Name: in vitro analysis of e3 ubiquitin ligase function
Uploaded: 2021-05-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function at JoVE.com

हम पांडुलिपि पर महत्वपूर्ण चर्चा और सहायक सलाह के लिए हमारी प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं । हम आकार सीमा के कारण मूल्यवान योगदान का हवाला नहीं देने के लिए माफी मांगते हैं । इस काम को ड्यूश फोर्चुंग्स्जेमीस्चफ्ट (डीएफजी, जर्मन रिसर्च फाउंडेशन) - एसएफबी 1218 - प्रोजेक्टनंबर 269925409 और क्लस्टर ऑफ एक्सीलेंस एक्ससी 229/ इस काम को जर्मनी की उत्कृष्टता रणनीति के तहत ड्यूश फोर्स्चुंग्सगेमेन्चेफ्ट (डीएफजी, जर्मन रिसर्च फाउंडेशन) द्वारा वित्त पोषित किया गया था -EXC 2030 - 390661388 और - एसएफबी 1218 - प्रोजेक्टनंबर 269925409 टी एच Diese Arbeit wurde वॉन डेर ड्यूशेन Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der deutschen Exzellenzstrategie-EXC २०३०-390661388 und-SFB १२१८-Projektnummer: 269925409 एक एच gefördert ।

1. बफ़र्स और रिएजेंट्स की तैयारी
नोट: प्रयोगशाला में मैन्युअल रूप से तैयार किए गए बफर और रिएजेंट नीचे सूचीबद्ध हैं। प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले अन्य सभी बफ़र्स और रिएजेंट विभिन्न स्रोत?...

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	<li>Kuhlbrodt, K., Mouysset, J., Hoppe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchestra+for+assembly+and+fate+of+polyubiquitin+chains.">Orchestra for assembly and fate of polyubiquitin chains.</a> Essays in Biochemistry. 41, 1-14 (2005).</li><li>Pickart, C. M., Eddins, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin:+structures,+functions,+mechanisms.">Ubiquitin: structures, functions, mechanisms.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1695 (1-3), 55-72 (2004).</li><li>Dye, B. T., Schulman, B. 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यह पेपर E3 ligase समारोह के विश्लेषण के लिए बुनियादी इन विट्रो सर्वव्यापकता विधियों का वर्णन करता है। इन विट्रो सर्वव्यापकता परखते समय, यह माना जाना चाहिए कि कुछ ई-2 एंजाइम अपने स्वयं के लिसाइन अवशेषो...

सर्वव्यापकता वह प्रक्रिया है जिसके द्वारा यूबी को सब्सट्रेट प्रोटीन 1 से सहसंबद्ध रूप से जोड़ाजाताहै । यूबी संशोधन को लगातार एंजाइम वर्गों, यानीयूबी-एक्टिवेट एंजाइम (E1s), यूबी-कंजूगेटिंग एंजाइम (E2s), यूबी लिगिस (E3s), और संभवतः यूबी चेन स्फूर्ति कारकों (E4s)2,3,4,5की कार्रवाई से जुड़े द्वारा उत्प्रेरित किया जाता है। एडेनोसाइन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) और मैग्नीशियम (एमजी2+)के बाद- ई 1 द्वारा यूबी की निर्भर सक्रियता, ई1 की सक्रिय साइट सिस्टीन यूबी के सी-टर्मिनल ग्लाइसिन पर हमला करती है, जो एक थिओएस्टर कॉम्प्लेक्स (यूबी ~ ई 1) बनाती है। एटीपी हाइड्रोलिसिस से तैयार ऊर्जा यूबी को एक उच्च ऊर्जा संक्रमणकालीन स्थिति प्राप्त करने का कारण बनती है, जिसे पूरे निम्नलिखित एंजाइम झरना में बनाए रखा जाता है। इसके बाद, ई 2 एंजाइम सक्रिय यूबी को अपने आंतरिक उत्प्रेरक सिस्टीन में स्थानांतरित करता है, जिससे क्षणिक यूबी ~ ई 2 थिओस्टर बॉन्ड बन जाता है। इसके बाद, यूबी को सब्सट्रेट प्रोटीन में स्थानांतरित कर दिया जाता है।
यह दो तरह से किया जा सकता है। या तो E3 ligase पहले E2 के लिए बाध्य कर सकते हैं, या E3 ligase सीधे यूबी बांध सकते हैं । बाद के रास्ते एक E3 ~ Ub मध्यवर्ती के गठन में परिणाम है । किसी भी मामले में, यूबी को यूबी के सी-टर्मिनल कार्बोक्सिल समूह और सब्सट्रेट 6 के लिसाइन Ɛ-अमीनो समूह के बीच आइसोपेटाइड बॉन्ड के गठन से सब्सट्रेट प्रोटीन से जोड़ाजाताहै। मानव जीनोम दो E1s, लगभग 40 E2s, और 600 से अधिक ख्यात सर्वव्यापकाइन li गैसों7encodes। E3 के यूबी हस्तांतरण तंत्र के आधार पर, यूबी लि गैसों को तीन श्रेणियों में विभाजित किया गया है जिसमें E6AP सी-टर्मिनस (हेक्ट))- प्रकार, वास्तव में दिलचस्प नए जीन (रिंग) /यू-बॉक्स-प्रकार, और रिंग (आरबीआर) के बीच रिंग (आरबीआर) प्रकार लीगैसों 8के मुताबिक़ शामिल हैं। इस अध्ययन में, एचएससी 70-इंटरैक्टिंग प्रोटीन (चिप) के लिगाज़, कार्बोक्सिल टर्मिनस युक्त यू-बॉक्स का उपयोग प्रतिनिधि E3 एंजाइम के रूप में किया जाता है। एचईसीटी-प्रकार के ई 3 एंजाइमों के विपरीत जो यूबी ~ E3 थिओएस्टर्स बनाते हैं, चिप का यू-बॉक्स डोमेन E2 ~ यूबी को बांधता है और बाद में यूबी/सब्सट्रेट ट्रांसफर को सीधे E2 एंजाइम8,9से बढ़ावा देता है। एंजाइमेटिक फ़ंक्शन के लिए यू-बॉक्स के महत्व के आधार पर, एक निष्क्रिय चिप यू-बॉक्स उत्परिवर्ती, चिप (H260Q), एक नियंत्रण के रूप में उपयोग किया जाता है। चिप (H260Q) अपने कॉग्नेट E2s को बांधने में विफल रहता है, इस प्रकार अपनी E3 ligase गतिविधि10खोने ।
प्रोटीन सर्वव्यापकता यूकेरियोटिक कोशिकाओं में सेलुलर घटनाओं की एक भीड़ को विनियमित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। सेलुलर परिणामों की विविधता है कि यूबी अणुओं के रिवर्सिबल लगाव द्वारा प्रोटीन सब्सट्रेट करने के लिए पदोंनत कर रहे है यूबी की आणविक विशेषताओं के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है । चूंकि यूबी में ही आगे सर्वव्यापकता के लिए सात lysine (K) अवशेष होते हैं, इसलिए विभिन्न आकारों और/या टोपोलॉजी11के साथ यूबी चेन-प्रकारों की समृद्ध विविधता है । उदाहरण के लिए, सब्सट्रेट्स को एक (मोनो-सर्वव्यापकता) या मल्टीपल लिसाइन (मल्टी मोनो-सर्वव्यापकता) पर एक ही यूबी अणु द्वारा संशोधित किया जा सकता है, और यहां तक कि यूबी चेन (पॉली-सर्वव्यापकता)11द्वारा भी। यूबी चेन या तो यूबी के समान या विभिन्न lysine अवशेषों के माध्यम से होमो-या विषम रूप से गठित किए जाते हैं, जिसके परिणामस्वरूप शाखाबद्ध यूबी चेन9भी हो सकती है। इस प्रकार, प्रोटीन सर्वव्यापकता से यूबी अणुओं की विविध व्यवस्थाएं होती हैं, उदाहरणके लिए, संयुग्मित प्रोटीन12, 13के क्षरण, सक्रियण या स्थानीयकरण के लिए विशिष्ट जानकारी प्रदान करते हैं। ये विभिन्न यूबी सिग्नल सेलुलर सिग्नलिंग रास्तों के तेजी से पुनर्प्रोग्रामिंग को सक्षम करते हैं, जो बदलती पर्यावरणीय जरूरतों का जवाब देने की कोशिका की क्षमता के लिए एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है।
सर्वव्यापकता का एक केंद्रीय पहलू प्रोटीन गुणवत्ता नियंत्रण से संबंधित है। गलत ढंग से क्षतिग्रस्त या अपरिवर्तनीय रूप से क्षतिग्रस्त प्रोटीन को अपमानित किया जाना चाहिए और उसकी जगह नए संश्लेषित प्रोटीन द्वारा प्रोटीन होरोस्टेसिस या प्रोटेओस्टेसिस14को बनाए रखने के लिए किया जाना चाहिए । गुणवत्ता नियंत्रण E3 ligase, चिप, क्षतिग्रस्त प्रोटीन9,15, 16, 17के यूबी-निर्भर क्षरण में आणविक चैपरोन के साथ सहयोग करता है। इसके अलावा, चिप मायोसिन-निर्देशित चैपरवन, यूएनसी-45बी (यूएनसी-45 होमोलॉग बी) की स्थिरता को नियंत्रित करता है, जो मांसपेशियों के कार्य और इष्टतम स्तरों से विचलन के साथ कसकर समन्वित होता है जिससे मानव मायोपैथी18,19,20, 21होजातीहै। 26S प्रोटेसोम द्वारा यूएनसी-45बी का क्षरण K48-लिंक्ड पॉली-यूबी चेन9के लगाव से मध्यस्थता की जाती है । सब्सट्रेट प्रोटीन के अभाव में, चिप ऑटो-सर्वव्यापकता10,22,23करता है, जो रिंग/यू-बॉक्स E3 सर्वव्यापी लिगिस24, 25की विशेषता है और लिगाज़ गतिविधि को विनियमित करने के लिए विचार कियाजाता है26। इस पेपर में वर्णित इन विट्रो सर्वव्यापकता परख विधियों के आवेदन ने E2 एंजाइमों की व्यवस्थित रूप से पहचान करने में मदद की जो चिप के साथ मुक्त पॉली-यूबी चेन और/या ऑटो-सर्वव्यापकता चिप (प्रोटोकॉल धारा 2) के गठन को बढ़ावा देने के लिए टीम करते हैं । इसके अलावा, यूएनसी-45B के चिप-निर्भर सर्वव्यापकता देखी गई, जो E3 ligase18, 19 (प्रोटोकॉल धारा 3) का एक ज्ञात सब्सट्रेट है। अंततः, यूबी ~ E2 थिओस्टर से सक्रिय यूबी के चिप-निर्भर हस्तांतरण की निगरानी की गई (प्रोटोकॉल धारा 4)।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amershan Protran 0.1 &#181;m NC</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>10600000</td>
			<td>nitrocellulose membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CHIP</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2080</td>
			<td>Monoclonal rabbit anti-CHIP antibody, clone C3B6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MYC</td>
			<td>Roche</td>
			<td>OP10</td>
			<td>Monoclonal mouse anti-MYC antibody, clone 9E10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ubiquitin</td>
			<td>Upstate</td>
			<td>05-944</td>
			<td>Monoclonal mouse anti-Ub antibody, clone P4D1-A11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apyrase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6535-100UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP (10x)</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>12091903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6003-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8043.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6781.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P749.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3904.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDS sample buffer (4x)</td>
			<td>novex</td>
			<td>B0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5501-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4256.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MeOH</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>2,08,47,307</td>
			<td>100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milchpulver</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T145.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P029.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Antioxidant</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>NP0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Transfer buffer (20x)</td>
			<td>novex</td>
			<td>NP0006-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Page ruler plus</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>26619</td>
			<td>Protein ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RotiBlock</td>
			<td>Roth</td>
			<td>A151.1</td>
			<td>Blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (20%)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>1057.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1000 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1852196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1704150EDU</td>
			<td>Transfer system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4855.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9127.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UbcH Enzyme Set</td>
			<td>BostonBiochem</td>
			<td>K-980B</td>
			<td>E2 enzymes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubiquitin</td>
			<td>BostonBiochem</td>
			<td>U-100H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubiquitin-activating enzyme E1</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>BML-UW941U-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubiquitylation buffer (10x)</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>BML-KW9885-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman blotting paper</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1703969</td>
			<td>Extra thick filter paper</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro analysis of e3 ubiquitin ligase function

सब्सट्रेट प्रोटीन के आंतरिक lysine अवशेषों (एस) के लिए सर्वव्यापक लगाव, सर्वव्यापी कहा जाता है, यूकेरियोटिक जीवों में सबसे महत्वपूर्ण अनुवादात्मक संशोधनों में से एक का प्रतिनिधित्व करता है। सर्वव्यापकता को तीन एंजाइम वर्गों के अनुक्रमिक झरने द्वारा मध्यस्थता की जाती है जिनमें सर्वव्यापकता-सक्रिय एंजाइम (ई 1 एंजाइम), सर्वव्यापक एंजाइम (E2 एंजाइम), और सर्वव्यापक लिगैस (ई 3 एंजाइम), और कभी-कभी, सर्वव्यापकइन-चेन एल्गोंगेशन कारक (ई 4 एंजाइम) शामिल हैं। यहां, सर्वव्यापकता परख के लिए इन विट्रो प्रोटोकॉल प्रदान किए जाते हैं, जो E3 सर्वव्यापकता लिगाज़ गतिविधि के आकलन, E2-E3 जोड़े के बीच सहयोग, और सब्सट्रेट चयन की अनुमति देते हैं। सहयोग E2-E3 जोड़े मुक्त पाली-सर्वव्यापकता श्रृंखला की पीढ़ी की निगरानी और/या E3 ligase के ऑटो सर्वव्यापकता द्वारा जांच की जा सकती है । सब्सट्रेट सर्वव्यापकता को E3 ligase के चयनात्मक बाध्यकारी द्वारा परिभाषित किया गया है और इन विट्रो प्रतिक्रिया के पश्चिमी ब्लॉटिंग द्वारा पता लगाया जा सकता है। इसके अलावा, एक E2 ~ Ub निर्वहन परख वर्णित है, जो कार्यात्मक E2-E3 सहयोग के प्रत्यक्ष आकलन के लिए एक उपयोगी उपकरण है । यहां, सर्वव्यापकता के E3-निर्भर हस्तांतरण को इसी E2 एंजाइम से मुफ्त में लिसिन अमीनो एसिड (नकल करने वाले सब्सट्रेट सर्वव्यापकता) या ई 3 लिगाज़ के आंतरिक लिसिन (ऑटो-सर्वव्यापकता) पर पीछा किया जाता है। अंत में, तीन अलग-अलग इन विट्रो प्रोटोकॉल प्रदान किए जाते हैं जो E3 लिगाज़ उत्प्रेरक कार्यक्षमता को संबोधित करने के लिए तेजी से और आसान प्रदर्शन करने के लिए हैं।

सर्वव्यापक लिगास चिप के साथ सहयोग करने वाले E2 एंजाइमों की पहचान करने के लिए, E2 उम्मीदवारों के एक सेट का परीक्षण व्यक्तिगत इन विट्रो सर्वव्यापकता प्रतिक्रियाओं में किया गया था। सहयोग E2-E3 जोड़े E3-निर्?...

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In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

वर्तमान अध्ययन E3 सर्वव्यापकता लिगाज़ उत्प्रेरक गतिविधि के विश्लेषण के लिए विट्रो सर्वव्यापकता परख प्रोटोकॉल में विस्तृत प्रदान करता है। रेशेरिचिया कोलाई संस्कृति जैसे प्रोकैरियोटिक सिस्टम का उपयोग करके रिकॉम्बिनेंट प्रोटीन व्यक्त किए गए थे।

इन विट्रो E3 सर्वव्यापकिन लिगाज़ समारोह का विश्लेषण

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...

इस प्रोटोकॉल का समग्र लक्ष्य E2 एंजाइम विशिष्टता, सब्सट्रेट चयन और सर्वव्यापकता हस्तांतरण सहित E3 ligase समारोह के महत्वपूर्ण प्रमुख पहलुओं का विश्लेषण करना है। इस तकनीक का मुख्य लाभ इसकी व्यापक प्रयोज्यता है, क्योंकि सभी यूकेरियोटिक स्रोतों से प्रोटीन को विशेष उपकरणों की आवश्यकता के बिना विट्रो में फिर से व्यक्त और अध्ययन किया जा सकता है। पहली बार लिसिन डिस्चार्ज तकनीक का उपयोग करते समय, पसंद के E3 लीगासे के लिए आदर्श निर्वहन स्थितियों की पहचान करने के लिए एंजाइम सांद्रता जैसे परख मापदंडों को अनुकूलित करना महत्वपूर्ण है।इन विट्रो ऑटो-सर्वव्यापकता परख करने के लिए, विभिन्न ई 2 एंजाइमों की कार्यात्मक क्षमता का परीक्षण करने के लिए एक पाइपिंग योजना स्थापित करें और सर्वव्यापी प्रतिक्रियाओं के साथ-साथ एक अतिरिक्त प्रतिक्रिया के सभी के लिए बर्फ पर एक मास्टर मिश्रण तैयार करें। इसके बाद, उपयुक्त ट्यूबों में E2 एंजाइमों का एक माइक्रोमोलर जोड़ें, और इंगित शर्तों के तहत दो घंटे के लिए पीसीआर थर्मल साइकिलर में नमूनों को इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद, प्रत्येक प्रतिक्रिया में एसडीएस नमूना बफर जोड़ें और कई बार पाइपिंग करके मिलाएं।फिर तुरंत नमूनों को पांच मिनट के लिए ९५ डिग्री सेल्सियस पर उबालें और विकृत प्रोटीन को 20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें । इन विट्रो सब्सट्रेट सर्वापितव्य परख करने के लिए, सभी प्रतिक्रियाओं के लिए पिपटिंग योजना तैयार करें। एक प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक मास्टर मिश्रण की मात्रा की गणना करने के बाद, बर्फ पर प्रतिक्रियाओं के सभी के लिए मास्टर मिश्रण तैयार करें और प्रत्येक ट्यूब में मास्टर मिश्रण जोड़ें।संबंधित E3 li गैसों को व्यक्तिगत रूप से जोड़ें। फिर प्रदर्शन के रूप में दो घंटे के लिए पीसीआर थर्मल साइकिल में नमूनों को इनक्यूबेट । इनक्यूबेशन के अंत में, प्रत्येक प्रतिक्रिया में दो बार एसडीएस नमूना बफर जोड़ें, पाइपिंग द्वारा कई बार मिलाएं, और नमूनों को 95 डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए उबालें।एक lysine निर्वहन परख करने के लिए, चार्जिंग प्रतिक्रिया के लिए पाइपिंग योजना की स्थापना और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए चार्ज प्रतिक्रियाओं को इनक्यूबेट । चार्जिंग प्रतिक्रिया को रोकने के लिए, प्रति मिलीलीटर 1.8 इकाइयों की अंतिम एकाग्रता में एपरेज़ जोड़ें और कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए प्रतिक्रिया को बढ़ाएं। इनक्यूबेशन के अंत में, 30 मिलीमोलर की अंतिम एकाग्रता में ईडीटीए जोड़ें और 30 माइक्रोलीटर की प्रतिक्रिया की मात्रा को समायोजित करने के लिए डबल-डिस्टिल्ड पानी का उपयोग करें।E3 द्वारा E2 सर्वव्यापकता का निर्वहन करने के लिए, प्रयोग के लिए समय बिंदुओं के अनुरूप पांच ट्यूब स्थापित करें, प्रत्येक ट्यूब में गैर-कम करने वाले नमूना बफर के 6.7 माइक्रोलीटर जोड़ें, टाइम पॉइंट शून्य ट्यूब से बंद चार्ज प्रतिक्रिया के छह माइक्रोलीटर को हटा दें, और कुल मात्रा को 26.7 माइक्रोलीटर में समायोजित करें। निर्वहन प्रतिक्रियाओं को स्थापित करने के लिए, प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए डबल-आसुत पानी, सर्वव्यापी बफर, बीएसए, लिसिन, E3 ligase और चार्ज E2 जोड़ें। चयनित समय अवधि के बाद, संबंधित नमूना ट्यूब के लिए प्रत्येक निर्वहन प्रतिक्रिया से 20 माइक्रोलिटर नमूनों को स्थानांतरित करें।फिर तुरंत नमूनों को भंवर, और उन्हें 10 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर रखें। इस प्रतिनिधि पश्चिमी दाग विश्लेषण में, निष्क्रिय चिप ऑटो-सर्वव्यापकता नहीं थी। हालांकि, E3-स्वतंत्र सर्वव्यापक उत्पादों निष्क्रिय चिप की उपस्थिति में और चिप के अभाव में गठित किए गए थे ।UBE2D और UBE2E परिवारों के प्रोटीन के साथ संयुक्त होने पर जंगली-प्रकार की चिप को ऑटो-सर्वव्यापकीकृत किया गया था, जबकि यूबी2डी परिवार के प्रोटीन के सहयोग से मुफ्त पॉलीफाउक्विटिन चेन का उत्पादन किया गया था, लेकिन UBE2E परिवार के प्रोटीन के साथ नहीं। UBE2N/V1 द्वारा सर्वव्यापकता के बंधन मुक्त सर्वव्यापकता श्रृंखलाओं के गठन का निर्देश दिया । यूएनसी-45B के ऑटो-सर्वव्यापकता और सर्वव्यापकता को जंगली प्रकार की चिप के साथ नहीं बल्कि चिप के निष्क्रिय उत्परिवर्ती के साथ देखा गया, जो यह दर्शाता है कि यूएनसी-45B चिप के लिए संरक्षित सब्सट्रेट के रूप में कार्य करता है ।जब चिप की उत्प्रेरक गतिविधि का विश्लेषण एक lysine निर्वहन परख का उपयोग करके किया गया था, तो अनचार्ज UBE2D2 एंजाइम का आणविक वजन 17 किलोडडलटन था और एक सर्वव्यापक अणु के साथ आरोपित UBE2D2 का आणविक वजन लगभग 26 किलोडल्डटन था। समय 0, पूरे आरोप लगाया E2 उपज देखा गया था । निष्क्रिय चिप की उपस्थिति में, UBE2D2 के एक बेहोश E3 ligase-स्वतंत्र निर्वहन लेकिन चिप के ऑटो सर्वव्यापकता का पता नहीं चला था ।जंगली प्रकार चिप की उपस्थिति में, UBE2D2 का निर्वहन तेजी से किया गया था और 60 मिनट के भीतर पूरा हो गया था, और चिप के ऑटो-सर्वव्यापकता ने अपने स्वयं के lysine अवशेषों पर सर्वव्यापी हस्तांतरण का संकेत दिया। सीमित E2 क्षमता के कारण, जितनी जल्दी हो सके काम करें और तुरंत एसडीएस-पेज और पश्चिमी ब्लॉटिंग के बाद डिस्चार्ज रिएक्शन के साथ आगे बढ़ें। इन इन इन विट्रो सर्वव्यापकता प्रोटोकॉल के बाद, लिंकेज-विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ पश्चिमी ब्लॉकों की जांच करके विशिष्ट सर्वव्यापकता लिंकेज प्रकारों की पहचान की जा सकती है।

Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

कैनेटीक्स और संरचना समारोह विश्लेषण में आत्मीयता निर्धारण के लिए सही प्रोटीन एकाग्रता का महत्व

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

नवोदित खमीर में प्रोटीन कांसंट्रेशन की एक फंक्शन के रूप एक morphological Phenotype के विकास विश्लेषण

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

श्वान - astrocyte का उपयोग सहभागिता के विश्लेषण इन विट्रो में Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

PDZ निर्भर CFTR macromolecular संकेतन परिसर की इन विट्रो विश्लेषण में

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

बाल उत्थान के दौरान तेजी से उपकला-mesenchymal संकेतन की आनुवांशिक विश्लेषण

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer's Vesicle

जीन और Kupffer पुटिका में सिलिया उत्पन्न द्रव प्रवाह की विज़ुअलाइज़ेशन समारोह का विश्लेषण

Internal organs such as the  heart, brain, and gut develop left-right (LR) asymmetries that are critical for  their normal functions1. Motile cilia are ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

संवर्धित स्तनधारी कोशिकाओं में जैविक रास्ते की Ubiquitin और ubiquitin की तरह सिस्टम नियामकों की पहचान siRNA स्क्रीनिंग

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

वयस्क zebrafish गुर्दे में नेफ्रॉन संरचना और समारोह के विश्लेषण

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

शुद्ध wildtype और उत्परिवर्ती CFTR प्रोटीन के कार्यात्मक पुनर्गठन और चैनल गतिविधि माप

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

चूहा स्नायु पार वर्गों मायोसिन भारी चेन immunohistochemistry का उपयोग में स्नायु फाइबर जनसंख्या विश्लेषण के लिए एक तेजी से स्वचालित प्रोटोकॉल

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...