Name: in vitro analysis of e3 ubiquitin ligase function
Uploaded: 2021-05-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function at JoVE.com

אנו מודים לחברי המעבדה שלנו על דיון ביקורתי ועצות מועילות על כתב היד. אנו מתנצלים על כך שלא ציינו תרומות יקרות ערך בשל מגבלת גודל. עבודה זו נתמכת על ידי דויטשה Forschungsgemeinschaft (DFG, קרן המחקר הגרמנית) - SFB 1218 - Projektnumber 269925409 ואשכול מצוינות EXC 229 / CECAD ל- TH. עבודה זו מומנה על ידי דויטשה פורשונגסגמיינסכאפט (DFG, קרן המחקר הגרמנית) תחת אסטרטגיית המצוינות של גרמניה - EXC 2030 - 390661388 ו - SFB 1218 - Projektnumber 269925409 to T.H. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der deutschen Exzellenzstrategie - EXC 2030 - 390661388 und - SFB 1218 - Projektnummer: 269925409 a T.H. gefördert.

1. הכנת חוצצים וריאגנטים
הערה: מאגרים ותרוממים שהוכנו ידנית במעבדה מפורטים להלן. כל המאגרים ושאר הריאגנטים המשמשים בפרוטוקולים נרכשו ממקורות שונים ושימשו בהתאם להוראות היצרנים.
<ol><li>הכן תמיסת מלח 10x חוצץ פוספט (10x PBS). לשם כך, יש לערבב 1.37 M נתרן כלורי (NaCl), 27 mM אשלגן כלורי (KCl), 80 מ...

<ol>
	<li>Kuhlbrodt, K., Mouysset, J., Hoppe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchestra+for+assembly+and+fate+of+polyubiquitin+chains.">Orchestra for assembly and fate of polyubiquitin chains.</a> Essays in Biochemistry. 41, 1-14 (2005).</li><li>Pickart, C. M., Eddins, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin:+structures,+functions,+mechanisms.">Ubiquitin: structures, functions, mechanisms.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1695 (1-3), 55-72 (2004).</li><li>Dye, B. T., Schulman, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanisms+underlying+posttranslational+modification+by+ubiquitin-like+proteins.">Structural mechanisms underlying posttranslational modification by ubiquitin-like proteins.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36, 131-150 (2007).</li><li>Koegl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+ubiquitination+factor,+E4,+is+involved+in+multiubiquitin+chain+assembly.">A novel ubiquitination factor, E4, is involved in multiubiquitin chain assembly.</a> Cell. 96 (5), 635-644 (1999).</li><li>Hoppe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiubiquitylation+by+E4+enzymes:+'one+size'+doesn't+fit+all.">Multiubiquitylation by E4 enzymes: 'one size' doesn't fit all.</a> Trends in Biochemical Sciences. 30 (4), 183-187 (2005).</li><li>Stewart, M. D., Ritterhoff, T., Klevit, R. E., Brzovic, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E2+enzymes:+more+than+just+the+middle+men.">E2 enzymes: more than just the middle men.</a> Cell Research. 26 (4), 423-440 (2016).</li><li>Clague, M. J., Heride, C., Urb&#233;, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+demographics+of+the+ubiquitin+system.">The demographics of the ubiquitin system.</a> Trends in Cell Biology. 25 (7), 417-426 (2015).</li><li>Buetow, L., Huang, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+catalysis+and+regulation+of+E3+ubiquitin+ligases.">Structural insights into the catalysis and regulation of E3 ubiquitin ligases.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (10), 626-642 (2016).</li><li>French, M. E., Koehler, C. F., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+functions+of+branched+ubiquitin+chains.">Emerging functions of branched ubiquitin chains.</a> Cell Discovery. 7, 6 (2021).</li><li>Hatakeyama, S., Yada, M., Matsumoto, M., Ishida, N., Nakayama, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U+box+proteins+as+a+new+family+of+ubiquitin-protein+ligases.">U box proteins as a new family of ubiquitin-protein ligases.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (35), 33111-33120 (2001).</li><li>Herhaus, L., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+ubiquitin+code+through+post-translational+modification.">Expanding the ubiquitin code through post-translational modification.</a> EMBO Reports. 16 (9), 1071-1083 (2015).</li><li>Deshaies, R. J., Joazeiro, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RING+domain+E3+ubiquitin+ligases.">RING domain E3 ubiquitin ligases.</a> Annual Review of Biochemistry. 78, 399-434 (2009).</li><li>Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lingering+mysteries+of+ubiquitin-chain+assembly.">Lingering mysteries of ubiquitin-chain assembly.</a> Cell. 124 (1), 27-34 (2006).</li><li>Hoppe, T., Cohen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organismal+protein+homeostasis+mechanisms.">Organismal protein homeostasis mechanisms.</a> Genetics. 215 (4), 889-901 (2020).</li><li>Okiyoneda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+protein+quality+control+removes+unfolded+CFTR+from+the+plasma+membrane.">Peripheral protein quality control removes unfolded CFTR from the plasma membrane.</a> Science. 329 (5993), 805-810 (1997).</li><li>Tawo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ubiquitin+ligase+CHIP+integrates+proteostasis+and+aging+by+regulation+of+insulin+receptor+turnover.">The Ubiquitin ligase CHIP integrates proteostasis and aging by regulation of insulin receptor turnover.</a> Cell. 169 (3), 470-482 (2017).</li><li>Albert, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHIP+ubiquitylates+NOXA+and+induces+its+lysosomal+degradation+in+response+to+DNA+damage.">CHIP ubiquitylates NOXA and induces its lysosomal degradation in response to DNA damage.</a> Cell Death and Disease. 11 (9), 740 (2020).</li><li>Hoppe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+myosin-directed+chaperone+UNC-45+by+a+novel+E3/E4-multiubiquitylation+complex+in+C.+elegans.">Regulation of the myosin-directed chaperone UNC-45 by a novel E3/E4-multiubiquitylation complex in C. elegans.</a> Cell. 118 (3), 337-349 (2004).</li><li>Kim, J., L&#246;we, T., Hoppe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+quality+control+gets+muscle+into+shape.">Protein quality control gets muscle into shape.</a> Trends in Cell Biology. 18 (6), 264-272 (2008).</li><li>Janiesch, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-selective+chaperone+CDC-48/p97+links+myosin+assembly+to+human+myopathy.">The ubiquitin-selective chaperone CDC-48/p97 links myosin assembly to human myopathy.</a> Nature Cell Biology. 9 (4), 379-390 (2007).</li><li>Donkervoort, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+variants+in+the+myosin+chaperone+UNC-45B+cause+progressive+myopathy+with+eccentric+cores.">Pathogenic variants in the myosin chaperone UNC-45B cause progressive myopathy with eccentric cores.</a> The American Journal of Human Genetics. 107 (6), 1078-1095 (2020).</li><li>Murata, S., Minami, Y., Minami, M., Chiba, T., Tanaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHIP+is+a+chaperone-dependent+E3+ligase+that+ubiquitylates+unfolded+protein.">CHIP is a chaperone-dependent E3 ligase that ubiquitylates unfolded protein.</a> EMBO Reports. 2 (12), 1133-1138 (2001).</li><li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHIP+is+a+U-box-dependent+E3+ubiquitin+ligase:+identification+of+Hsc70+as+a+target+for+ubiquitylation.">CHIP is a U-box-dependent E3 ubiquitin ligase: identification of Hsc70 as a target for ubiquitylation.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (64), 42938-42944 (2001).</li><li>Yang, Y., Yu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+apoptosis:+the+ubiquitous+way.">Regulation of apoptosis: the ubiquitous way.</a> The FASEB Journal. 17 (8), 790-799 (2003).</li><li>Lamothe, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRAF6+ubiquitin+ligase+is+essential+for+RANKL+signaling+and+osteoclast+differentiation.">TRAF6 ubiquitin ligase is essential for RANKL signaling and osteoclast differentiation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communication. 359 (4), 1044-1049 (2007).</li><li>Amemiya, Y., Azmi, P., Seth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoubiquitination+of+BCA2+RING+E3+ligase+regulates+its+own+stability+and+affects+cell+migration.">Autoubiquitination of BCA2 RING E3 ligase regulates its own stability and affects cell migration.</a> Molecular Cancer Research. 6 (9), 1385 (2008).</li><li>Brzovic, P. S., Lissounov, A., Christensen, D. E., Hoyt, D. W., Klevit, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+UbcH5/ubiquitin+noncovalent+complex+is+required+for+processive+BRCA1-directed+ubiquitination.">A UbcH5/ubiquitin noncovalent complex is required for processive BRCA1-directed ubiquitination.</a> Molecular Cell. 21 (6), 873-880 (2006).</li><li>Sakata, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+UbcH5b~ubiquitin+intermediate:+Insight+into+the+formation+of+the+self-assembled+E2~Ub+conjugates.">Crystal structure of UbcH5b~ubiquitin intermediate: Insight into the formation of the self-assembled E2~Ub conjugates.</a> Structure. 18 (1), 138-147 (2010).</li><li>Eddins, M. J., Carlile, C. M., Gomez, K. M., Pickart, C. M., Wolberger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mms2-Ubc13+covalently+bound+to+ubiquitin+reveals+the+structural+basis+of+linkage-specific+polyubiquitin+chain+formation.">Mms2-Ubc13 covalently bound to ubiquitin reveals the structural basis of linkage-specific polyubiquitin chain formation.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 13 (10), 915-920 (2006).</li><li>Buetow, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+a+primed+RING+E3-E2+ubiquitin+complex+by+non-covalent+ubiquitin.">Activation of a primed RING E3-E2 ubiquitin complex by non-covalent ubiquitin.</a> Molecular Cell. 58 (2), 297-310 (2015).</li><li>Dou, H., Buetow, L., Sibbet, G. J., Cameron, K., Huang, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BIRC7-E2+ubiquitin+conjugate+structure+reveals+the+mechanism+of+ubiquitin+transfer+by+a+RING+dimer.">BIRC7-E2 ubiquitin conjugate structure reveals the mechanism of ubiquitin transfer by a RING dimer.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 19 (9), 876-883 (2012).</li><li>McKenna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncovalent+interaction+between+ubiquitin+and+the+human+DNA+repair+protein+Mms2+is+required+for+Ubc13-mediated+polyubiquitination.">Noncovalent interaction between ubiquitin and the human DNA repair protein Mms2 is required for Ubc13-mediated polyubiquitination.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (43), 40120-40125 (2001).</li><li>Plechanovov&#225;, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+ubiquitylation+by+dimeric+RING+ligase+RNF4.">Mechanism of ubiquitylation by dimeric RING ligase RNF4.</a> Nature Structural Biology. 18 (9), 1052-1059 (2011).</li><li>Pierce, N. W., Kleiger, G., Shan, S. O., Deshaies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+sequential+polyubiquitylation+on+a+millisecond+timescale.">Detection of sequential polyubiquitylation on a millisecond timescale.</a> Nature. 462 (7273), 615-619 (2009).</li><li>Jain, A. K., Barton, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+p53:+TRIM24+enters+the+RING.">Regulation of p53: TRIM24 enters the RING.</a> Cell Cycle. 8 (22), 3668-3674 (2009).</li><li>Swatek, K. N., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+modifications.">Ubiquitin modifications.</a> Cell Research. 26, 399-422 (2016).</li><li>Yan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+K63-linked+polyubiquitination+in+cardiac+hypertrophy.">The role of K63-linked polyubiquitination in cardiac hypertrophy.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (10), 4558-4567 (2018).</li><li>Dammer, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyubiquitin+linkage+profiles+in+three+models+of+proteolytic+stress+suggest+the+etiology+of+Alzheimer+disease.">Polyubiquitin linkage profiles in three models of proteolytic stress suggest the etiology of Alzheimer disease.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 10457-10465 (2011).</li></ol>

מאמר זה מתאר שיטות בסיסיות במבחנה בכל העולם לניתוח של פונקציית ligase E3. בעת ביצוע במבחנה בכל מקום בדיקות, יש לקחת בחשבון כי כמה אנזימי E2 יכולים לבצע auto-בכל מקום בשל ההתקפה של ציסטאין הפעיל שלהם על שאריות ליצין שלהם הממוקמים בסמיכות לאתר הפעיל30. כדי לעקוף בעיה זו, השימוש ...

בכל מקום הוא התהליך שבו Ub מקושר באופן קוולנטי לחלבוןמצע 1. שינוי Ub מזורז על ידי תגובות אנזימטיות רצופות המערבות פעולה של שלושה מחלקות אנזימים שונות, כלומר., אנזימים מפעילי Ub (E1s), אנזימים ההולכים ub (E2s), ליגסות Ub (E3s) ואולי גורמי התארכות שרשרת Ub (E4s)2,3,4,5. לאחר אדנוסין טריפוספט (ATP)- ומגנזיום (Mg2 +) הפעלה תלויה של Ub על ידי E1, האתר הפעיל ציסטאין של E1 תוקף את גליצין C-מסוף של Ub, ויוצר קומפלקס thioester (Ub ~ E1). האנרגיה שנשאבת מהידרוליזה ATP גורמת ל- Ub להגיע למצב מעבר באנרגיה גבוהה, אשר נשמר לאורך מפל האנזים הבא. לאחר מכן, האנזים E2 מעביר את Ub מופעל לציסטאין הקטליטי הפנימי שלו, ובכך יוצר קשר Ub ~ E2 תיאסטר חולף. לאחר מכן, Ub מועבר לחלבון המצע.
זה יכול להיעשות בשתי דרכים. ייתכן שהליגאז E3 ייקשר תחילה ל- E2, או שליגאז E3 יכול לאגד ישירות את Ub. הדרך האחרונה גורמת להיווצרות של E3 ~ Ub ביניים. בכל מקרה, Ub מקושר לחלבון המצע על ידי היווצרות קשר איזופפטיד בין קבוצת קרבוקסיל C-terminal של Ub לבין קבוצת האמינו ליסין Ɛ של המצע6. הגנום האנושי מקודד שני E1s, כ 40 E2s, ויותר מ 600 פוטטיבי בכל מקום רצועות7. בהתבסס על מנגנון העברת Ub של E3, רצועות Ub מחולקות לשלוש קטגוריות המערבות הומולוגית לסוג E6AP C-Terminus (HECT), גן חדש מעניין באמת (RING)/U-box- type, וטבעת בין רצועות מסוג RING (RBR)8. במחקר זה, U-box המכיל ליגאז, טרמינל קרבוקסיל של חלבון אינטראקציה HSC70 (CHIP), משמש כאנזים E3 מייצג. בניגוד לאנזימי E3 מסוג HECT היוצרים Ub ~ E3 thioesters, תחום U-box של CHIP קושר E2 ~ Ub ומקדם את העברת Ub / מצע הבאים ישירות מן האנזים E28,9. בהתבסס על החשיבות של תיבת U עבור פונקציה אנזימטית, מוטציה U-box שבב לא פעיל, CHIP(H260Q), משמש כפקד. CHIP(H260Q) אינו מצליח להיקשר ל- E2s הקוגנייט שלו, ובכך מאבד את פעילות ה- E3 ligase10.
בכל מקום חלבון ממלא תפקיד מכריע בוויסות שפע של אירועים תאיים בתאים אאוקריוטים. ניתן לייחס את מגוון התוצאות התאיות המקודמות על ידי צירוף הפיך של מולקולות Ub לחלבונים מצעיים למאפיינים המולקולריים של Ub. כמו Ub עצמו מכיל שבעה שאריות ליסן (K) עבור כל כולה נוספת, יש מגוון עשיר של סוגי שרשרת Ub עם גדלים שונים ו / או טופולוגיות11. לדוגמה, מצעים יכולים להשתנות על ידי מולקולת Ub אחת באחת (מונו-נביקולציה) או ליזינים מרובים (multi-mono-ubiquitylation), ואפילו על ידי שרשראות Ub (פולי-ubiquitylation)11. שרשראות Ub נוצרות הומו או הטרוטיפיות באמצעות שאריות ליצין זהות או שונות של Ub, מה שעלול אף לגרום לרשתות Ub מסועפות9. לכן, כל החלבון מוביל לסידורים מגוונים של מולקולות Ub המספקות מידע ספציפי, למשל., עבור השפלה, הפעלה או לוקליזציה של חלבונים מצומדים12,13. אותות Ub שונים אלה מאפשרים תכנות מחדש מהיר של מסלולי איתות תאיים, המהווה דרישה חשובה ליכולתו של התא להגיב לצרכים הסביבתיים המשתנים.
היבט מרכזי של בכל מקום קשור לבקרת איכות חלבון. חלבונים תותומים או פגומים באופן בלתי הפיך חייבים להיות מושפלים ומוחלפים בחלבונים מסונתזים חדשים כדי לשמור על הומאוסטזיס חלבון או פרוטאוסטזיס14. בקרת האיכות E3 ligase, CHIP, משתפת פעולה עם מלווים מולקולריים בהשפלה תלוית Ub של חלבונים פגומים9,15,16,17. חוץ מזה, CHIP מווסת את היציבות של המלווה מכוון מיוסין, UNC-45B (Unc-45 Homolog B), אשר מתואם היטב עם תפקוד שרירים וחריגות מהרמות האופטימליות להוביל מיופתיה אנושית18,19,20,21. השפלה של UNC-45B על ידי פרוטאסום 26S הוא בתיווך על ידי התקשרות של שרשרת פולי-Ub הקשורה K489. בהיעדר חלבוני מצע, CHIP מבצעת10,22,23,המאפיין את רינג / U-box E3 רצועות אוביקוויטין24,25 ונחשב לווסת פעילות ligase26. יישום שיטות בדיקת ההחמצה המופרכות המתוארות במאמר זה סייע לזהות באופן שיטתי אנזימי E2 המשתלבים עם CHIP כדי לקדם היווצרות של שרשראות פולי-Ub בחינם ו/או כל-כל אוטומטי של CHIP (פרוטוקול סעיף 2). יתר על כן, כל מקום תלוי שבב של UNC-45B נצפתה, שהוא מצע ידוע של E3 ligase18,19 (פרוטוקול סעיף 3). בסופו של דבר, העברה תלוית שבב של Ub מופעל מן Ub ~ E2 thioester היה במעקב (פרוטוקול סעיף 4).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amershan Protran 0.1 &#181;m NC</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>10600000</td>
			<td>nitrocellulose membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CHIP</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2080</td>
			<td>Monoclonal rabbit anti-CHIP antibody, clone C3B6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MYC</td>
			<td>Roche</td>
			<td>OP10</td>
			<td>Monoclonal mouse anti-MYC antibody, clone 9E10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ubiquitin</td>
			<td>Upstate</td>
			<td>05-944</td>
			<td>Monoclonal mouse anti-Ub antibody, clone P4D1-A11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apyrase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6535-100UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP (10x)</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>12091903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6003-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8043.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6781.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P749.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3904.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDS sample buffer (4x)</td>
			<td>novex</td>
			<td>B0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5501-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4256.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MeOH</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>2,08,47,307</td>
			<td>100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milchpulver</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T145.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P029.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Antioxidant</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>NP0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Transfer buffer (20x)</td>
			<td>novex</td>
			<td>NP0006-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Page ruler plus</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>26619</td>
			<td>Protein ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RotiBlock</td>
			<td>Roth</td>
			<td>A151.1</td>
			<td>Blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (20%)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>1057.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1000 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1852196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1704150EDU</td>
			<td>Transfer system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4855.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9127.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UbcH Enzyme Set</td>
			<td>BostonBiochem</td>
			<td>K-980B</td>
			<td>E2 enzymes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubiquitin</td>
			<td>BostonBiochem</td>
			<td>U-100H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubiquitin-activating enzyme E1</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>BML-UW941U-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubiquitylation buffer (10x)</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>BML-KW9885-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman blotting paper</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1703969</td>
			<td>Extra thick filter paper</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro analysis of e3 ubiquitin ligase function

החיבור הקוולנטי של אוביקוויטין (Ub) לשאריות ליזינה פנימיות של חלבון מצע, תהליך המכונה בכל מקום, מייצג את אחד השינויים הפוסט-תרגומיים החשובים ביותר באורגניזמים אאוקריוטים. Ubiquitylation מתווך על ידי מפל רציף של שלושה מחלקות אנזימים כולל אנזימים מפעילי אוביקוויטין (אנזימי E1), אנזימים ההולכים אוביקוויטין (אנזימי E2) ורצועות אוביקוויטין (אנזימי E3), ולפעמים, גורמי התארכות בשרשרת אוביקוויטין (אנזימי E4). כאן, בפרוטוקולים במבחנה לבדיקות בכל מקום מסופקים, המאפשרים הערכה של E3 אוביקוויטין פעילות ligase, שיתוף הפעולה בין זוגות E2-E3, ובחירת מצע. זוגות E2-E3 שיתופיים יכולים להיות מוקרנים על ידי ניטור הדור של רשתות פולי-אוביקוויטין בחינם ו / או כל מקום אוטומטי של ligase E3. מצע בכל העולם מוגדר על ידי כריכה סלקטיבית של ligase E3 והוא יכול להיות מזוהה על ידי סופג מערבי של התגובה במבחנה. יתר על כן, E2 ~ Ub פריקה בדיקה מתוארת, המהווה כלי שימושי להערכה ישירה של שיתוף פעולה פונקציונלי E2-E3. כאן, העברה תלויה E3 של אוביקוויטין מתבצעת מן האנזים E2 המתאים על חומצות אמינו ליצין חינם (חיקוי מצע בכל מקום) או ליזינים פנימיים של E3 ligase עצמו (auto-בכל מקום). לסיכום, שלושה פרוטוקולי במבחנה שונים מסופקים כי הם מהירים וקלים לביצוע כדי לטפל בפונקציונליות קטליטית E3 ligase.

כדי לזהות אנזימי E2 שמשתפים פעולה עם שבב ligase ubiquitin, קבוצה של מועמדים E2 נבדק בתגובות הפרט במבחנה בכל מקום. זוגות E2-E3 שיתופיים היו במעקב על ידי היווצרות של E3 תלויי כלוב מוצרים, כלומר., auto-בכל מוצרי ההנעה בכל טוב נותחו על ידי סופג מערבי. פרשנות הנתונים מבוססת על השוואת הגודל של רצועות הח?...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function at JoVE.com

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

המחקר הנוכחי מספק פרוטוקולים מפורטים במבחנה בכל מקום לבדיקת אנליזה לניתוח של E3 אוביקוויטין פעילות קטליטית ligase. חלבונים רקומביננטיים באו לידי ביטוי במערכות פרוקריוטיות כגון תרבות קולי Escherichia.

במבחנה ניתוח של E3 אוביקוויטין פונקציית ליגאז

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לנתח היבטים מרכזיים חשובים של פונקציית ligase E3, כולל ספציפיות אנזימים E2, בחירת מצע והעברת ubiquitin. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הישימות הרחבה שלה, כמו חלבונים מכל המקורות האוקריוטיים ניתן לבטא מחדש ולמד במבחנה ללא צורך בציוד מיוחד. בעת שימוש בטכניקת פריקה ליזין בפעם הראשונה, חשוב לייעל פרמטרים של בדיקת אנזים, כגון ריכוזי אנזימים, כדי לזהות את תנאי הפריקה האידיאליים עבור ligase E3 של בחירה.כדי לבצע בדיקה במבחנה אוטומטית בכל מקום, להגדיר ערכת pipetting כדי לבדוק את היכולת התפקודית של אנזימי E2 שונים ולהכין תערובת מאסטר על קרח עבור כל התגובות בכל מקום בתוספת תגובה אחת נוספת. לאחר מכן, להוסיף micromolar אחד של אנזימי E2 צינורות המתאימים, ודגור את הדגימות רוכב אופניים תרמי PCR במשך שעתיים בתנאים שצוינו. לאחר הדגירה, הוסף מאגר מדגם SDS לכל תגובה ומערבב על ידי צנרת מספר פעמים.ואז מיד להרתיח את הדגימות ב 95 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות ולאחסן את החלבונים denatured ב 20 מעלות צלזיוס. כדי לבצע בדיקה מצע במבחנה בכל זמן, להכין את ערכת pipetting עבור כל התגובות. לאחר חישוב כמות תערובת האב הנדרשת לתגובה אחת, הכינו את תערובת המאסטר לכל התגובות על הקרח והוסיפו את תערובת המאסטר לכל צינור.הוסף את רצועות E3 המתאימות בנפרד. ואז לדגור על הדגימות ב- PCR אופנוע תרמי במשך שעתיים כפי שהוכח. בסוף הדגירה, להוסיף פעמיים SDS חוצץ מדגם לכל תגובה, לערבב מספר פעמים על ידי pipetting, ולהרתיח את הדגימות במשך חמש דקות ב 95 מעלות צלזיוס.כדי לבצע בדיקת פריקה ליצין, להגדיר את ערכת pipetting עבור תגובת הטעינה ולדגירה את תגובות הטעינה במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. כדי לעצור את תגובת הטעינה, להוסיף apyrase לריכוז הסופי של 1.8 יחידות למיליליטר ודגורה התגובה במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, להוסיף EDTA לריכוז הסופי של 30 מילימולר ולהשתמש במים מזוקקים כפולים כדי להתאים את נפח התגובה ל 30 microliters.כדי לפרוק E2 בכל עת על ידי E3, להגדיר חמישה צינורות המתאימים לנקודות הזמן עבור הניסוי, להוסיף 6.7 microliters של חיץ מדגם שאינו מצמצם לכל צינור, להסיר שישה microliters של תגובת הטעינה הפסיק מנקודת הזמן אפס צינור, ולהתאים את הנפח הכולל ל 26.7 microliters. כדי להגדיר את תגובות הפריקה, להוסיף מים מזוקקים כפולים, מאגר בכל זמן, BSA, ליסין, E3 ligase ואת E2 טעון לכל תגובה. לאחר פרקי הזמן שנבחרו, העבר דגימות של 20 מיקרוליטר מכל תגובת פריקה לצינור המדגם המתאים.ואז מיד מערבולת את הדגימות, ומניחים אותם ב 70 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. בניתוח כתם מערבי מייצג זה, שבב לא פעיל לא היה אוטומטי בכל זמן. עם זאת, מוצרי ubiquitin עצמאי E3 נוצרו בנוכחות שבב לא פעיל ובהיעדר שבב.שבב מסוג בר היה אוטומטי בכל מקום בשילוב עם החלבונים של UBE2D ומשפחות UBE2E, ואילו שרשראות פוליוביקוויטין חינם יוצרו בשיתוף עם החלבונים של משפחת UBE2D אבל לא עם החלבונים של משפחת UBE2E. כריכת היוביקוויטין על ידי UBE2N / V1 כיוונה את היווצרותן של שרשראות יוביקוויטין בחינם. ה- auto-ubiquitylation וכל מקום של UNC-45B נצפתה עם שבב מסוג פראי אך לא עם המוטציה הלא פעילה של CHIP, מה שמצביע על כך UNC-45B פועל כמצע שמור עבור CHIP.כאשר הפעילות הקטליטית של CHIP נותחה באמצעות מטען פריקה ליזין, האנזים UBE2D2 לא טעון היה משקל מולקולרי של 17 קילודלטון ואת UBE2D2 טעון עם מולקולת יוביקוויטין אחת היה משקל מולקולרי של כ 26 קילודלטון. בזמן 0, כל תשואת E2 הטעון נצפתה. בנוכחות שבב לא פעיל, פריקה E3 קלושה עצמאית ligase של UBE2D2 אבל לא אוטומטי בכל מקום של CHIP זוהה.בנוכחות שבב מסוג פראי, הפריקה של UBE2D2 הייתה מהירה והושלמה תוך 60 דקות, וההנחיה האוטומטית של CHIP הצביעה על העברה של אוביקוויטין לשאריות ליצין משלו. בשל היכולת המוגבלת E2, לעבוד מהר ככל האפשר ומיד להמשיך עם תגובת הפריקה ואחריו SDS-PAGE ו- Western blotting. בעקבות פרוטוקולי ההזנה במבחנה, ניתן לזהות את סוגי ההצמדה הספציפיים בכל העולם על ידי חקר הכתמים המערביים בנוגדנים ספציפיים להצמדה.

Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

חשיבותה של ריכוז חלבון נכון עבור קינטיקס וקביעת זיקה בניתוח מבנה פונקציה

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

ניתוח ופיתוח של הפנוטיפ מורפולוגי כפונקציה של ריכוז חלבון שמרים הנצה

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

ניתוח של שוואן-astrocyte אינטראקציות שימוש במבחנה מבחני

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

בניתוח מבחנה של PDZ תלויי macromolecular תסביכים CFTR לשידור אותות

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

ניתוח גנטי מהיר של איתות אפיתל-mesenchymal במהלך התחדשות שיער

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer's Vesicle

ניתוח של תפקוד גן ויזואליזציה של זרימת נוזל צילה שנוצרה בשלפוחיות של Kupffer

Internal organs such as the  heart, brain, and gut develop left-right (LR) asymmetries that are critical for  their normal functions1. Motile cilia are ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

הקרנת siRNA לזיהוי יוביקוויטין ורגולטורים מערכת דמויות יוביקוויטין של מסלולים ביולוגיים בתאי יונקים בתרבית

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

ניתוח של הרכב נפרון ותפקוד בכליות דג הזברה למבוגר

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

מדידות הכינון פונקציונלי ופעילות הערוץ של מטוהרים wildtype וחלבון CFTR Mutant

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

פרוטוקול אוטומאטי ומהיר עבור שריר סיבי ניתוח אוכלוסיית חתכי שריר עכברוש באמצעות שרשרת השרירן כבד אימונוהיסטוכימיה

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...