Name: in vitro analysis of e3 ubiquitin ligase function
Uploaded: 2021-05-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function at JoVE.com

Vi takker medlemmene av laboratoriet vårt for kritisk diskusjon og nyttige råd om manuskriptet. Vi beklager at vi ikke har sitert verdifulle bidrag på grunn av størrelsesbegrensning. Dette arbeidet støttes av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) - SFB 1218 - Projektnumber 269925409 og Cluster of Excellence EXC 229 / CECAD til TH. Dette arbeidet ble finansiert av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) under Tysklands Excellence Strategy - EXC 2030 - 390661388 og - SFB 1218 - Projektnumber 269925409 til T.H. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der deutschen Exzellenzstrategie - EXC 2030 - 390661388 und - SFB 1218 - Projektnummer: 269925409 en T.H. gefördert.

1. Utarbeidelse av buffere og reagenser
MERK: Buffere og reagenser som ble utarbeidet manuelt i laboratoriet er listet opp nedenfor. Alle andre buffere og reagenser som brukes i protokollene ble kjøpt fra forskjellige kilder og brukt i henhold til produsentens instruksjoner.
<ol><li>Forbered 10x fosfatbufret saltvann (10x PBS). Til dette formålet, blanding 1,37 M natriumklorid (NaCl), 27 mM kaliumklorid (KCl), 80 mM disodium-hydrogen-fosfatdihydrat (Na2HPO2 4,2H2...

<ol>
	<li>Kuhlbrodt, K., Mouysset, J., Hoppe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchestra+for+assembly+and+fate+of+polyubiquitin+chains.">Orchestra for assembly and fate of polyubiquitin chains.</a> Essays in Biochemistry. 41, 1-14 (2005).</li><li>Pickart, C. M., Eddins, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin:+structures,+functions,+mechanisms.">Ubiquitin: structures, functions, mechanisms.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1695 (1-3), 55-72 (2004).</li><li>Dye, B. T., Schulman, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanisms+underlying+posttranslational+modification+by+ubiquitin-like+proteins.">Structural mechanisms underlying posttranslational modification by ubiquitin-like proteins.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36, 131-150 (2007).</li><li>Koegl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+ubiquitination+factor,+E4,+is+involved+in+multiubiquitin+chain+assembly.">A novel ubiquitination factor, E4, is involved in multiubiquitin chain assembly.</a> Cell. 96 (5), 635-644 (1999).</li><li>Hoppe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiubiquitylation+by+E4+enzymes:+'one+size'+doesn't+fit+all.">Multiubiquitylation by E4 enzymes: 'one size' doesn't fit all.</a> Trends in Biochemical Sciences. 30 (4), 183-187 (2005).</li><li>Stewart, M. D., Ritterhoff, T., Klevit, R. E., Brzovic, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E2+enzymes:+more+than+just+the+middle+men.">E2 enzymes: more than just the middle men.</a> Cell Research. 26 (4), 423-440 (2016).</li><li>Clague, M. J., Heride, C., Urb&#233;, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+demographics+of+the+ubiquitin+system.">The demographics of the ubiquitin system.</a> Trends in Cell Biology. 25 (7), 417-426 (2015).</li><li>Buetow, L., Huang, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+catalysis+and+regulation+of+E3+ubiquitin+ligases.">Structural insights into the catalysis and regulation of E3 ubiquitin ligases.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (10), 626-642 (2016).</li><li>French, M. E., Koehler, C. F., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+functions+of+branched+ubiquitin+chains.">Emerging functions of branched ubiquitin chains.</a> Cell Discovery. 7, 6 (2021).</li><li>Hatakeyama, S., Yada, M., Matsumoto, M., Ishida, N., Nakayama, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U+box+proteins+as+a+new+family+of+ubiquitin-protein+ligases.">U box proteins as a new family of ubiquitin-protein ligases.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (35), 33111-33120 (2001).</li><li>Herhaus, L., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+ubiquitin+code+through+post-translational+modification.">Expanding the ubiquitin code through post-translational modification.</a> EMBO Reports. 16 (9), 1071-1083 (2015).</li><li>Deshaies, R. J., Joazeiro, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RING+domain+E3+ubiquitin+ligases.">RING domain E3 ubiquitin ligases.</a> Annual Review of Biochemistry. 78, 399-434 (2009).</li><li>Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lingering+mysteries+of+ubiquitin-chain+assembly.">Lingering mysteries of ubiquitin-chain assembly.</a> Cell. 124 (1), 27-34 (2006).</li><li>Hoppe, T., Cohen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organismal+protein+homeostasis+mechanisms.">Organismal protein homeostasis mechanisms.</a> Genetics. 215 (4), 889-901 (2020).</li><li>Okiyoneda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+protein+quality+control+removes+unfolded+CFTR+from+the+plasma+membrane.">Peripheral protein quality control removes unfolded CFTR from the plasma membrane.</a> Science. 329 (5993), 805-810 (1997).</li><li>Tawo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ubiquitin+ligase+CHIP+integrates+proteostasis+and+aging+by+regulation+of+insulin+receptor+turnover.">The Ubiquitin ligase CHIP integrates proteostasis and aging by regulation of insulin receptor turnover.</a> Cell. 169 (3), 470-482 (2017).</li><li>Albert, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHIP+ubiquitylates+NOXA+and+induces+its+lysosomal+degradation+in+response+to+DNA+damage.">CHIP ubiquitylates NOXA and induces its lysosomal degradation in response to DNA damage.</a> Cell Death and Disease. 11 (9), 740 (2020).</li><li>Hoppe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+myosin-directed+chaperone+UNC-45+by+a+novel+E3/E4-multiubiquitylation+complex+in+C.+elegans.">Regulation of the myosin-directed chaperone UNC-45 by a novel E3/E4-multiubiquitylation complex in C. elegans.</a> Cell. 118 (3), 337-349 (2004).</li><li>Kim, J., L&#246;we, T., Hoppe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+quality+control+gets+muscle+into+shape.">Protein quality control gets muscle into shape.</a> Trends in Cell Biology. 18 (6), 264-272 (2008).</li><li>Janiesch, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-selective+chaperone+CDC-48/p97+links+myosin+assembly+to+human+myopathy.">The ubiquitin-selective chaperone CDC-48/p97 links myosin assembly to human myopathy.</a> Nature Cell Biology. 9 (4), 379-390 (2007).</li><li>Donkervoort, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+variants+in+the+myosin+chaperone+UNC-45B+cause+progressive+myopathy+with+eccentric+cores.">Pathogenic variants in the myosin chaperone UNC-45B cause progressive myopathy with eccentric cores.</a> The American Journal of Human Genetics. 107 (6), 1078-1095 (2020).</li><li>Murata, S., Minami, Y., Minami, M., Chiba, T., Tanaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHIP+is+a+chaperone-dependent+E3+ligase+that+ubiquitylates+unfolded+protein.">CHIP is a chaperone-dependent E3 ligase that ubiquitylates unfolded protein.</a> EMBO Reports. 2 (12), 1133-1138 (2001).</li><li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHIP+is+a+U-box-dependent+E3+ubiquitin+ligase:+identification+of+Hsc70+as+a+target+for+ubiquitylation.">CHIP is a U-box-dependent E3 ubiquitin ligase: identification of Hsc70 as a target for ubiquitylation.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (64), 42938-42944 (2001).</li><li>Yang, Y., Yu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+apoptosis:+the+ubiquitous+way.">Regulation of apoptosis: the ubiquitous way.</a> The FASEB Journal. 17 (8), 790-799 (2003).</li><li>Lamothe, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRAF6+ubiquitin+ligase+is+essential+for+RANKL+signaling+and+osteoclast+differentiation.">TRAF6 ubiquitin ligase is essential for RANKL signaling and osteoclast differentiation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communication. 359 (4), 1044-1049 (2007).</li><li>Amemiya, Y., Azmi, P., Seth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoubiquitination+of+BCA2+RING+E3+ligase+regulates+its+own+stability+and+affects+cell+migration.">Autoubiquitination of BCA2 RING E3 ligase regulates its own stability and affects cell migration.</a> Molecular Cancer Research. 6 (9), 1385 (2008).</li><li>Brzovic, P. S., Lissounov, A., Christensen, D. E., Hoyt, D. W., Klevit, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+UbcH5/ubiquitin+noncovalent+complex+is+required+for+processive+BRCA1-directed+ubiquitination.">A UbcH5/ubiquitin noncovalent complex is required for processive BRCA1-directed ubiquitination.</a> Molecular Cell. 21 (6), 873-880 (2006).</li><li>Sakata, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+UbcH5b~ubiquitin+intermediate:+Insight+into+the+formation+of+the+self-assembled+E2~Ub+conjugates.">Crystal structure of UbcH5b~ubiquitin intermediate: Insight into the formation of the self-assembled E2~Ub conjugates.</a> Structure. 18 (1), 138-147 (2010).</li><li>Eddins, M. J., Carlile, C. M., Gomez, K. M., Pickart, C. M., Wolberger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mms2-Ubc13+covalently+bound+to+ubiquitin+reveals+the+structural+basis+of+linkage-specific+polyubiquitin+chain+formation.">Mms2-Ubc13 covalently bound to ubiquitin reveals the structural basis of linkage-specific polyubiquitin chain formation.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 13 (10), 915-920 (2006).</li><li>Buetow, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+a+primed+RING+E3-E2+ubiquitin+complex+by+non-covalent+ubiquitin.">Activation of a primed RING E3-E2 ubiquitin complex by non-covalent ubiquitin.</a> Molecular Cell. 58 (2), 297-310 (2015).</li><li>Dou, H., Buetow, L., Sibbet, G. J., Cameron, K., Huang, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BIRC7-E2+ubiquitin+conjugate+structure+reveals+the+mechanism+of+ubiquitin+transfer+by+a+RING+dimer.">BIRC7-E2 ubiquitin conjugate structure reveals the mechanism of ubiquitin transfer by a RING dimer.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 19 (9), 876-883 (2012).</li><li>McKenna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncovalent+interaction+between+ubiquitin+and+the+human+DNA+repair+protein+Mms2+is+required+for+Ubc13-mediated+polyubiquitination.">Noncovalent interaction between ubiquitin and the human DNA repair protein Mms2 is required for Ubc13-mediated polyubiquitination.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (43), 40120-40125 (2001).</li><li>Plechanovov&#225;, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+ubiquitylation+by+dimeric+RING+ligase+RNF4.">Mechanism of ubiquitylation by dimeric RING ligase RNF4.</a> Nature Structural Biology. 18 (9), 1052-1059 (2011).</li><li>Pierce, N. W., Kleiger, G., Shan, S. O., Deshaies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+sequential+polyubiquitylation+on+a+millisecond+timescale.">Detection of sequential polyubiquitylation on a millisecond timescale.</a> Nature. 462 (7273), 615-619 (2009).</li><li>Jain, A. K., Barton, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+p53:+TRIM24+enters+the+RING.">Regulation of p53: TRIM24 enters the RING.</a> Cell Cycle. 8 (22), 3668-3674 (2009).</li><li>Swatek, K. N., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+modifications.">Ubiquitin modifications.</a> Cell Research. 26, 399-422 (2016).</li><li>Yan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+K63-linked+polyubiquitination+in+cardiac+hypertrophy.">The role of K63-linked polyubiquitination in cardiac hypertrophy.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (10), 4558-4567 (2018).</li><li>Dammer, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyubiquitin+linkage+profiles+in+three+models+of+proteolytic+stress+suggest+the+etiology+of+Alzheimer+disease.">Polyubiquitin linkage profiles in three models of proteolytic stress suggest the etiology of Alzheimer disease.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 10457-10465 (2011).</li></ol>

Dette dokumentet beskriver grunnleggende in vitro allestedsnærværende metoder for analyse av E3-ligasefunksjon. Når du utfører in vitro allestedsnærværende analyser, bør det vurderes at noen E2-enzymer kan utføre auto-allestedsnærværende på grunn av angrepet av deres aktive cystein på sine egne lysinrester som ligger i nærheten av det aktive stedet30. For å omgå dette problemet anbefales bruk av en E2-mutant der de respektive lysinrester byttes mot arginin, noe som...

Allestedsnærværende er prosessen der Ub er kovalent knyttet til et substratprotein1. Ub-modifikasjonen er katalysert av påfølgende enzymatiske reaksjoner som involverer virkningen av tre forskjellige enzymklasser, det vil siUb-aktiverende enzymer (E1s), Ub-konjugaterende enzymer (E2s), Ub ligases (E3s) og muligens Ub-kjedeforlengelsesfaktorer (E4s)2,3,4,5. Etter adenosin triphosfat (ATP)- og magnesium (Mg2+)-avhengig aktivering av Ub ved E1, angriper det aktive stedet cystein av E1 C-terminal glycin av Ub, og danner et thioesterkompleks (Ub ~ E1). Energien trukket fra ATP hydrolyse får Ub til å oppnå en høy energi overgangstilstand, som opprettholdes gjennom følgende enzym kaskade. Deretter overfører E2-enzymet den aktiverte Ub til sin indre katalytiske cystein, og danner dermed en forbigående Ub ~ E2 thioesterbinding. Deretter overføres Ub til substratproteinet.
Dette kan gjøres på to måter. Enten kan E3-ligaen først binde seg til E2, eller E3-ligaene kan binde Ub direkte. Sistnevnte måte resulterer i dannelsen av en E3 ~ Ub mellomliggende. I begge tilfeller er Ub knyttet til substratproteinet ved dannelse av en isopeptidbinding mellom C-terminal karboksylgruppen Ub og lysin- Ɛ-aminogruppen av substratet6. Det menneskelige genomet koder to E1-er, ca. 40 E2-er og mer enn 600 putative allestedsnærværende ligaer7. Basert på Ub-overføringsmekanismen til E3, er Ub-ligaer delt inn i tre kategorier som involverer Homolog til E6AP C-Terminus (HECT)-type, Really Interesting New Gene (RING)/U-box-type og RING mellom RING (RBR)-type ligases8. I denne studien brukes U-boksen som inneholder ligaer, Carboxyl Terminus fra HSC70-interagerende protein (CHIP), som et representativt E3-enzym. I motsetning til HECT-type E3 enzymer som danner Ub ~ E3 tioesters, binder U-box-domenet til CHIP E2 ~ Ub og fremmer den påfølgende Ub / substratoverføringen direkte fra E2-enzymet8,9. Basert på viktigheten av U-boksen for enzymatisk funksjon, brukes en inaktiv CHIP U-boks mutant, CHIP (H260Q), som en kontroll. CHIP(H260Q) klarer ikke å binde seg til sin cognate E2s, og mister dermed sin E3 ligase aktivitet10.
Protein allestedsnærværende spiller en avgjørende rolle i å regulere en rekke cellulære hendelser i eukaryote celler. Mangfoldet av cellulære utfall som fremmes av reversibel vedlegg av Ub-molekyler til substratproteiner, kan tilskrives Ubs molekylære egenskaper. Ettersom Ub selv inneholder syv lysin (K) rester for videre allestedsnærværende, er det rikt utvalg av Ub kjedetyper med forskjellige størrelser og / eller topologier11. For eksempel kan substrater modifiseres av et enkelt Ub-molekyl ved en (mono-allestedsnærværende) eller flere lysiner (multimono-allestedsnærværende), og til og med av Ub-kjeder (poly-allestedsnærværende)11. Ub-kjeder er enten dannet homo- eller heterotypisk via samme eller forskjellige lysinrester av Ub, noe som til og med kan resultere i forgrenedeUb-kjeder 9. Dermed fører protein allestedsnærværende til ulike arrangementer av Ub-molekyler som gir spesifikk informasjon, for eksempelfor nedbrytning, aktivering eller lokalisering av konjugede proteiner12,13. Disse forskjellige Ub-signalene muliggjør rask omprogrammering av cellulære signalveier, noe som er et viktig krav for cellens evne til å reagere på endrede miljøbehov.
Et sentralt aspekt ved allestedsnærværende er relatert til proteinkvalitetskontroll. Feilfoldede eller irreversibelt skadede proteiner må forringes og erstattes av nylig syntetiserte proteiner for å opprettholde protein homeostase eller proteostase14. Kvalitetskontroll E3 ligase, CHIP, samarbeider med molekylære anstander i Ub-avhengig nedbrytning av skadede proteiner9,15,16,17. Bortsett fra det regulerer CHIP stabiliteten til den myosinstyrte anstanden, UNC-45B (Unc-45 Homolog B), som er tett koordinert med muskelfunksjon og avvik fra de optimale nivåene fører til menneskelig myopati18,19,20,21. Nedbrytning av UNC-45B av 26S-proteasomet formidles ved vedlegg av en K48-koblet poly-Ub-kjede9. I fravær av substratproteiner utfører CHIP auto-allestedsnærværende10,22,23, som er karakteristisk for RING / U-boks E3 ubiquitin ligases24,25 og anses å regulere ligase aktivitet26. Anvendelsen av in vitro ubiquitylation analyse metoder beskrevet i dette dokumentet bidro til systematisk å identifisere E2 enzymer som slår seg sammen med CHIP for å fremme dannelsen av frie poly-Ub kjeder og / eller auto-ubiquitylation av CHIP (protokoll avsnitt 2). Videre ble CHIP-avhengig allestedsnærværende ubiquitylation av UNC-45B observert, som er et kjent substrat av E3-ligase18,19 (protokoll § 3). Til slutt ble CHIP-avhengig overføring av aktivert Ub fra Ub ~ E2 thioester overvåket (protokoll avsnitt 4).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amershan Protran 0.1 &#181;m NC</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>10600000</td>
			<td>nitrocellulose membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CHIP</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2080</td>
			<td>Monoclonal rabbit anti-CHIP antibody, clone C3B6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MYC</td>
			<td>Roche</td>
			<td>OP10</td>
			<td>Monoclonal mouse anti-MYC antibody, clone 9E10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ubiquitin</td>
			<td>Upstate</td>
			<td>05-944</td>
			<td>Monoclonal mouse anti-Ub antibody, clone P4D1-A11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apyrase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6535-100UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP (10x)</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>12091903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6003-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8043.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6781.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P749.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3904.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDS sample buffer (4x)</td>
			<td>novex</td>
			<td>B0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5501-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4256.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MeOH</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>2,08,47,307</td>
			<td>100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milchpulver</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T145.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P029.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Antioxidant</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>NP0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Transfer buffer (20x)</td>
			<td>novex</td>
			<td>NP0006-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Page ruler plus</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>26619</td>
			<td>Protein ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RotiBlock</td>
			<td>Roth</td>
			<td>A151.1</td>
			<td>Blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (20%)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>1057.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1000 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1852196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1704150EDU</td>
			<td>Transfer system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4855.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9127.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UbcH Enzyme Set</td>
			<td>BostonBiochem</td>
			<td>K-980B</td>
			<td>E2 enzymes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubiquitin</td>
			<td>BostonBiochem</td>
			<td>U-100H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubiquitin-activating enzyme E1</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>BML-UW941U-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubiquitylation buffer (10x)</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>BML-KW9885-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman blotting paper</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1703969</td>
			<td>Extra thick filter paper</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro analysis of e3 ubiquitin ligase function

Den kovalente tilknytningen av ubiquitin (Ub) til interne lysinrester av et substratprotein, en prosess som kalles allestedsnærværende, representerer en av de viktigste postoversettelsesendringene i eukaryote organismer. Allestedsnærværende formidler formidles av en sekvensiell kaskade av tre enzymklasser, inkludert allestedsnærværende-aktiverende enzymer (E1 enzymer), allestedsnærværende-konjugaterende enzymer (E2 enzymer) og allestedsnærværende ligaer (E3 enzymer), og noen ganger allestedsnærværende kjedeforlengelsesfaktorer (E4-enzymer). Her gis in vitroprotokoller for allestedsnærværende analyser, som gjør det mulig å vurdere E3 allestedsnærværende ligaer, samarbeidet mellom E2-E3-par og substratvalg. Samarbeidende E2-E3-par kan screenes ved å overvåke genereringen av frie poly-allestedsnærværende kjeder og/eller automatisk allestedsnærværende av E3-ligaene. Substrat allestedsnærværende er definert ved selektiv binding av E3-ligaene og kan påvises ved vestlig blotting av in vitro-reaksjonen. Videre beskrives en E2~Ub utslippsanalyse, som er et nyttig verktøy for direkte vurdering av funksjonelt E2-E3-samarbeid. Her følges den E3-avhengige overføringen av allestedsnærværende fra det tilsvarende E2-enzymet til frie lysinaminosyrer (etterligning av substrat ubiquitylation) eller interne lysiner av selve E3-ligase (auto-allestedsnærværende). Til slutt er det gitt tre forskjellige in vitro-protokoller som er raske og enkle å utføre for å adressere E3-ligase katalytisk funksjonalitet.

For å identifisere E2 enzymer som samarbeider med allestedsnærværende ligase CHIP, ble et sett med E2-kandidater testet i individuelle in vitro ubiquitylation reaksjoner. Samarbeidende E2-E3-par ble overvåket av dannelsen av E3-avhengige allestedsnærværende produkter, det vil siautomatisk allestedsnærværende av E3-ligaene og dannelsen av frie Ub-polymerer. Allestedsnærværende legemidler ble analysert av vestlig blotting. Datatolkning er basert på størrelsessammenligningen av de resulterende ...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function at JoVE.com

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

Den nåværende studien gir detaljerte in vitro ubiquitylation analyseprotokoller for analyse av E3 ubiquitin ligase katalytisk aktivitet. Rekombinante proteiner ble uttrykt ved hjelp av prokaryote systemer som Escherichia coli-kultur.

Introduksjon Analyse av E3 Ubiquitin Ligase-funksjonen

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...

Det overordnede målet med denne protokollen er å analysere viktige viktige aspekter ved E3-ligasefunksjonen, inkludert E2-enzymspesifisitet, substratvalg og allestedsnærværende overføring. Den største fordelen med denne teknikken er dens brede anvendbarhet, da proteiner fra alle eukaryote kilder kan rekombinant uttrykkes og studeres in vitro uten behov for spesialutstyr. Når du bruker lysinutladningsteknikken for første gang, er det viktig å optimalisere analyseparametere, for eksempel enzymkonsentrasjoner, for å identifisere de ideelle utslippsforholdene for den valgte E3-ligaen.For å utføre en in vitro auto-allestedsnærværende analyse, sett opp en pipetteringsordning for å teste den funksjonelle evnen til forskjellige E2-enzymer og forberede en mesterblanding på is for alle alle allestedsnærværende reaksjoner pluss en ekstra reaksjon. Deretter legger du til en mikromolar av E2-enzymer til de aktuelle rørene, og inkuberer prøvene i en PCR termisk syklist i to timer under de angitte forholdene. Etter inkubasjonen legger du til SDS-prøvebuffer til hver reaksjon og blander ved pipettering flere ganger.Kok deretter umiddelbart prøvene ved 95 grader Celsius i fem minutter og lagre de denaturerte proteinene ved 20 grader Celsius. For å utføre en in vitro substrat allestedsnærværende analyse, forberede pipetteringsordningen for alle reaksjonene. Etter å ha beregnet mengden masterblanding som kreves for en reaksjon, forberede mesterblandingen for alle reaksjonene på isen og legg masterblandingen til hvert rør.Legg til de respektive E3-ligaene individuelt. Inkuber deretter prøvene i PCR termisk syklist i to timer som demonstrert. På slutten av inkubasjonen legger du til to ganger SDS-prøvebuffer til hver reaksjon, bland flere ganger ved pipettering, og kok prøvene i fem minutter ved 95 grader Celsius.For å utføre en lysinutladningsanalyse, sett opp pipetteringsskjemaet for ladereaksjonen og inkuber ladereaksjonene i 15 minutter ved 37 grader Celsius. For å stoppe ladereaksjonen, legg apyrase til en endelig konsentrasjon på 1,8 enheter per milliliter og inkuber reaksjonen i fem minutter ved romtemperatur. På slutten av inkubasjonen, legg EDTA til en endelig konsentrasjon på 30 millimolar og bruk dobbeltdestillert vann for å justere volumet av reaksjonen til 30 mikroliter.For å tømme E2 allestedsnærværende ved E3, sett opp fem rør som tilsvarer tidspunktene for eksperimentet, tilsett 6,7 mikroliter ikke-reduserende prøvebuffer til hvert rør, fjern seks mikroliter av den stansede ladereaksjonen fra tidspunktet null rør, og juster det totale volumet til 26,7 mikroliter. For å sette opp utslippsreaksjonene, tilsett dobbeltdestillert vann, allestedsnærværendeylasjonsbuffer, BSA, lysin, E3-ligaer og den ladede E2 til hver reaksjon. Etter de valgte tidsperiodene overfører du 20 mikroliterprøver fra hver utladningsreaksjon til det tilsvarende prøverøret.Deretter vortex prøvene umiddelbart, og plasser dem på 70 grader Celsius i 10 minutter. I denne representative vestlige blotanalysen ble den inaktive CHIP-en ikke automatisk allestedsnærværende. Imidlertid ble de E3-uavhengige allestedsnærværende produktene dannet i nærvær av inaktiv CHIP og i fravær av CHIP.Wild-type CHIP ble automatisk allestedsnærværende når den ble kombinert med proteinene til UBE2D- og UBE2E-familiene, mens de frie polyubiquitinkjedene ble produsert i samarbeid med proteinene i UBE2D-familien, men ikke med proteinene til UBE2E-familien. Bindingen av ubiquitin av UBE2N / V1 rettet dannelsen av frie allestedsnærværende kjeder. Auto-ubiquitylation og ubiquitylation av UNC-45B ble observert med wild-type CHIP, men ikke med inaktiv mutant av CHIP, noe som indikerer at UNC-45B fungerer som et konservert substrat for CHIP.Da den katalytiske aktiviteten til CHIP ble analysert ved hjelp av en lysinutladningsanalyse, hadde det uladede UBE2D2-enzymet en molekylvekt på 17 kilodaltonn og den ladede UBE2D2 med et enkelt allestedsnærværende molekyl hadde en molekylvekt på ca. 26 kilodaltonn. På tidspunktet 0 ble hele det ladede E2-utbyttet observert. I nærvær av inaktiv CHIP ble det oppdaget en svak E3-ligaseuavhengig utslipp av UBE2D2, men ikke automatisk allestedsnærværende CHIP.I nærvær av wild-type CHIP ble utslippet av UBE2D2 raskt og fullført innen 60 minutter, og auto-allestedsnærværende CHIP indikerte en overføring av ubiquitin på sine egne lysinrester. På grunn av den begrensede E2-evnen, arbeid så raskt som mulig og fortsett umiddelbart med utslippsreaksjonen etterfulgt av SDS-PAGE og vestlig blotting. Etter disse in vitro ubiquitylation protokollene, kan de spesifikke allestedsnærværende koblingstypene identifiseres ved å undersøke de vestlige blottene med koblingsspesifikke antistoffer.

Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

In Vitro Analyse av PDZ-avhengige CFTR makromolekylær signalveier Komplekser

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Rapid Genetic Analysis of epitelial-mesenchymale signaleringsprotokoll Under Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer's Vesicle

Analyse av gen-funksjon og visualisering av Cilia-generert Væskestrøm i Kupffer sin Vesikkel

Internal organs such as the  heart, brain, and gut develop left-right (LR) asymmetries that are critical for  their normal functions1. Motile cilia are ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

siRNA Screening for å identifisere Ubiquitin og Ubiquitin-lignende system regulatorer av biologiske mekanismer i dyrkede pattedyrceller

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

Analyse av Nephron sammensetning og funksjon i voksen Sebrafisk Nyre

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

Funksjonell tilberedning og Channel Aktivitet Målinger av Renset villtype og Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

En Rapid Automatisert Protokoll for Muscle Fibre Befolkning Analyse i Rat Muskeltverrsnitt Bruke Myosin Heavy Chain Immunohistokjemi

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...