Name: in vitro analysis of e3 ubiquitin ligase function
Uploaded: 2021-05-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function at JoVE.com

Ringraziamo i membri del nostro laboratorio per la discussione critica e i consigli utili sul manoscritto. Ci scusiamo per non aver citato contributi preziosi a causa della limitazione delle dimensioni. Questo lavoro è sostenuto dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondazione tedesca per la ricerca) - SFB 1218 - Projektnumber 269925409 e Cluster of Excellence EXC 229/ CECAD to TH. Questo lavoro è stato finanziato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) nell'ambito della Strategia di eccellenza della Germania - EXC 2030 - 390661388 e - SFB 1218 - Projektnumber 269925409 a T.H. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der deutschen Exzellenzstrategie - EXC 2030 - 390661388 und - SFB 1218 - Projektnummer: 269925409 an T.H. gefördert.

1. Preparazione di tamponi e reagenti
NOTA: tamponi e reagenti preparati manualmente in laboratorio sono elencati di seguito. Tutti gli altri tamponi e reagenti utilizzati nei protocolli sono stati acquistati da fonti diverse e utilizzati secondo le istruzioni dei produttori.
<ol><li>Preparare 10x soluzione salina tamponata con fosfato (10x PBS). A tale scopo, mescolare 1,37 M di cloruro di sodio (NaCl), 27 mM di cloruro di potassio (KCl), 80 mM di disodio-idrogeno-fosfato diidrato (Na2...

<ol>
	<li>Kuhlbrodt, K., Mouysset, J., Hoppe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchestra+for+assembly+and+fate+of+polyubiquitin+chains.">Orchestra for assembly and fate of polyubiquitin chains.</a> Essays in Biochemistry. 41, 1-14 (2005).</li><li>Pickart, C. M., Eddins, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin:+structures,+functions,+mechanisms.">Ubiquitin: structures, functions, mechanisms.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1695 (1-3), 55-72 (2004).</li><li>Dye, B. T., Schulman, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanisms+underlying+posttranslational+modification+by+ubiquitin-like+proteins.">Structural mechanisms underlying posttranslational modification by ubiquitin-like proteins.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36, 131-150 (2007).</li><li>Koegl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+ubiquitination+factor,+E4,+is+involved+in+multiubiquitin+chain+assembly.">A novel ubiquitination factor, E4, is involved in multiubiquitin chain assembly.</a> Cell. 96 (5), 635-644 (1999).</li><li>Hoppe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiubiquitylation+by+E4+enzymes:+'one+size'+doesn't+fit+all.">Multiubiquitylation by E4 enzymes: 'one size' doesn't fit all.</a> Trends in Biochemical Sciences. 30 (4), 183-187 (2005).</li><li>Stewart, M. D., Ritterhoff, T., Klevit, R. E., Brzovic, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E2+enzymes:+more+than+just+the+middle+men.">E2 enzymes: more than just the middle men.</a> Cell Research. 26 (4), 423-440 (2016).</li><li>Clague, M. J., Heride, C., Urb&#233;, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+demographics+of+the+ubiquitin+system.">The demographics of the ubiquitin system.</a> Trends in Cell Biology. 25 (7), 417-426 (2015).</li><li>Buetow, L., Huang, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+catalysis+and+regulation+of+E3+ubiquitin+ligases.">Structural insights into the catalysis and regulation of E3 ubiquitin ligases.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (10), 626-642 (2016).</li><li>French, M. E., Koehler, C. F., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+functions+of+branched+ubiquitin+chains.">Emerging functions of branched ubiquitin chains.</a> Cell Discovery. 7, 6 (2021).</li><li>Hatakeyama, S., Yada, M., Matsumoto, M., Ishida, N., Nakayama, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U+box+proteins+as+a+new+family+of+ubiquitin-protein+ligases.">U box proteins as a new family of ubiquitin-protein ligases.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (35), 33111-33120 (2001).</li><li>Herhaus, L., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+ubiquitin+code+through+post-translational+modification.">Expanding the ubiquitin code through post-translational modification.</a> EMBO Reports. 16 (9), 1071-1083 (2015).</li><li>Deshaies, R. J., Joazeiro, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RING+domain+E3+ubiquitin+ligases.">RING domain E3 ubiquitin ligases.</a> Annual Review of Biochemistry. 78, 399-434 (2009).</li><li>Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lingering+mysteries+of+ubiquitin-chain+assembly.">Lingering mysteries of ubiquitin-chain assembly.</a> Cell. 124 (1), 27-34 (2006).</li><li>Hoppe, T., Cohen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organismal+protein+homeostasis+mechanisms.">Organismal protein homeostasis mechanisms.</a> Genetics. 215 (4), 889-901 (2020).</li><li>Okiyoneda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+protein+quality+control+removes+unfolded+CFTR+from+the+plasma+membrane.">Peripheral protein quality control removes unfolded CFTR from the plasma membrane.</a> Science. 329 (5993), 805-810 (1997).</li><li>Tawo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ubiquitin+ligase+CHIP+integrates+proteostasis+and+aging+by+regulation+of+insulin+receptor+turnover.">The Ubiquitin ligase CHIP integrates proteostasis and aging by regulation of insulin receptor turnover.</a> Cell. 169 (3), 470-482 (2017).</li><li>Albert, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHIP+ubiquitylates+NOXA+and+induces+its+lysosomal+degradation+in+response+to+DNA+damage.">CHIP ubiquitylates NOXA and induces its lysosomal degradation in response to DNA damage.</a> Cell Death and Disease. 11 (9), 740 (2020).</li><li>Hoppe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+myosin-directed+chaperone+UNC-45+by+a+novel+E3/E4-multiubiquitylation+complex+in+C.+elegans.">Regulation of the myosin-directed chaperone UNC-45 by a novel E3/E4-multiubiquitylation complex in C. elegans.</a> Cell. 118 (3), 337-349 (2004).</li><li>Kim, J., L&#246;we, T., Hoppe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+quality+control+gets+muscle+into+shape.">Protein quality control gets muscle into shape.</a> Trends in Cell Biology. 18 (6), 264-272 (2008).</li><li>Janiesch, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-selective+chaperone+CDC-48/p97+links+myosin+assembly+to+human+myopathy.">The ubiquitin-selective chaperone CDC-48/p97 links myosin assembly to human myopathy.</a> Nature Cell Biology. 9 (4), 379-390 (2007).</li><li>Donkervoort, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+variants+in+the+myosin+chaperone+UNC-45B+cause+progressive+myopathy+with+eccentric+cores.">Pathogenic variants in the myosin chaperone UNC-45B cause progressive myopathy with eccentric cores.</a> The American Journal of Human Genetics. 107 (6), 1078-1095 (2020).</li><li>Murata, S., Minami, Y., Minami, M., Chiba, T., Tanaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHIP+is+a+chaperone-dependent+E3+ligase+that+ubiquitylates+unfolded+protein.">CHIP is a chaperone-dependent E3 ligase that ubiquitylates unfolded protein.</a> EMBO Reports. 2 (12), 1133-1138 (2001).</li><li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHIP+is+a+U-box-dependent+E3+ubiquitin+ligase:+identification+of+Hsc70+as+a+target+for+ubiquitylation.">CHIP is a U-box-dependent E3 ubiquitin ligase: identification of Hsc70 as a target for ubiquitylation.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (64), 42938-42944 (2001).</li><li>Yang, Y., Yu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+apoptosis:+the+ubiquitous+way.">Regulation of apoptosis: the ubiquitous way.</a> The FASEB Journal. 17 (8), 790-799 (2003).</li><li>Lamothe, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRAF6+ubiquitin+ligase+is+essential+for+RANKL+signaling+and+osteoclast+differentiation.">TRAF6 ubiquitin ligase is essential for RANKL signaling and osteoclast differentiation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communication. 359 (4), 1044-1049 (2007).</li><li>Amemiya, Y., Azmi, P., Seth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoubiquitination+of+BCA2+RING+E3+ligase+regulates+its+own+stability+and+affects+cell+migration.">Autoubiquitination of BCA2 RING E3 ligase regulates its own stability and affects cell migration.</a> Molecular Cancer Research. 6 (9), 1385 (2008).</li><li>Brzovic, P. S., Lissounov, A., Christensen, D. E., Hoyt, D. W., Klevit, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+UbcH5/ubiquitin+noncovalent+complex+is+required+for+processive+BRCA1-directed+ubiquitination.">A UbcH5/ubiquitin noncovalent complex is required for processive BRCA1-directed ubiquitination.</a> Molecular Cell. 21 (6), 873-880 (2006).</li><li>Sakata, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+UbcH5b~ubiquitin+intermediate:+Insight+into+the+formation+of+the+self-assembled+E2~Ub+conjugates.">Crystal structure of UbcH5b~ubiquitin intermediate: Insight into the formation of the self-assembled E2~Ub conjugates.</a> Structure. 18 (1), 138-147 (2010).</li><li>Eddins, M. J., Carlile, C. M., Gomez, K. M., Pickart, C. M., Wolberger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mms2-Ubc13+covalently+bound+to+ubiquitin+reveals+the+structural+basis+of+linkage-specific+polyubiquitin+chain+formation.">Mms2-Ubc13 covalently bound to ubiquitin reveals the structural basis of linkage-specific polyubiquitin chain formation.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 13 (10), 915-920 (2006).</li><li>Buetow, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+a+primed+RING+E3-E2+ubiquitin+complex+by+non-covalent+ubiquitin.">Activation of a primed RING E3-E2 ubiquitin complex by non-covalent ubiquitin.</a> Molecular Cell. 58 (2), 297-310 (2015).</li><li>Dou, H., Buetow, L., Sibbet, G. J., Cameron, K., Huang, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BIRC7-E2+ubiquitin+conjugate+structure+reveals+the+mechanism+of+ubiquitin+transfer+by+a+RING+dimer.">BIRC7-E2 ubiquitin conjugate structure reveals the mechanism of ubiquitin transfer by a RING dimer.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 19 (9), 876-883 (2012).</li><li>McKenna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncovalent+interaction+between+ubiquitin+and+the+human+DNA+repair+protein+Mms2+is+required+for+Ubc13-mediated+polyubiquitination.">Noncovalent interaction between ubiquitin and the human DNA repair protein Mms2 is required for Ubc13-mediated polyubiquitination.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (43), 40120-40125 (2001).</li><li>Plechanovov&#225;, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+ubiquitylation+by+dimeric+RING+ligase+RNF4.">Mechanism of ubiquitylation by dimeric RING ligase RNF4.</a> Nature Structural Biology. 18 (9), 1052-1059 (2011).</li><li>Pierce, N. W., Kleiger, G., Shan, S. O., Deshaies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+sequential+polyubiquitylation+on+a+millisecond+timescale.">Detection of sequential polyubiquitylation on a millisecond timescale.</a> Nature. 462 (7273), 615-619 (2009).</li><li>Jain, A. K., Barton, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+p53:+TRIM24+enters+the+RING.">Regulation of p53: TRIM24 enters the RING.</a> Cell Cycle. 8 (22), 3668-3674 (2009).</li><li>Swatek, K. N., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+modifications.">Ubiquitin modifications.</a> Cell Research. 26, 399-422 (2016).</li><li>Yan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+K63-linked+polyubiquitination+in+cardiac+hypertrophy.">The role of K63-linked polyubiquitination in cardiac hypertrophy.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (10), 4558-4567 (2018).</li><li>Dammer, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyubiquitin+linkage+profiles+in+three+models+of+proteolytic+stress+suggest+the+etiology+of+Alzheimer+disease.">Polyubiquitin linkage profiles in three models of proteolytic stress suggest the etiology of Alzheimer disease.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 10457-10465 (2011).</li></ol>

Questo articolo descrive i metodi di ubiquitilazione di base in vitro per l'analisi della funzione della ligasi E3. Quando si eseguono saggi di ubiquitilazione in vitro, si deve considerare che alcuni enzimi E2 possono eseguire l'auto-ubiquitilazione a causa dell'attacco della loro cisteina attiva sui propri residui di lisina che si trovano in prossimità del sito attivo30. Per aggirare questo problema, si raccomanda l'uso di un mutante E2 in cui il rispettivo residuo di lisina v...

L'ubiquitilazione è il processo mediante il quale Ub è legato covalentemente a una proteina substrato1. La modificazione Ub è catalizzata da successive reazioni enzimatiche che coinvolgono l'azione di tre diverse classi enzimatiche,ovvero enzimi Ub-attivanti (E1s), enzimi Ub-coniuganti (E2s), Ub ligasi (E3s), ed eventualmente fattori di allungamento della catena Ub (E4s)2,3,4,5. Dopo l'attivazione dipendente da adenosina trifosfato (ATP) e magnesio (Mg2+) di Ub da parte di E1, la cisteina del sito attivo di E1 attacca la glicina C-terminale di Ub, formando un complesso tioestere (Ub ~ E1). L'energia prelevata dall'idrolisi dell'ATP fa sì che l'Ub raggiunga uno stato di transizione ad alta energia, che viene mantenuto durante la seguente cascata enzimatica. Successivamente, l'enzima E2 trasferisce l'Ub attivato alla sua cisteina catalitica interna, formando così un legame tioestere transitorio Ub~E2. Successivamente, Ub viene trasferito alla proteina del substrato.
Questo può essere fatto in due modi. O la ligasi E3 può prima legarsi a E2, o la ligasi E3 può legare direttamente Ub. Quest'ultimo modo si traduce nella formazione di un intermedio E3 ~ Ub. In entrambi i casi, Ub è legato alla proteina del substrato dalla formazione di un legame isopeptidetico tra il gruppo carbossilico C-terminale di Ub e il gruppo lisina Ɛ-amminico del substrato6. Il genoma umano codifica due E1, circa 40 E2 e più di 600 presunte ubiquitina ligasi7. Sulla base del meccanismo di trasferimento Ub dell'E3, le Ub ligasi sono divise in tre categorie che coinvolgono il tipo Omologo a E6AP C-Terminus (HECT), il tipo Really Interesting New Gene (RING) / U-box e RING tra le ligasi di tipo RING (RBR)8. In questo studio, l'U-box contenente ligasi, Carboxyl Terminus of HSC70-interacting Protein (CHIP), viene utilizzato come enzima E3 rappresentativo. A differenza degli enzimi E3 di tipo HECT che formano i tioesteri Ub~E3, il dominio U-box di CHIP lega E2~Ub e promuove il successivo trasferimento Ub/substrato direttamente dall'enzima E28,9. Sulla base dell'importanza della U-box per la funzione enzimatica, un mutante CHIP U-box inattivo, CHIP (H260Q), viene utilizzato come controllo. CHIP (H260Q) non riesce a legarsi ai suoi affini E2, perdendo così la sua attività di legasi E310.
L'ubiquitilazione proteica svolge un ruolo cruciale nella regolazione di una moltitudine di eventi cellulari nelle cellule eucariotiche. La diversità dei risultati cellulari promossi dall'attaccamento reversibile delle molecole Ub alle proteine del substrato può essere attribuita alle caratteristiche molecolari di Ub. Poiché Ub stesso contiene sette residui di lisina (K) per un'ulteriore ubiquitilazione, esiste una ricca varietà di tipi di catene Ub con diverse dimensioni e / o topologie11. Ad esempio, i substrati possono essere modificati da una singola molecola Ub a uno (mono-ubiquitilazione) o lisine multiple (multi mono-ubiquitilazione), e persino da catene Ub (poli-ubiquitilazione)11. Le catene Ub sono formate omo- o eterotipicamente attraverso lo stesso o diversi residui di lisina di Ub, che potrebbero anche provocare catene Ub ramificate9. Pertanto, l'ubiquitilazione proteica porta a diverse disposizioni di molecole Ub che forniscono informazioni specifiche, ad esempioper la degradazione, l'attivazione o la localizzazione delle proteine coniugate12,13. Questi diversi segnali Ub consentono una rapida riprogrammazione delle vie di segnalazione cellulare, che è un requisito importante per la capacità della cellula di rispondere alle mutevoli esigenze ambientali.
Un aspetto centrale dell'ubiquitilazione è legato al controllo della qualità delle proteine. Le proteine mal ripiegate o irreversibilmente danneggiate devono essere degradate e sostituite da proteine di nuova sintesi per mantenere l'omeostasi proteica o la proteostasi14. Il controllo qualità E3 ligasi, CHIP, collabora con chaperoni molecolari nella degradazione Ub-dipendente delle proteine danneggiate9,15,16,17. Oltre a ciò, CHIP regola la stabilità dell'accompagnatore diretto dalla miosina, UNC-45B (Unc-45 Homolog B), che è strettamente coordinato con la funzione muscolare e le deviazioni dai livelli ottimali portano alla miopatia umana18,19,20,21. La degradazione di UNC-45B da parte del proteasoma 26S è mediata dall'attaccamento di una catena poli-Ub legata a K489. In assenza di proteine del substrato, CHIP esegue l'auto-ubiquitilazione10,22,23,che è caratteristica delle ligasi ubiquitina RING/U-box E324,25 e considerata regolatrice dell'attività della ligasi26. L'applicazione dei metodi di saggio di ubiquitilazione in vitro descritti in questo articolo ha contribuito a identificare sistematicamente gli enzimi E2 che si uniscono a CHIP per promuovere la formazione di catene poli-Ub libere e / o l'auto-ubiquitilazione di CHIP (sezione 2 del protocollo). Inoltre, è stata osservata ubiquitilazione CHIP-dipendente di UNC-45B, che è un substrato noto della ligasi E318,19 (sezione 3 del protocollo). In definitiva, è stato monitorato il trasferimento dipendente da CHIP di Ub attivato dal tioestere Ub~E2 (sezione 4 del protocollo).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amershan Protran 0.1 &#181;m NC</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>10600000</td>
			<td>nitrocellulose membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CHIP</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2080</td>
			<td>Monoclonal rabbit anti-CHIP antibody, clone C3B6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MYC</td>
			<td>Roche</td>
			<td>OP10</td>
			<td>Monoclonal mouse anti-MYC antibody, clone 9E10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ubiquitin</td>
			<td>Upstate</td>
			<td>05-944</td>
			<td>Monoclonal mouse anti-Ub antibody, clone P4D1-A11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apyrase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6535-100UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP (10x)</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>12091903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6003-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8043.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6781.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P749.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3904.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDS sample buffer (4x)</td>
			<td>novex</td>
			<td>B0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5501-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4256.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MeOH</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>2,08,47,307</td>
			<td>100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milchpulver</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T145.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P029.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Antioxidant</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>NP0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Transfer buffer (20x)</td>
			<td>novex</td>
			<td>NP0006-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Page ruler plus</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>26619</td>
			<td>Protein ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RotiBlock</td>
			<td>Roth</td>
			<td>A151.1</td>
			<td>Blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (20%)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>1057.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1000 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1852196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1704150EDU</td>
			<td>Transfer system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4855.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9127.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UbcH Enzyme Set</td>
			<td>BostonBiochem</td>
			<td>K-980B</td>
			<td>E2 enzymes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubiquitin</td>
			<td>BostonBiochem</td>
			<td>U-100H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubiquitin-activating enzyme E1</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>BML-UW941U-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubiquitylation buffer (10x)</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>BML-KW9885-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman blotting paper</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1703969</td>
			<td>Extra thick filter paper</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro analysis of e3 ubiquitin ligase function

L'attaccamento covalente dell'ubiquitina (Ub) ai residui interni di lisina di una proteina substrato, un processo chiamato ubiquitilazione, rappresenta una delle più importanti modificazioni post-traduzionali negli organismi eucariotici. L'ubiquitilazione è mediata da una cascata sequenziale di tre classi enzimatiche tra cui enzimi attivanti l'ubiquitina (enzimi E1), enzimi coniuganti l'ubiquitina (enzimi E2) e ligasi di ubiquitina (enzimi E3) e, a volte, fattori di allungamento della catena dell'ubiquitina (enzimi E4). Qui vengono forniti protocolli in vitro per saggi di ubiquitilazione, che consentono la valutazione dell'attività dell'ubiquitina ligasi E3, la cooperazione tra coppie E2-E3 e la selezione del substrato. Le coppie E2-E3 cooperanti possono essere sottoposte a screening monitorando la generazione di catene libere di poli-ubiquitina e/o l'auto-ubiquitilazione della ligasi E3. L'ubiquitilazione del substrato è definita dal legame selettivo della ligasi E3 e può essere rilevata mediante western blotting della reazione in vitro. Inoltre, viene descritto un saggio di scarica E2~Ub, che è uno strumento utile per la valutazione diretta della cooperazione funzionale E2-E3. Qui, il trasferimento E3-dipendente dell'ubiquitina è seguito dal corrispondente enzima E2 su amminoacidi liberi di lisina (che imitano l'ubiquitilazione del substrato) o lisine interne della stessa ligasi E3 (auto-ubiquitilazione). In conclusione, vengono forniti tre diversi protocolli in vitro che sono veloci e facili da eseguire per affrontare la funzionalità catalitica della ligasi E3.

Per identificare gli enzimi E2 che cooperano con l'ubiquitina ligasi CHIP, è stato testato un set di candidati E2 in singole reazioni di ubiquitilazione in vitro. Le coppie E2-E3 che hanno collaborato sono state monitorate dalla formazione di prodotti di ubiquitilazione E3-dipendenti, cioèauto-ubiquitilazione della ligasi E3 e formazione di polimeri Ub liberi. I prodotti di ubiquitilazione sono stati analizzati mediante western blotting. L'interpretazione dei dati si basa sul confronto dimensionale de...

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In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

Il presente studio fornisce protocolli dettagliati di test di ubiquitilazione in vitro per l'analisi dell'attività catalitica dell'ubiquitina ligasi E3. Le proteine ricombinanti sono state espresse utilizzando sistemi procariotici come la coltura di Escherichia coli.

In vitro Analisi della funzione E3 Ubiquitina ligasi

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di analizzare importanti aspetti chiave della funzione della ligasi E3, tra cui la specificità dell'enzima E2, la selezione del substrato e il trasferimento dell'ubiquitina. Il vantaggio principale di questa tecnica è la sua ampia applicabilità, in quanto le proteine provenienti da tutte le fonti eucariotiche possono essere espresse in modo ricombinante e studiate in vitro senza la necessità di attrezzature speciali. Quando si utilizza la tecnica di scarica di lisina per la prima volta, è importante ottimizzare i parametri di analisi, come le concentrazioni enzimatiche, per identificare le condizioni di scarico ideali per la ligasi E3 scelta.Per eseguire un test di auto-ubiquitilazione in vitro, impostare uno schema di pipettaggio per testare la capacità funzionale di diversi enzimi E2 e preparare una miscela master su ghiaccio per tutte le reazioni di ubiquitilazione più una reazione aggiuntiva. Quindi, aggiungere un micromolare di enzimi E2 alle provette appropriate e incubare i campioni in un termociclatore PCR per due ore nelle condizioni indicate. Dopo l'incubazione, aggiungere il tampone campione SDS a ciascuna reazione e mescolare mediante pipettaggio più volte.Quindi far bollire immediatamente i campioni a 95 gradi Celsius per cinque minuti e conservare le proteine denaturate a 20 gradi Celsius. Per eseguire un test di ubiquitilazione del substrato in vitro, preparare lo schema di pipettaggio per tutte le reazioni. Dopo aver calcolato la quantità di miscela principale necessaria per una reazione, preparare la miscela principale per tutte le reazioni su ghiaccio e aggiungere la miscela principale a ciascun tubo.Aggiungere le rispettive ligasi E3 singolarmente. Quindi incubare i campioni nel termociclatore PCR per due ore come dimostrato. Alla fine dell'incubazione, aggiungere due volte tampone campione SDS a ciascuna reazione, mescolare più volte mediante pipettaggio e far bollire i campioni per cinque minuti a 95 gradi Celsius.Per eseguire un test di scarica di lisina, impostare lo schema di pipettaggio per la reazione di carica e incubare le reazioni di carica per 15 minuti a 37 gradi Celsius. Per fermare la reazione di carica, aggiungere l'apirasi a una concentrazione finale di 1,8 unità per millilitro e incubare la reazione per cinque minuti a temperatura ambiente. Alla fine dell'incubazione, aggiungere EDTA a una concentrazione finale di 30 millimolari e utilizzare acqua a doppia distillazione per regolare il volume della reazione a 30 microlitri.Per scaricare l'ubiquitilazione E2 tramite E3, impostare cinque tubi corrispondenti ai punti temporali per l'esperimento, aggiungere 6,7 microlitri di tampone campione non riducente a ciascun tubo, rimuovere sei microlitri della reazione di carica interrotta dal tubo zero del punto temporale e regolare il volume totale a 26,7 microlitri. Per impostare le reazioni di scarica, aggiungere acqua a doppio distillato, tampone di ubiquitilazione, BSA, lisina, E3 ligasi e E2 caricato a ciascuna reazione. Dopo i periodi di tempo selezionati, trasferire campioni da 20 microlitri da ciascuna reazione di scarica alla provetta del campione corrispondente.Quindi ruotare immediatamente i campioni e posizionarli a 70 gradi Celsius per 10 minuti. In questa analisi rappresentativa di Western blot, il CHIP inattivo non era auto-ubiquitilato. Tuttavia, i prodotti di ubiquitina indipendenti da E3 sono stati formati in presenza di CHIP inattivo e in assenza di CHIP.Il CHIP wild-type è stato auto-ubiquitilato quando combinato con le proteine delle famiglie UBE2D e UBE2E, mentre le catene di poliubiquitina libera sono state prodotte in cooperazione con le proteine della famiglia UBE2D ma non con le proteine della famiglia UBE2E. Il legame dell'ubiquitina da parte di UBE2N/V1 ha diretto la formazione di catene di ubiquitina libere. L'auto-ubiquitilazione e l'ubiquitilazione di UNC-45B sono state osservate con CHIP wild-type ma non con il mutante inattivo di CHIP, indicando che UNC-45B agisce come substrato conservato per CHIP.Quando l'attività catalitica di CHIP è stata analizzata utilizzando un test di scarica di lisina, l'enzima UBE2D2 non caricato aveva un peso molecolare di 17 kilodalton e l'UBE2D2 caricato con una singola molecola di ubiquitina aveva un peso molecolare di circa 26 kilodalton. Al tempo 0, è stata osservata l'intera resa E2 carica. In presenza di CHIP inattivo, è stata rilevata una debole scarica E3 ligasi-indipendente di UBE2D2 ma non auto-ubiquitilazione di CHIP.In presenza di CHIP wild-type, lo scarico di UBE2D2 è stato rapido e completato entro 60 minuti, e l'auto-ubiquitilazione di CHIP ha indicato un trasferimento di ubiquitina sui propri residui di lisina. A causa della limitata capacità di E2, lavorare il più rapidamente possibile e procedere immediatamente con la reazione di scarica seguita da SDS-PAGE e Western blotting. Seguendo questi protocolli di ubiquitilazione in vitro, i tipi specifici di legame di ubiquitilazione possono essere identificati sondando le macchie occidentali con anticorpi specifici del linkage.

Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

L&#39;importanza della concentrazione della proteina corretta per Cinetica e determinazione affinità nella struttura-funzione di analisi

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Ricerca

Biologia

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