Name: in vitro analysis of e3 ubiquitin ligase function
Uploaded: 2021-05-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function at JoVE.com

Мы благодарим членов нашей лаборатории за критическое обсуждение и полезные советы по рукописи. Мы приносим извинения за то, что не процитировали ценные вклады из-за ограничения размера. Эта работа поддерживается Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Немецкий исследовательский фонд) - SFB 1218 - Projektnumber 269925409 и Cluster of Excellence EXC 229 / CECAD to TH. Эта работа финансировалась Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Немецкий исследовательский фонд) в рамках Стратегии передового опыта Германии - EXC 2030 - 390661388 и - SFB 1218 - Projektnumber 269925409 T.H. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der deutschen Exzellenzstrategie - EXC 2030 - 390661388 und - SFB 1218 - Projektnummer: 269925409 T.H. gefördert.

1. Подготовка буферов и реагентов
ПРИМЕЧАНИЕ: Буферы и реагенты, которые были вручную приготовлены в лаборатории, перечислены ниже. Все остальные буферы и реагенты, используемые в протоколах, закупались из разных источников и использовались в соответствии с инструкциями ?...

<ol>
	<li>Kuhlbrodt, K., Mouysset, J., Hoppe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchestra+for+assembly+and+fate+of+polyubiquitin+chains.">Orchestra for assembly and fate of polyubiquitin chains.</a> Essays in Biochemistry. 41, 1-14 (2005).</li><li>Pickart, C. M., Eddins, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin:+structures,+functions,+mechanisms.">Ubiquitin: structures, functions, mechanisms.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1695 (1-3), 55-72 (2004).</li><li>Dye, B. T., Schulman, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanisms+underlying+posttranslational+modification+by+ubiquitin-like+proteins.">Structural mechanisms underlying posttranslational modification by ubiquitin-like proteins.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36, 131-150 (2007).</li><li>Koegl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+ubiquitination+factor,+E4,+is+involved+in+multiubiquitin+chain+assembly.">A novel ubiquitination factor, E4, is involved in multiubiquitin chain assembly.</a> Cell. 96 (5), 635-644 (1999).</li><li>Hoppe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiubiquitylation+by+E4+enzymes:+'one+size'+doesn't+fit+all.">Multiubiquitylation by E4 enzymes: 'one size' doesn't fit all.</a> Trends in Biochemical Sciences. 30 (4), 183-187 (2005).</li><li>Stewart, M. D., Ritterhoff, T., Klevit, R. E., Brzovic, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E2+enzymes:+more+than+just+the+middle+men.">E2 enzymes: more than just the middle men.</a> Cell Research. 26 (4), 423-440 (2016).</li><li>Clague, M. J., Heride, C., Urb&#233;, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+demographics+of+the+ubiquitin+system.">The demographics of the ubiquitin system.</a> Trends in Cell Biology. 25 (7), 417-426 (2015).</li><li>Buetow, L., Huang, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+catalysis+and+regulation+of+E3+ubiquitin+ligases.">Structural insights into the catalysis and regulation of E3 ubiquitin ligases.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (10), 626-642 (2016).</li><li>French, M. E., Koehler, C. F., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+functions+of+branched+ubiquitin+chains.">Emerging functions of branched ubiquitin chains.</a> Cell Discovery. 7, 6 (2021).</li><li>Hatakeyama, S., Yada, M., Matsumoto, M., Ishida, N., Nakayama, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U+box+proteins+as+a+new+family+of+ubiquitin-protein+ligases.">U box proteins as a new family of ubiquitin-protein ligases.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (35), 33111-33120 (2001).</li><li>Herhaus, L., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+ubiquitin+code+through+post-translational+modification.">Expanding the ubiquitin code through post-translational modification.</a> EMBO Reports. 16 (9), 1071-1083 (2015).</li><li>Deshaies, R. J., Joazeiro, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RING+domain+E3+ubiquitin+ligases.">RING domain E3 ubiquitin ligases.</a> Annual Review of Biochemistry. 78, 399-434 (2009).</li><li>Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lingering+mysteries+of+ubiquitin-chain+assembly.">Lingering mysteries of ubiquitin-chain assembly.</a> Cell. 124 (1), 27-34 (2006).</li><li>Hoppe, T., Cohen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organismal+protein+homeostasis+mechanisms.">Organismal protein homeostasis mechanisms.</a> Genetics. 215 (4), 889-901 (2020).</li><li>Okiyoneda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+protein+quality+control+removes+unfolded+CFTR+from+the+plasma+membrane.">Peripheral protein quality control removes unfolded CFTR from the plasma membrane.</a> Science. 329 (5993), 805-810 (1997).</li><li>Tawo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ubiquitin+ligase+CHIP+integrates+proteostasis+and+aging+by+regulation+of+insulin+receptor+turnover.">The Ubiquitin ligase CHIP integrates proteostasis and aging by regulation of insulin receptor turnover.</a> Cell. 169 (3), 470-482 (2017).</li><li>Albert, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHIP+ubiquitylates+NOXA+and+induces+its+lysosomal+degradation+in+response+to+DNA+damage.">CHIP ubiquitylates NOXA and induces its lysosomal degradation in response to DNA damage.</a> Cell Death and Disease. 11 (9), 740 (2020).</li><li>Hoppe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+myosin-directed+chaperone+UNC-45+by+a+novel+E3/E4-multiubiquitylation+complex+in+C.+elegans.">Regulation of the myosin-directed chaperone UNC-45 by a novel E3/E4-multiubiquitylation complex in C. elegans.</a> Cell. 118 (3), 337-349 (2004).</li><li>Kim, J., L&#246;we, T., Hoppe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+quality+control+gets+muscle+into+shape.">Protein quality control gets muscle into shape.</a> Trends in Cell Biology. 18 (6), 264-272 (2008).</li><li>Janiesch, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-selective+chaperone+CDC-48/p97+links+myosin+assembly+to+human+myopathy.">The ubiquitin-selective chaperone CDC-48/p97 links myosin assembly to human myopathy.</a> Nature Cell Biology. 9 (4), 379-390 (2007).</li><li>Donkervoort, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+variants+in+the+myosin+chaperone+UNC-45B+cause+progressive+myopathy+with+eccentric+cores.">Pathogenic variants in the myosin chaperone UNC-45B cause progressive myopathy with eccentric cores.</a> The American Journal of Human Genetics. 107 (6), 1078-1095 (2020).</li><li>Murata, S., Minami, Y., Minami, M., Chiba, T., Tanaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHIP+is+a+chaperone-dependent+E3+ligase+that+ubiquitylates+unfolded+protein.">CHIP is a chaperone-dependent E3 ligase that ubiquitylates unfolded protein.</a> EMBO Reports. 2 (12), 1133-1138 (2001).</li><li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHIP+is+a+U-box-dependent+E3+ubiquitin+ligase:+identification+of+Hsc70+as+a+target+for+ubiquitylation.">CHIP is a U-box-dependent E3 ubiquitin ligase: identification of Hsc70 as a target for ubiquitylation.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (64), 42938-42944 (2001).</li><li>Yang, Y., Yu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+apoptosis:+the+ubiquitous+way.">Regulation of apoptosis: the ubiquitous way.</a> The FASEB Journal. 17 (8), 790-799 (2003).</li><li>Lamothe, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRAF6+ubiquitin+ligase+is+essential+for+RANKL+signaling+and+osteoclast+differentiation.">TRAF6 ubiquitin ligase is essential for RANKL signaling and osteoclast differentiation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communication. 359 (4), 1044-1049 (2007).</li><li>Amemiya, Y., Azmi, P., Seth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoubiquitination+of+BCA2+RING+E3+ligase+regulates+its+own+stability+and+affects+cell+migration.">Autoubiquitination of BCA2 RING E3 ligase regulates its own stability and affects cell migration.</a> Molecular Cancer Research. 6 (9), 1385 (2008).</li><li>Brzovic, P. S., Lissounov, A., Christensen, D. E., Hoyt, D. W., Klevit, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+UbcH5/ubiquitin+noncovalent+complex+is+required+for+processive+BRCA1-directed+ubiquitination.">A UbcH5/ubiquitin noncovalent complex is required for processive BRCA1-directed ubiquitination.</a> Molecular Cell. 21 (6), 873-880 (2006).</li><li>Sakata, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+UbcH5b~ubiquitin+intermediate:+Insight+into+the+formation+of+the+self-assembled+E2~Ub+conjugates.">Crystal structure of UbcH5b~ubiquitin intermediate: Insight into the formation of the self-assembled E2~Ub conjugates.</a> Structure. 18 (1), 138-147 (2010).</li><li>Eddins, M. J., Carlile, C. M., Gomez, K. M., Pickart, C. M., Wolberger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mms2-Ubc13+covalently+bound+to+ubiquitin+reveals+the+structural+basis+of+linkage-specific+polyubiquitin+chain+formation.">Mms2-Ubc13 covalently bound to ubiquitin reveals the structural basis of linkage-specific polyubiquitin chain formation.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 13 (10), 915-920 (2006).</li><li>Buetow, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+a+primed+RING+E3-E2+ubiquitin+complex+by+non-covalent+ubiquitin.">Activation of a primed RING E3-E2 ubiquitin complex by non-covalent ubiquitin.</a> Molecular Cell. 58 (2), 297-310 (2015).</li><li>Dou, H., Buetow, L., Sibbet, G. J., Cameron, K., Huang, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BIRC7-E2+ubiquitin+conjugate+structure+reveals+the+mechanism+of+ubiquitin+transfer+by+a+RING+dimer.">BIRC7-E2 ubiquitin conjugate structure reveals the mechanism of ubiquitin transfer by a RING dimer.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 19 (9), 876-883 (2012).</li><li>McKenna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncovalent+interaction+between+ubiquitin+and+the+human+DNA+repair+protein+Mms2+is+required+for+Ubc13-mediated+polyubiquitination.">Noncovalent interaction between ubiquitin and the human DNA repair protein Mms2 is required for Ubc13-mediated polyubiquitination.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (43), 40120-40125 (2001).</li><li>Plechanovov&#225;, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+ubiquitylation+by+dimeric+RING+ligase+RNF4.">Mechanism of ubiquitylation by dimeric RING ligase RNF4.</a> Nature Structural Biology. 18 (9), 1052-1059 (2011).</li><li>Pierce, N. W., Kleiger, G., Shan, S. O., Deshaies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+sequential+polyubiquitylation+on+a+millisecond+timescale.">Detection of sequential polyubiquitylation on a millisecond timescale.</a> Nature. 462 (7273), 615-619 (2009).</li><li>Jain, A. K., Barton, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+p53:+TRIM24+enters+the+RING.">Regulation of p53: TRIM24 enters the RING.</a> Cell Cycle. 8 (22), 3668-3674 (2009).</li><li>Swatek, K. N., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+modifications.">Ubiquitin modifications.</a> Cell Research. 26, 399-422 (2016).</li><li>Yan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+K63-linked+polyubiquitination+in+cardiac+hypertrophy.">The role of K63-linked polyubiquitination in cardiac hypertrophy.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (10), 4558-4567 (2018).</li><li>Dammer, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyubiquitin+linkage+profiles+in+three+models+of+proteolytic+stress+suggest+the+etiology+of+Alzheimer+disease.">Polyubiquitin linkage profiles in three models of proteolytic stress suggest the etiology of Alzheimer disease.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 10457-10465 (2011).</li></ol>

В статье описаны основные методы убиквитилирования in vitro для анализа функции Е3 лигазы. При выполнении анализов убиквитилирования in vitro следует учитывать, что некоторые ферменты E2 могут выполнять аутоубиквитилирование вследствие атаки их активного цистеина на собственные ос...

Убиквитилирование — это процесс, посредством которого Ub ковалентно связан с субстратным белком1. Модификация Ub катализируется последовательными ферментативными реакциями, включающими действие трех различных классов ферментов, т.е.Ub-активирующих ферментов (E1s), Ub-конъюгирующих ферментов (E2s), Ub-лигазов (E3s) и, возможно, факторов удлинения цепи Ub (E4s)2,3,4,5. После аденозинтрифосфатной (АТФ)- имагниевой (Mg 2+)-зависимой активации Ub Е1, активный сайт цистеина Е1 атакует С-концевой глицин Ub, образуя тиофирный комплекс (Ub~E1). Энергия, получаемая от гидролиза АТФ, заставляет Ub достигать переходного состояния высокой энергии, которое поддерживается на протяжении всего следующего каскада ферментов. Затем фермент E2 переносит активированный Ub к своему внутреннему каталитическому цистеину, тем самым образуя переходную тиофирную связь Ub ~ E2. Впоследствии Ub переносится в субстрат белка.
Это можно сделать двумя способами. Либо Е3-лигаза может сначала связываться с Е2, либо Е3-лигаза может непосредственно связывать Ub. Последний способ приводит к образованию промежуточного продукта E3 ~Ub. В любом случае Ub связывается с белком субстрата путем образования изопептидной связи между С-концевой карбоксильной группой Ub и лизиновой Ɛ-аминогруппой субстрата6. Геном человека кодирует два E1, примерно 40 E2s и более 600 предполагаемых убиквитиновыхлигасов 7. Основываясь на механизме переноса Ub E3, лигазы Ub разделены на три категории, включающие гомологичный тип E6AP C-Terminus (HECT), действительно интересный новый ген (RING) / U-box-тип и RING между лигами типа RING (RBR)8. В этом исследовании U-бокс, содержащий лигазу, карбоксильный конец HSC70-взаимодействующего белка (CHIP), используется в качестве репрезентативного фермента E3. В отличие от ферментов HECT-типа E3, которые образуют тиоэфиры Ub~E3, домен U-box CHIP связывает E2~Ub и способствует последующему переносу Ub/субстрат непосредственно из фермента E28,9. Исходя из важности U-box для ферментативной функции, в качестве контроля используется неактивный мутант CHIP U-box, CHIP(H260Q). CHIP(H260Q) не связывается со своим родственным E2s, тем самым теряя свою активность E3 лигазы10.
Убиквитилирование белка играет решающую роль в регулировании множества клеточных событий в эукариотических клетках. Разнообразие клеточных исходов, которым способствует обратимое присоединение молекул Ub к белкам субстрата, можно отнести к молекулярным характеристикам Ub. Поскольку сам Ub содержит семь остатков лизина (K) для дальнейшего убиквитилирования, существует богатое разнообразие типов цепей Ub с различными размерами и/или топологиями11. Например, субстраты могут быть модифицированы одной молекулой Ub на одной (моноубиквитилирование) или несколькими лизинами (мультимоноубиквитилирование), и даже цепями Ub (полиубиквитилирование)11. Ub-цепи образуются гомо- или гетеротипически через одни и те же или разные остатки лизина Ub, что может даже привести к разветвленным цепям Ub9. Таким образом, убиквитилирование белка приводит к разнообразному расположению молекул Ub, которые предоставляют специфическую информацию, например,для деградации, активации или локализации конъюгированных белков12,13. Эти различные сигналы Ub позволяют быстро перепрограммировать клеточные сигнальные пути, что является важным требованием для способности клетки реагировать на изменяющиеся потребности окружающей среды.
Центральный аспект убиквитилирования связан с контролем качества белка. Неправильно свернутые или необратимо поврежденные белки должны быть деградированы и заменены вновь синтезированными белками для поддержания белкового гомеостаза или протеостаза14. Контроль качества E3 лигазы, CHIP, сотрудничает с молекулярными шаперонами в Ub-зависимой деградации поврежденных белков9,15,16,17. Кроме того, CHIP регулирует стабильность миозин-направленного шаперона, UNC-45B (Unc-45 Homolog B), который тесно координируется с мышечной функцией и отклонения от оптимальных уровней приводят к миопатии человека18,19,20,21. Деградация UNC-45B протеасомой 26S опосредована присоединением K48-связанной поли-Ub цепи9. При отсутствии субстратных белков ЧИП выполняет аутоубиквитилирование10,22,23,что характерно для RING/U-box E3 убиквитиновых лигазов24,25 и считается регулирующим активность лигазы26. Применение методов анализа убиквитилирования in vitro, описанных в данной работе, помогло систематически идентифицировать ферменты E2, которые объединяются с CHIP для содействия образованию свободных поли-Ub цепей и/или автоубиквитилированию CHIP (раздел протокола 2). Кроме того, наблюдалось ЧИП-зависимое убиквитилирование UNC-45B, которое является известным субстратом Е3 лигазы18,19 (раздел протокола 3). В конечном счете, контролировалась CHIP-зависимая передача активированного Ub из тиоэфира Ub~E2 (раздел протокола 4).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amershan Protran 0.1 &#181;m NC</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>10600000</td>
			<td>nitrocellulose membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CHIP</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2080</td>
			<td>Monoclonal rabbit anti-CHIP antibody, clone C3B6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MYC</td>
			<td>Roche</td>
			<td>OP10</td>
			<td>Monoclonal mouse anti-MYC antibody, clone 9E10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ubiquitin</td>
			<td>Upstate</td>
			<td>05-944</td>
			<td>Monoclonal mouse anti-Ub antibody, clone P4D1-A11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apyrase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6535-100UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP (10x)</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>12091903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6003-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8043.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6781.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P749.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3904.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDS sample buffer (4x)</td>
			<td>novex</td>
			<td>B0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5501-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4256.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MeOH</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>2,08,47,307</td>
			<td>100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milchpulver</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T145.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P029.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Antioxidant</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>NP0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Transfer buffer (20x)</td>
			<td>novex</td>
			<td>NP0006-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Page ruler plus</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>26619</td>
			<td>Protein ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RotiBlock</td>
			<td>Roth</td>
			<td>A151.1</td>
			<td>Blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (20%)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>1057.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1000 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1852196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1704150EDU</td>
			<td>Transfer system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4855.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9127.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UbcH Enzyme Set</td>
			<td>BostonBiochem</td>
			<td>K-980B</td>
			<td>E2 enzymes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubiquitin</td>
			<td>BostonBiochem</td>
			<td>U-100H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubiquitin-activating enzyme E1</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>BML-UW941U-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubiquitylation buffer (10x)</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>BML-KW9885-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman blotting paper</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1703969</td>
			<td>Extra thick filter paper</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro analysis of e3 ubiquitin ligase function

Ковалентное присоединение убиквитина (Ub) к внутреннему остатку (остаткам) лизина субстратного белка, процесс, называемый убиквитилированием, представляет собой одну из наиболее важных посттрансляционных модификаций в эукариотических организмах. Убиквитилирование опосредовано последовательным каскадом из трех классов ферментов, включая убиквитин-активирующие ферменты (ферменты E1), убиквитин-конъюгирующие ферменты (ферменты E2) и убиквитиновые лигазы (ферменты E3), а иногда и факторы удлинения убиквитиновой цепи (ферменты E4). Здесь представлены протоколы in vitro для анализов убиквитилирования, которые позволяют оценить активность убиквитин-лигазы E3, сотрудничество между парами E2-E3 и выбор субстрата. Сотрудничающие пары E2-E3 могут быть проверены путем мониторинга генерации свободных полиубиквитиновых цепей и/или автоубиквитилирования лигазы E3. Убиквитилирование субстрата определяется селективным связыванием Е3-лигазы и может быть обнаружено путем западного блоттинга реакции in vitro. Кроме того, описан анализ разряда E2~Ub, который является полезным инструментом для прямой оценки функционального сотрудничества E2-E3. Здесь Е3-зависимый перенос убиквитина следует из соответствующего фермента Е2 на свободные аминокислоты лизина (имитирующие убиквитилирование субстрата) или внутренние лизины самой Е3-лигазы (аутоубиквитилирование). В заключение, представлены три различных протокола in vitro, которые быстро и легко выполняются для решения каталитической функциональности E3-лигазы.

Чтобы идентифицировать ферменты E2, которые сотрудничают с убиквитин-лигазой CHIP, набор кандидатов E2 был протестирован в отдельных реакциях убиквитилирования in vitro. Взаимодействующие пары E2-E3 контролировали путем образования Е3-зависимых продуктов убиквитилирования, т.е.автоу...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function at JoVE.com

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

В настоящем исследовании представлены подробные протоколы анализа убиквитилирования in vitro для анализа каталитической активности убиквитинлигазы E3. Рекомбинантные белки экспрессировали с использованием прокариотических систем, таких как культура кишечной палочки.

В пробирке Анализ функции E3 убиквитин лигазы

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...

Общей целью этого протокола является анализ важных ключевых аспектов функции Е3 лигазы, включая специфичность фермента Е2, выбор субстрата и перенос убиквитина. Основным преимуществом данной методики является ее широкая применимость, так как белки из всех эукариотических источников могут быть рекомбинантно экспрессированы и изучены in vitro без необходимости использования специального оборудования. При первом использовании метода разгрузки лизина важно оптимизировать параметры анализа, такие как концентрации ферментов, чтобы определить идеальные условия разряда для выбранной Е3-лигазы.Чтобы выполнить анализ автоубиквитилирования in vitro, настройте схему пипетирования для проверки функциональной способности различных ферментов E2 и подготовьте мастер-смесь на льду для всех реакций убиквитилирования плюс одна дополнительная реакция. Далее добавляют один микромоляр ферментов Е2 в соответствующие пробирки и инкубируют образцы в термоциклере ПЦР в течение двух часов при указанных условиях. После инкубации добавьте буфер образца SDS к каждой реакции и перемешайте путем пипетирования несколько раз.Затем немедленно вскипятите образцы при 95 градусах Цельсия в течение пяти минут и храните денатурированные белки при 20 градусах Цельсия. Чтобы выполнить анализ убиквитилирования субстрата in vitro, подготовьте схему пипетирования для всех реакций. После расчета количества мастер-микса, необходимого для одной реакции, подготовьте мастер-микс для всех реакций на льду и добавьте мастер-микс в каждую трубку.Добавьте соответствующие лигазы E3 по отдельности. Затем инкубируйте образцы в термоциклере ПЦР в течение двух часов, как показано. В конце инкубации добавьте два раза буфер образцов SDS к каждой реакции, перемешайте несколько раз путем пипетирования и кипятите образцы в течение пяти минут при 95 градусах Цельсия.Чтобы выполнить анализ разряда лизина, настройте схему пипетирования для реакции зарядки и инкубируйте реакции зарядки в течение 15 минут при 37 градусах Цельсия. Чтобы остановить реакцию зарядки, добавляют апиразу до конечной концентрации 1,8 единицы на миллилитр и инкубируют реакцию в течение пяти минут при комнатной температуре. В конце инкубации добавляют ЭДТА к конечной концентрации 30 миллимоляров и используют двойную дистиллированную воду для регулировки объема реакции до 30 микролитров.Чтобы разрядить убиквитилирование E2 методом E3, установите пять пробирок, соответствующих временным точкам эксперимента, добавьте 6,7 микролитра невосстанавливающегося буфера образца в каждую трубку, удалите шесть микролитров остановленной реакции зарядки из нулевой трубки точки времени и отрегулируйте общий объем до 26,7 микролитров. Чтобы настроить реакции разряда, добавьте к каждой реакции двойную дистиллированную воду, буфер убиквитилирования, BSA, лизин, Е3 лигазу и заряженный Е2. По истечении выбранных периодов времени перенесите 20-микролитровые образцы из каждой реакции разряда в соответствующую пробку.Затем немедленно вихрьте образцы и поместите их при 70 градусах Цельсия на 10 минут. В этом репрезентативном анализе вестерн-блоттинга неактивный CHIP не был автоматически убиквитилирован. Однако E3-независимые убиквитиновые продукты формировались в присутствии неактивного ЧИПА и при отсутствии ЧИПА.ЧИП дикого типа был автоубиквитилирован в сочетании с белками семейств UBE2D и UBE2E, тогда как свободные полиубиквитиновые цепи были получены в сотрудничестве с белками семейства UBE2D, но не с белками семейства UBE2E. Связывание убиквитина UBE2N/V1 направляло образование свободных убиквитиновых цепей. Автоубиквитилирование и убиквитилирование UNC-45B наблюдалось с ЧИПом дикого типа, но не с неактивным мутантом ЧИПА, что указывает на то, что UNC-45B действует как консервированная субстрата для ЧИПА.Когда каталитическая активность CHIP была проанализирована с использованием анализа разряда лизина, незаряженный фермент UBE2D2 имел молекулярную массу 17 килодалтон, а заряженный UBE2D2 с одной молекулой убиквитина имел молекулярную массу примерно 26 килодалтонов. В момент 0 наблюдался весь заряженный выход E2. В присутствии неактивного ЧИПа был обнаружен слабый E3-лигазно-независимый разряд UBE2D2, но не автоубиквитилирование CHIP.В присутствии чипа дикого типа разряд UBE2D2 был быстрым и завершенным в течение 60 минут, а автоубиквитилирование CHIP указывало на перенос убиквитина на собственные остатки лизина. Из-за ограниченной способности E2 работайте как можно быстрее и немедленно приступайте к реакции разряда с последующим SDS-PAGE и вестерн-блоттингом. Следуя этим протоколам убиквитилирования in vitro, специфические типы связей убиквитилирования могут быть идентифицированы путем зондирования западных пятен антителами, специфичными для связи.

Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

Важность правильной концентрации белка для кинетики и Affinity Определение в структурно-функционального анализа

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Анализ развития Морфологические Фенотип как функция концентрации белка в почкующихся дрожжей

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Анализ Шванн-астроцитов взаимодействий с использованием In Vitro Анализы

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

In Vitro Анализ PDZ-зависимый CFTR высокомолекулярных комплексов сигнализации

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Быстрое Генетический анализ эпителиальных мезенхимальных сигнализации во время регенерации волос

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer's Vesicle

Анализ функций генов и визуализации реснички, созданного потока жидкости в Vesicle Купфера

Internal organs such as the  heart, brain, and gut develop left-right (LR) asymmetries that are critical for  their normal functions1. Motile cilia are ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

миРНК Скрининг для идентификации Убиквитин и Убиквитин-подобной системе регуляторов биологических путей в культивируемых клетках млекопитающих

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

Анализ нефрона Состав и функции в почках взрослых данио рерио

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

Функциональная Реорганизация и активности канала измерения очищенной дикого типа и мутантных CFTR белка

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

Быстрый Автоматизированный протокол для мышечного волокна Анализ населения в Rat Muscle разделов Креста с использованием тяжелой цепи миозина иммуногистохимии

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...