+apoptosis:+the+ubiquitous+way.">Regulation of apoptosis: the ubiquitous way.</a> The FASEB Journal. 17 (8), 790-799 (2003).</li><li>Lamothe, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRAF6+ubiquitin+ligase+is+essential+for+RANKL+signaling+and+osteoclast+differentiation.">TRAF6 ubiquitin ligase is essential for RANKL signaling and osteoclast differentiation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communication. 359 (4), 1044-1049 (2007).</li><li>Amemiya, Y., Azmi, P., Seth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoubiquitination+of+BCA2+RING+E3+ligase+regulates+its+own+stability+and+affects+cell+migration.">Autoubiquitination of BCA2 RING E3 ligase regulates its own stability and affects cell migration.</a> Molecular Cancer Research. 6 (9), 1385 (2008).</li><li>Brzovic, P. 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M., Wolberger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mms2-Ubc13+covalently+bound+to+ubiquitin+reveals+the+structural+basis+of+linkage-specific+polyubiquitin+chain+formation.">Mms2-Ubc13 covalently bound to ubiquitin reveals the structural basis of linkage-specific polyubiquitin chain formation.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 13 (10), 915-920 (2006).</li><li>Buetow, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+a+primed+RING+E3-E2+ubiquitin+complex+by+non-covalent+ubiquitin.">Activation of a primed RING E3-E2 ubiquitin complex by non-covalent ubiquitin.</a> Molecular Cell. 58 (2), 297-310 (2015).</li><li>Dou, H., Buetow, L., Sibbet, G. J., Cameron, K., Huang, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BIRC7-E2+ubiquitin+conjugate+structure+reveals+the+mechanism+of+ubiquitin+transfer+by+a+RING+dimer.">BIRC7-E2 ubiquitin conjugate structure reveals the mechanism of ubiquitin transfer by a RING dimer.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 19 (9), 876-883 (2012).</li><li>McKenna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncovalent+interaction+between+ubiquitin+and+the+human+DNA+repair+protein+Mms2+is+required+for+Ubc13-mediated+polyubiquitination.">Noncovalent interaction between ubiquitin and the human DNA repair protein Mms2 is required for Ubc13-mediated polyubiquitination.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (43), 40120-40125 (2001).</li><li>Plechanovov&#225;, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+ubiquitylation+by+dimeric+RING+ligase+RNF4.">Mechanism of ubiquitylation by dimeric RING ligase RNF4.</a> Nature Structural Biology. 18 (9), 1052-1059 (2011).</li><li>Pierce, N. W., Kleiger, G., Shan, S. O., Deshaies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+sequential+polyubiquitylation+on+a+millisecond+timescale.">Detection of sequential polyubiquitylation on a millisecond timescale.</a> Nature. 462 (7273), 615-619 (2009).</li><li>Jain, A. K., Barton, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+p53:+TRIM24+enters+the+RING.">Regulation of p53: TRIM24 enters the RING.</a> Cell Cycle. 8 (22), 3668-3674 (2009).</li><li>Swatek, K. N., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+modifications.">Ubiquitin modifications.</a> Cell Research. 26, 399-422 (2016).</li><li>Yan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+K63-linked+polyubiquitination+in+cardiac+hypertrophy.">The role of K63-linked polyubiquitination in cardiac hypertrophy.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (10), 4558-4567 (2018).</li><li>Dammer, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyubiquitin+linkage+profiles+in+three+models+of+proteolytic+stress+suggest+the+etiology+of+Alzheimer+disease.">Polyubiquitin linkage profiles in three models of proteolytic stress suggest the etiology of Alzheimer disease.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 10457-10465 (2011).</li></ol>

Dieser Beitrag beschreibt grundlegende In-vitro-Ubiquitylierungsmethoden für die Analyse der E3-Ligasefunktion. Bei der Durchführung von In-vitro-Ubiquitylierungsassayles sollte berücksichtigt werden, dass einige E2-Enzyme aufgrund des Angriffs ihres aktiven Cysteins auf ihre eigenen Lysinreste, die sich in unmittelbarer Nähe des aktiven Zentrums befinden, eine Autoubiquitylierung durchführen können30. Um dieses Problem zu umgehen, empfiehlt sich der Einsatz einer E2-Mutan...

Ubiquitylierung ist der Prozess, bei dem Ub kovalent an einSubstratprotein 1gebunden ist. Die Ub-Modifikation wird durch aufeinanderfolgende enzymatische Reaktionen katalysiert, die die Wirkung von drei verschiedenen Enzymklassen beinhalten, d.h.Ub-aktivierende Enzyme (E1s), Ub-konjugierende Enzyme (E2s), Ub-Ligasen (E3s) und möglicherweise Ub-Ketten-Dehnungsfaktoren (E4s)2,3,4,5. Nach Adenosintriphosphat (ATP)- undMagnesium (Mg2+)-abhängiger Aktivierung von Ub durch E1 greift das aktive Zentrum Cystein von E1 das C-terminale Glycin von Ub an und bildet einen Thioesterkomplex (Ub~E1). Die aus der ATP-Hydrolyse gewonnene Energie bewirkt, dass der Ub einen hochenergetischen Übergangszustand erreicht, der während der folgenden Enzymkaskade aufrechterhalten wird. Als nächstes überträgt das E2-Enzym das aktivierte Ub auf sein internes katalytisches Cystein und bildet dadurch eine transiente Ub~ E2-Thioesterbindung. Anschließend wird Ub auf das Substratprotein übertragen.
Dies kann auf zwei Arten geschehen. Entweder kann die E3-Ligase zuerst an E2 binden, oder die E3-Ligase kann Ub direkt binden. Der letztere Weg führt zur Bildung eines E3 ~ Ub-Zwischenprodukts. In beiden Fällen ist Ub mit dem Substratprotein durch Bildung einer Isopeptidbindung zwischen der C-terminalen Carboxylgruppe von Ub und der Lysin-Ɛ-Aminogruppe desSubstrats 6verbunden. Das menschliche Genom kodiert für zwei E1s, etwa 40 E2s und mehr als 600 mutmaßliche Ubiquitinligosen7. Basierend auf dem Ub-Transfermechanismus des E3 werden Ub-Ligasen in drei Kategorien unterteilt, darunter Homolog zum E6AP C-Terminus (HECT)-Typ, Really Interesting New Gene (RING) / U-Box-Typ und RING zwischen RING (RBR) -TypLigasen 8. In dieser Studie wird die Ligase enthaltende U-Box, Carboxyl Terminus of HSC70-interacting Protein (CHIP), als repräsentatives E3-Enzym verwendet. Im Gegensatz zu E3-Enzymen vom HECT-Typ, die Ub~E3-Thioester bilden, bindet die U-Box-Domäne von CHIP E2~Ub und fördert den anschließenden Ub/Substrat-Transfer direkt vom E2-Enzym8,9. Basierend auf der Bedeutung der U-Box für die enzymatische Funktion wird eine inaktive CHIP U-Box-Mutante, CHIP(H260Q), als Kontrolle verwendet. CHIP(H260Q) bindet nicht an seine verwandten E2s und verliert somit seine E3-Ligaseaktivität10.
Die Proteinubiquitylierung spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulierung einer Vielzahl zellulärer Ereignisse in eukaryotischen Zellen. Die Vielfalt der zellulären Ergebnisse, die durch die reversible Bindung von Ub-Molekülen an Substratproteine gefördert werden, kann auf die molekularen Eigenschaften von Ub zurückgeführt werden. Da Ub selbst sieben Lysin (K)-Reste zur weiteren Ubiquitylierung enthält, gibt es eine reiche Vielfalt an Ub-Kettentypen mit unterschiedlichen Größen und/oder Topologien11. Zum Beispiel können Substrate durch ein einzelnes Ub-Molekül an einem (Mono-Ubiquitylierung) oder mehreren Lysinen (Multi-Mono-Ubiquitylierung) und sogar durch Ub-Ketten (Poly-Ubiquitylierung) modifiziert werden11. Ub-Ketten werden entweder homo- oder heterotypisch über die gleichen oder unterschiedliche Lysinreste von Ub gebildet, was sogar zu verzweigten Ub-Ketten führen könnte9. Somit führt die Proteinubiquitylierung zu vielfältigen Anordnungen von Ub-Molekülen, die spezifische Informationen liefern, z.B.für den Abbau, die Aktivierung oder die Lokalisation konjugierter Proteine12,13. Diese unterschiedlichen Ub-Signale ermöglichen eine schnelle Reprogrammierung zellulärer Signalwege, was eine wichtige Voraussetzung für die Fähigkeit der Zelle ist, auf sich ändernde Umweltbedürfnisse zu reagieren.
Ein zentraler Aspekt der Ubiquitylierung bezieht sich auf die Proteinqualitätskontrolle. Fehlgefaltete oder irreversibel geschädigte Proteine müssen abgebaut und durch neu synthetisierte Proteine ersetzt werden, um die Proteinhomöostase oder Proteostase aufrechtzuerhalten14. Die Qualitätskontrolle E3 Ligase, CHIP, arbeitet mit molekularen Chaperonen beim Ub-abhängigen Abbau geschädigter Proteine9,15,16,17. Darüber hinaus reguliert CHIP die Stabilität des Myosin-gerichteten Chaperons UNC-45B (Unc-45 Homolog B), das eng auf die Muskelfunktion abgestimmt ist und Abweichungen von den optimalen Werten führen zur menschlichen Myopathie18,19,20,21. Der Abbau von UNC-45B durch das 26S-Proteasom wird durch Anheftung einer K48-verknüpften Poly-Ub-Kette9vermittelt. In Abwesenheit von Substratproteinen führt CHIP eine Autoubiquitylierung10,22,23durch,die für die RING/ U-Box E3-Ubiquitinligosen24,25 charakteristisch ist und die Ligaseaktivitätreguliert 26. Die Anwendung der in diesem Artikel beschriebenen In-vitro-Ubiquitylierungs-Assay-Methoden trug dazu bei, E2-Enzyme systematisch zu identifizieren, die sich mit CHIP zusammenschließen, um die Bildung freier Poly-Ub-Ketten und/oder die Autoubiquitylierung von CHIP zu fördern (Protokollabschnitt 2). Weiterhin wurde eine CHIP-abhängige Ubiquitylierung von UNC-45B beobachtet, welches ein bekanntes Substrat der E3-Ligase18,19 ist (Protokollabschnitt 3). Letztlich wurde die CHIP-abhängige Übertragung von aktiviertem Ub vom Ub~E2-Thioester überwacht (Protokollabschnitt 4).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amershan Protran 0.1 &#181;m NC</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>10600000</td>
			<td>nitrocellulose membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CHIP</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2080</td>
			<td>Monoclonal rabbit anti-CHIP antibody, clone C3B6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MYC</td>
			<td>Roche</td>
			<td>OP10</td>
			<td>Monoclonal mouse anti-MYC antibody, clone 9E10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ubiquitin</td>
			<td>Upstate</td>
			<td>05-944</td>
			<td>Monoclonal mouse anti-Ub antibody, clone P4D1-A11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apyrase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6535-100UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP (10x)</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>12091903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6003-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8043.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6781.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P749.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3904.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDS sample buffer (4x)</td>
			<td>novex</td>
			<td>B0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5501-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4256.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MeOH</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>2,08,47,307</td>
			<td>100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milchpulver</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T145.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P029.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Antioxidant</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>NP0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Transfer buffer (20x)</td>
			<td>novex</td>
			<td>NP0006-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Page ruler plus</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>26619</td>
			<td>Protein ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RotiBlock</td>
			<td>Roth</td>
			<td>A151.1</td>
			<td>Blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (20%)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>1057.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1000 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1852196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1704150EDU</td>
			<td>Transfer system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4855.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9127.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UbcH Enzyme Set</td>
			<td>BostonBiochem</td>
			<td>K-980B</td>
			<td>E2 enzymes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubiquitin</td>
			<td>BostonBiochem</td>
			<td>U-100H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubiquitin-activating enzyme E1</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>BML-UW941U-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubiquitylation buffer (10x)</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>BML-KW9885-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman blotting paper</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1703969</td>
			<td>Extra thick filter paper</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro analysis of e3 ubiquitin ligase function

Die kovalente Bindung von Ubiquitin (Ub) an interne Lysinreste eines Substratproteins, ein Prozess, der als Ubiquitylierung bezeichnet wird, stellt eine der wichtigsten posttranslationalen Modifikationen in eukaryotischen Organismen dar. Die Ubiquitylierung wird durch eine sequentielle Kaskade von drei Enzymklassen vermittelt, darunter Ubiquitin-aktivierende Enzyme (E1-Enzyme), Ubiquitin-konjugierende Enzyme (E2-Enzyme) und Ubiquitin-Ligasen (E3-Enzyme) und manchmal Ubiquitin-Ketten-Dehnungsfaktoren (E4-Enzyme). Hier werden In-vitro-Protokolle für Ubiquitylierungsassays bereitgestellt, die die Beurteilung der E3-Ubiquitin-Ligase-Aktivität, die Zusammenarbeit zwischen E2-E3-Paaren und die Substratauswahl ermöglichen. Kooperierende E2-E3-Paare können durch Überwachung der Erzeugung freier Poly-Ubiquitin-Ketten und/oder der Autoubiquitylierung der E3-Ligase gescreent werden. Die Substratubiquitylierung wird durch selektive Bindung der E3-Ligase definiert und kann durch Western Blotting der In-vitro-Reaktion nachgewiesen werden. Weiterhin wird ein E2~Ub Entladungsassay beschrieben, der ein nützliches Werkzeug zur direkten Beurteilung der funktionellen E2-E3 Kooperation ist. Dabei folgt der E3-abhängige Transfer von Ubiquitin aus dem entsprechenden E2-Enzym auf freie Lysin-Aminosäuren (Nachahmung der Substrat-Ubiquitylierung) oder interne Lysine der E3-Ligase selbst (Auto-Ubiquitylierung). Zusammenfassend werden drei verschiedene In-vitro-Protokolle bereitgestellt, die schnell und einfach durchzuführen sind, um die katalytische Funktionalität der E3-Ligase zu adressieren.

Um E2-Enzyme zu identifizieren, die mit dem Ubiquitin-Ligase-CHIP zusammenarbeiten, wurde ein Satz von E2-Kandidaten in einzelnen In-vitro-Ubiquitylierungsreaktionen getestet. Kooperierende E2-E3-Paare wurden durch die Bildung von E3-abhängigen Ubiquitylierungsprodukten, d.h.Autoubiquitylierung der E3-Ligase und die Bildung von freien Ub-Polymeren, überwacht. Die Ubiquitylierungsprodukte wurden durch Western Blotting analysiert. Die Dateninterpretation basiert auf dem Größenvergleich der resultieren...

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In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

Die vorliegende Studie liefert detaillierte In-vitro-Ubiquitylierungs-Assay-Protokolle für die Analyse der katalytischen Aktivität der E3-Ubiquitin-Ligase. Rekombinante Proteine wurden mit prokaryotischen Systemen wie der Escherichia coli-Kultur exprimiert.

In vitro Analyse der E3-Ubiquitin-Ligase-Funktion

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, wichtige Schlüsselaspekte der E3-Ligasefunktion zu analysieren, einschließlich E2-Enzymspezifität, Substratauswahl und Ubiquitintransfer. Der Hauptvorteil dieser Technik ist ihre breite Anwendbarkeit, da Proteine aus allen eukaryotischen Quellen rekombinant exprimiert und in vitro untersucht werden können, ohne dass spezielle Geräte erforderlich sind. Bei der erstmaligen Anwendung der Lysin-Entladungstechnik ist es wichtig, Assay-Parameter wie Enzymkonzentrationen zu optimieren, um die idealen Austragsbedingungen für die E3-Ligase ihrer Wahl zu identifizieren.Um einen In-vitro-Autoubiquitylierungsassaylat durchzuführen, richten Sie ein Pipettierschema ein, um die Funktionsfähigkeit verschiedener E2-Enzyme zu testen und eine Mastermischung auf Eis für alle Ubiquitylierungsreaktionen plus eine zusätzliche Reaktion vorzubereiten. Als nächstes fügen Sie ein Mikromolar von E2-Enzymen in die entsprechenden Röhrchen hinzu und inkubieren Sie die Proben in einem PCR-Thermocycler für zwei Stunden unter den angegebenen Bedingungen. Nach der Inkubation SDS-Probenpuffer zu jeder Reaktion hinzufügen und mehrmals durch Pipettieren mischen.Dann kochen Sie die Proben sofort bei 95 Grad Celsius für fünf Minuten und lagern Sie die denaturierten Proteine bei 20 Grad Celsius. Um einen In-vitro-Substrat-Ubiquitylierungstest durchzuführen, bereiten Sie das Pipettierschema für alle Reaktionen vor. Nachdem Sie die Menge an Master-Mix berechnet haben, die für eine Reaktion benötigt wird, bereiten Sie die Master-Mischung für alle Reaktionen auf Eis vor und fügen Sie die Master-Mischung zu jeder Tube hinzu.Fügen Sie die jeweiligen E3-Ligasen einzeln hinzu. Anschließend werden die Proben wie demonstriert zwei Stunden lang im PCR-Thermocycler inkubiert. Am Ende der Inkubation zwei Mal SDS-Probenpuffer zu jeder Reaktion hinzufügen, mehrmals durch Pipettieren mischen und die Proben fünf Minuten lang bei 95 Grad Celsius kochen.Um einen Lysin-Entladungsassay durchzuführen, richten Sie das Pipettierschema für die Ladereaktion ein und inkubieren Sie die Ladereaktionen für 15 Minuten bei 37 Grad Celsius. Um die Ladereaktion zu stoppen, fügen Sie Apyrase in eine Endkonzentration von 1,8 Einheiten pro Milliliter hinzu und inkubieren Sie die Reaktion fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Am Ende der Inkubation EDTA in eine Endkonzentration von 30 Millimol geben und das Volumen der Reaktion mit doppelt destilliertem Wasser auf 30 Mikroliter einstellen.Um die E2-Ubiquitylierung durch E3 zu entladen, richten Sie fünf Röhrchen ein, die den Zeitpunkten für das Experiment entsprechen, fügen Sie jedem Röhrchen 6,7 Mikroliter nicht reduzierenden Probenpuffer hinzu, entfernen Sie sechs Mikroliter der gestoppten Ladereaktion aus dem Zeitpunkt-Null-Röhrchen und stellen Sie das Gesamtvolumen auf 26,7 Mikroliter ein. Um die Entladungsreaktionen einzurichten, fügen Sie zu jeder Reaktion doppelt destilliertes Wasser, Ubiquitylierungspuffer, BSA, Lysin, E3-Ligase und das geladene E2 hinzu. Nach den ausgewählten Zeiträumen werden 20-Mikroliter-Proben aus jeder Entladungsreaktion in das entsprechende Probenröhrchen überführt.Dann wirbeln Sie die Proben sofort und legen Sie sie für 10 Minuten bei 70 Grad Celsius auf. In dieser repräsentativen Western-Blot-Analyse war der inaktive CHIP nicht auto-ubiquityliert. Die E3-unabhängigen Ubiquitin-Produkte wurden jedoch in Gegenwart von inaktivem CHIP und in Abwesenheit von CHIP gebildet.Der Wildtyp-CHIP wurde in Kombination mit den Proteinen der UBE2D- und UBE2E-Familien auto-ubiquityliert, während die freien Polyubiquitin-Ketten in Zusammenarbeit mit den Proteinen der UBE2D-Familie, aber nicht mit den Proteinen der UBE2E-Familie hergestellt wurden. Die Bindung des Ubiquitins durch UBE2N/V1 steuerte die Bildung freier Ubiquitinketten. Die Autoubiquitylierung und Ubiquitylierung von UNC-45B wurde mit Wildtyp-CHIP, aber nicht mit der inaktiven Mutante von CHIP beobachtet, was darauf hindeutet, dass UNC-45B als konserviertes Substrat für CHIP fungiert.Wenn die katalytische Aktivität von CHIP mit einem Lysin-Entladungsassay analysiert wurde, hatte das ungeladene UBE2D2-Enzym ein Molekulargewicht von 17 Kilodalton und das geladene UBE2D2 mit einem einzelnen Ubiquitinmolekül ein Molekulargewicht von etwa 26 Kilodalton. Zum Zeitpunkt 0 wurde die gesamte geladene E2-Ausbeute beobachtet. In Gegenwart von inaktivem CHIP wurde eine schwache E3-ligaseunabhängige Entladung von UBE2D2, aber keine Autoubiquitylierung von CHIP nachgewiesen.In Gegenwart von Wildtyp-CHIP war die Entladung von UBE2D2 schnell und innerhalb von 60 Minuten abgeschlossen, und die Autoubiquitylierung von CHIP zeigte einen Transfer von Ubiquitin auf seine eigenen Lysinreste an. Aufgrund der begrenzten E2-Fähigkeit arbeiten Sie so schnell wie möglich und fahren Sie sofort mit der Entladungsreaktion fort, gefolgt von SDS-PAGE und Western Blotting. Nach diesen In-vitro-Ubiquitylierungsprotokollen können die spezifischen Typen der Ubiquitylierung identifiziert werden, indem die Western Blots mit verknüpfungsspezifischen Antikörpern untersucht werden.

Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

Die Bedeutung der richtigen Protein-Konzentration für Kinetik und Affinity Bestimmung in Struktur-Funktions-Analyse

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Forschung

Biologie

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Die Analyse der Entwicklung eines morphologischen Phänotyp als Funktion der Protein-Konzentration in Hefezellen

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analyse von Schwann-Astrozyten Wechselwirkungen mit In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

In-vitro-Analyse der PDZ-abhängigen CFTR Makromolekulare Signalkomplexe

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Schnelle Genetische Analyse von epithelial-mesenchymale Signaling Während Haarregeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer's Vesicle

Analyse der Genfunktion und Visualisierung von Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer-Vesicle

Internal organs such as the  heart, brain, and gut develop left-right (LR) asymmetries that are critical for  their normal functions1. Motile cilia are ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

siRNA Screening zu Ubiquitin und Ubiquitin-ähnlichen System Regler der biologischen Stoffwechselwege in kultivierten Säugerzellen identifizieren

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

Analyse der Nephron Zusammensetzung und Funktion im erwachsenen Zebrafisch Nieren

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

Funktionelle Rekonstitution und Kanalaktivitätsmessungen von gereinigtem Wildtyp und mutierten CFTR-Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

Ein schnelles automatisiertes Protokoll zur Muskelfaser Populationsanalyse in Rattenmuskelquerschnitte Mit Myosin Heavy Chain Immunhistochemie

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...