Name: in vitro analysis of e3 ubiquitin ligase function
Uploaded: 2021-05-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function at JoVE.com

Vi tackar medlemmarna i vårt laboratorium för kritisk diskussion och hjälpsamma råd om manuskriptet. Vi ber om ursäkt för att vi inte har citerat värdefulla bidrag på grund av storleksbegränsning. Detta arbete stöds av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) - SFB 1218 - Projektnumber 269925409 och Cluster of Excellence EXC 229 / CECAD till TH. Detta arbete finansierades av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Tyska forskningsstiftelsen) under Tysklands excellence strategy - EXC 2030 - 390661388 och - SFB 1218 - Projektnumber 269925409 till T.H. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der deutschen Exzellenzstrategie - EXC 2030 - 390661388 und - SFB 1218 - Projektnummer: 269925409 an T.H. gefördert.

1. Beredning av buffertar och reagenser
OBS: Buffertar och reagenser som manuellt bereddes i laboratoriet listas nedan. Alla andra buffertar och reagenser som användes i protokollen köptes från olika källor och användes enligt tillverkarnas instruktioner.
<ol><li>Förbered 10x fosfatbuffrad saltlösning (10x PBS). Blanda för detta ändamål 1,37 M natriumklorid (NaCl), 27 mM kaliumklorid (KCl), 80 mM disodium-vätefosfatdihydrat (Na2HPO4.2H2O) och 20 mM...

<ol>
	<li>Kuhlbrodt, K., Mouysset, J., Hoppe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orchestra+for+assembly+and+fate+of+polyubiquitin+chains.">Orchestra for assembly and fate of polyubiquitin chains.</a> Essays in Biochemistry. 41, 1-14 (2005).</li><li>Pickart, C. M., Eddins, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin:+structures,+functions,+mechanisms.">Ubiquitin: structures, functions, mechanisms.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1695 (1-3), 55-72 (2004).</li><li>Dye, B. T., Schulman, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+mechanisms+underlying+posttranslational+modification+by+ubiquitin-like+proteins.">Structural mechanisms underlying posttranslational modification by ubiquitin-like proteins.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36, 131-150 (2007).</li><li>Koegl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+ubiquitination+factor,+E4,+is+involved+in+multiubiquitin+chain+assembly.">A novel ubiquitination factor, E4, is involved in multiubiquitin chain assembly.</a> Cell. 96 (5), 635-644 (1999).</li><li>Hoppe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiubiquitylation+by+E4+enzymes:+'one+size'+doesn't+fit+all.">Multiubiquitylation by E4 enzymes: 'one size' doesn't fit all.</a> Trends in Biochemical Sciences. 30 (4), 183-187 (2005).</li><li>Stewart, M. D., Ritterhoff, T., Klevit, R. E., Brzovic, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E2+enzymes:+more+than+just+the+middle+men.">E2 enzymes: more than just the middle men.</a> Cell Research. 26 (4), 423-440 (2016).</li><li>Clague, M. J., Heride, C., Urb&#233;, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+demographics+of+the+ubiquitin+system.">The demographics of the ubiquitin system.</a> Trends in Cell Biology. 25 (7), 417-426 (2015).</li><li>Buetow, L., Huang, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+catalysis+and+regulation+of+E3+ubiquitin+ligases.">Structural insights into the catalysis and regulation of E3 ubiquitin ligases.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (10), 626-642 (2016).</li><li>French, M. E., Koehler, C. F., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+functions+of+branched+ubiquitin+chains.">Emerging functions of branched ubiquitin chains.</a> Cell Discovery. 7, 6 (2021).</li><li>Hatakeyama, S., Yada, M., Matsumoto, M., Ishida, N., Nakayama, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=U+box+proteins+as+a+new+family+of+ubiquitin-protein+ligases.">U box proteins as a new family of ubiquitin-protein ligases.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (35), 33111-33120 (2001).</li><li>Herhaus, L., Dikic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+ubiquitin+code+through+post-translational+modification.">Expanding the ubiquitin code through post-translational modification.</a> EMBO Reports. 16 (9), 1071-1083 (2015).</li><li>Deshaies, R. J., Joazeiro, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RING+domain+E3+ubiquitin+ligases.">RING domain E3 ubiquitin ligases.</a> Annual Review of Biochemistry. 78, 399-434 (2009).</li><li>Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lingering+mysteries+of+ubiquitin-chain+assembly.">Lingering mysteries of ubiquitin-chain assembly.</a> Cell. 124 (1), 27-34 (2006).</li><li>Hoppe, T., Cohen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organismal+protein+homeostasis+mechanisms.">Organismal protein homeostasis mechanisms.</a> Genetics. 215 (4), 889-901 (2020).</li><li>Okiyoneda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+protein+quality+control+removes+unfolded+CFTR+from+the+plasma+membrane.">Peripheral protein quality control removes unfolded CFTR from the plasma membrane.</a> Science. 329 (5993), 805-810 (1997).</li><li>Tawo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ubiquitin+ligase+CHIP+integrates+proteostasis+and+aging+by+regulation+of+insulin+receptor+turnover.">The Ubiquitin ligase CHIP integrates proteostasis and aging by regulation of insulin receptor turnover.</a> Cell. 169 (3), 470-482 (2017).</li><li>Albert, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHIP+ubiquitylates+NOXA+and+induces+its+lysosomal+degradation+in+response+to+DNA+damage.">CHIP ubiquitylates NOXA and induces its lysosomal degradation in response to DNA damage.</a> Cell Death and Disease. 11 (9), 740 (2020).</li><li>Hoppe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+myosin-directed+chaperone+UNC-45+by+a+novel+E3/E4-multiubiquitylation+complex+in+C.+elegans.">Regulation of the myosin-directed chaperone UNC-45 by a novel E3/E4-multiubiquitylation complex in C. elegans.</a> Cell. 118 (3), 337-349 (2004).</li><li>Kim, J., L&#246;we, T., Hoppe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+quality+control+gets+muscle+into+shape.">Protein quality control gets muscle into shape.</a> Trends in Cell Biology. 18 (6), 264-272 (2008).</li><li>Janiesch, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ubiquitin-selective+chaperone+CDC-48/p97+links+myosin+assembly+to+human+myopathy.">The ubiquitin-selective chaperone CDC-48/p97 links myosin assembly to human myopathy.</a> Nature Cell Biology. 9 (4), 379-390 (2007).</li><li>Donkervoort, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+variants+in+the+myosin+chaperone+UNC-45B+cause+progressive+myopathy+with+eccentric+cores.">Pathogenic variants in the myosin chaperone UNC-45B cause progressive myopathy with eccentric cores.</a> The American Journal of Human Genetics. 107 (6), 1078-1095 (2020).</li><li>Murata, S., Minami, Y., Minami, M., Chiba, T., Tanaka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHIP+is+a+chaperone-dependent+E3+ligase+that+ubiquitylates+unfolded+protein.">CHIP is a chaperone-dependent E3 ligase that ubiquitylates unfolded protein.</a> EMBO Reports. 2 (12), 1133-1138 (2001).</li><li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHIP+is+a+U-box-dependent+E3+ubiquitin+ligase:+identification+of+Hsc70+as+a+target+for+ubiquitylation.">CHIP is a U-box-dependent E3 ubiquitin ligase: identification of Hsc70 as a target for ubiquitylation.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (64), 42938-42944 (2001).</li><li>Yang, Y., Yu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+apoptosis:+the+ubiquitous+way.">Regulation of apoptosis: the ubiquitous way.</a> The FASEB Journal. 17 (8), 790-799 (2003).</li><li>Lamothe, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRAF6+ubiquitin+ligase+is+essential+for+RANKL+signaling+and+osteoclast+differentiation.">TRAF6 ubiquitin ligase is essential for RANKL signaling and osteoclast differentiation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communication. 359 (4), 1044-1049 (2007).</li><li>Amemiya, Y., Azmi, P., Seth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoubiquitination+of+BCA2+RING+E3+ligase+regulates+its+own+stability+and+affects+cell+migration.">Autoubiquitination of BCA2 RING E3 ligase regulates its own stability and affects cell migration.</a> Molecular Cancer Research. 6 (9), 1385 (2008).</li><li>Brzovic, P. S., Lissounov, A., Christensen, D. E., Hoyt, D. W., Klevit, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+UbcH5/ubiquitin+noncovalent+complex+is+required+for+processive+BRCA1-directed+ubiquitination.">A UbcH5/ubiquitin noncovalent complex is required for processive BRCA1-directed ubiquitination.</a> Molecular Cell. 21 (6), 873-880 (2006).</li><li>Sakata, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+UbcH5b~ubiquitin+intermediate:+Insight+into+the+formation+of+the+self-assembled+E2~Ub+conjugates.">Crystal structure of UbcH5b~ubiquitin intermediate: Insight into the formation of the self-assembled E2~Ub conjugates.</a> Structure. 18 (1), 138-147 (2010).</li><li>Eddins, M. J., Carlile, C. M., Gomez, K. M., Pickart, C. M., Wolberger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mms2-Ubc13+covalently+bound+to+ubiquitin+reveals+the+structural+basis+of+linkage-specific+polyubiquitin+chain+formation.">Mms2-Ubc13 covalently bound to ubiquitin reveals the structural basis of linkage-specific polyubiquitin chain formation.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 13 (10), 915-920 (2006).</li><li>Buetow, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+a+primed+RING+E3-E2+ubiquitin+complex+by+non-covalent+ubiquitin.">Activation of a primed RING E3-E2 ubiquitin complex by non-covalent ubiquitin.</a> Molecular Cell. 58 (2), 297-310 (2015).</li><li>Dou, H., Buetow, L., Sibbet, G. J., Cameron, K., Huang, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BIRC7-E2+ubiquitin+conjugate+structure+reveals+the+mechanism+of+ubiquitin+transfer+by+a+RING+dimer.">BIRC7-E2 ubiquitin conjugate structure reveals the mechanism of ubiquitin transfer by a RING dimer.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 19 (9), 876-883 (2012).</li><li>McKenna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncovalent+interaction+between+ubiquitin+and+the+human+DNA+repair+protein+Mms2+is+required+for+Ubc13-mediated+polyubiquitination.">Noncovalent interaction between ubiquitin and the human DNA repair protein Mms2 is required for Ubc13-mediated polyubiquitination.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (43), 40120-40125 (2001).</li><li>Plechanovov&#225;, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+ubiquitylation+by+dimeric+RING+ligase+RNF4.">Mechanism of ubiquitylation by dimeric RING ligase RNF4.</a> Nature Structural Biology. 18 (9), 1052-1059 (2011).</li><li>Pierce, N. W., Kleiger, G., Shan, S. O., Deshaies, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+sequential+polyubiquitylation+on+a+millisecond+timescale.">Detection of sequential polyubiquitylation on a millisecond timescale.</a> Nature. 462 (7273), 615-619 (2009).</li><li>Jain, A. K., Barton, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+p53:+TRIM24+enters+the+RING.">Regulation of p53: TRIM24 enters the RING.</a> Cell Cycle. 8 (22), 3668-3674 (2009).</li><li>Swatek, K. N., Komander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitin+modifications.">Ubiquitin modifications.</a> Cell Research. 26, 399-422 (2016).</li><li>Yan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+K63-linked+polyubiquitination+in+cardiac+hypertrophy.">The role of K63-linked polyubiquitination in cardiac hypertrophy.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (10), 4558-4567 (2018).</li><li>Dammer, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyubiquitin+linkage+profiles+in+three+models+of+proteolytic+stress+suggest+the+etiology+of+Alzheimer+disease.">Polyubiquitin linkage profiles in three models of proteolytic stress suggest the etiology of Alzheimer disease.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 10457-10465 (2011).</li></ol>

Detta dokument beskriver grundläggande in vitro ubiquitylation metoder för analys av E3 ligase funktion. Vid in vitro-allestädes närvarande analyser bör det anses att vissa E2-enzymer kan utföra auto-allestädes närvarande på grund av attacken av deras aktiva cystein på sina egna lysinrester som ligger i närheten av den aktiva platsen30. För att kringgå detta problem rekommenderas användning av en E2-mutant där respektive lysinrester byts ut mot arginin, vilket res...

Ubiquitylation är den process genom vilken Ub är kovalent kopplad till ett substratprotein1. Ub-modifieringen katalyseras av successiva enzymatiska reaktioner som involverar verkan av tre olika enzymklasser, dvs.Ub-aktiverande enzymer (E1s), Ubkonjugerande enzymer (E2s), Ub ligases (E3s) och eventuellt Ub-kedjeförlängningsfaktorer (E4s)2,3,4 ,4,5. Efter adenosintrifosfat (ATP) - och magnesium (Mg2+) beroende aktivering av Ub av E1, attackerar den aktiva platsen cystein av E1 C-terminal glycin av Ub, bildar ett tioesterkomplex (Ub ~ E1). Energin som dras från ATP-hydrolys gör att Ub uppnår ett övergångstillstånd med hög energi, som upprätthålls i hela följande enzymkaskad. Därefter överför E2-enzymet den aktiverade Ub till sin inre katalytiska cystein och bildar därmed en övergående Ub ~ E2 tioesterbindning. Därefter överförs Ub till substratproteinet.
Detta kan göras på två sätt. Antingen kan E3-ligasen först binda till E2, eller så kan E3-ligasen direkt binda Ub. Det senare sättet resulterar i bildandet av en E3 ~ Ub-mellanliggande. I båda fallen är Ub kopplat till substratproteinet genom bildandet av en isopeptidbindning mellan C-terminalkarboxylgruppen Ub och lysin-aminogruppen i substratet6. Det mänskliga genomet kodar två E1: or, cirka 40 E2 och mer än 600 förmodade ubiquitin ligases7. Baserat på Ub-överföringsmekanismen för E3 är Ub ligases indelade i tre kategorier som involverar Homologous till E6AP C-Terminus (HECT)-typ, Riktigt intressant ny gen (RING)/U-box-typ och RING mellan RING (RBR)-typ ligases8. I denna studie används U-boxen som innehåller ligas, Carboxyl Terminus av HSC70-interagerande protein (CHIP), som ett representativt E3-enzym. I motsats till HECT-typ E3 enzymer som bildar Ub ~ E3 tioesters, U-box domänen chip binder E2 ~ Ub och främjar efterföljande Ub / substrat överföring direkt från E2 enzym8,9. Baserat på vikten av U-boxen för enzymatisk funktion används en inaktiv CHIP U-box mutant, CHIP(H260Q), som en kontroll. CHIP(H260Q) binder inte till sin cognate E2s, vilket förlorar sin E3 ligase-aktivitet10.
Protein ubiquitylation spelar en avgörande roll för att reglera en mängd cellulära händelser i eukaryota celler. Mångfalden av cellulära resultat som främjas av reversibel fastsättning av Ub-molekyler till substratproteiner kan hänföras till Ubs molekylära egenskaper. Eftersom Ub själv innehåller sju lysin (K) rester för ytterligare allestädes närvarande, finns det ett rikt utbud av Ub kedjetyper med olika storlekar och / eller topologier11. Till exempel kan substrat modifieras av en enda Ub-molekyl vid en (mono-ubiquitylation) eller flera lysiner (multimono-ubiquitylation), och även av Ub-kedjor (poly-allestädes närvarande)11. Ubkedjor bildas antingen homo- eller heterotypiskt via samma eller olika lysinrester av Ub, vilket till och med kan resultera i förgrenade Ub-kedjor9. Således leder proteinubiquitylation till olika arrangemang av Ub-molekyler som ger specifik information, t.ex.för nedbrytning, aktivering eller lokalisering av konjugerade proteiner12,13. Dessa olika Ub-signaler möjliggör snabb omprogrammering av cellulära signalvägar, vilket är ett viktigt krav för cellens förmåga att svara på förändrade miljöbehov.
En central aspekt av allestädes närvarande är relaterad till proteinkvalitetskontroll. Felveckade eller irreversibelt skadade proteiner måste brytas ned och ersättas av nyligen syntetiserade proteiner för att upprätthålla proteinhomeostas eller proteostas14. Kvalitetskontroll E3 ligase, CHIP, samarbetar med molekylära förkläden i den Ub-beroende nedbrytningen av skadade proteiner9,15,16,17. Bortsett från detta reglerar CHIP stabiliteten hos det myosinstyrda förklädet, UNC-45B (Unc-45 Homolog B), som är tätt samordnad med muskelfunktion och avvikelser från de optimala nivåerna leder till mänsklig myopati18,19,20,21. Nedbrytning av UNC-45B av 26S proteasomen förmedlas genom fastsättning av en K48-länkad poly-Ub kedja9. I avsaknad av substratproteiner utför CHIP auto-ubiquitylation10,22,23, vilket är karakteristiskt för RING / U-box E3 ubiquitin ligases24,25 och anses reglera ligasaktivitet26. Tillämpning av de in vitro-allestädes närvarande assaymetoder som beskrivs i detta dokument hjälpte till att systematiskt identifiera E2-enzymer som samarbetar med CHIP för att främja bildandet av fria poly-Ub-kedjor och/eller automatisk allestädes närvarande ingning av CHIP (protokoll avsnitt 2). Dessutom observerades CHIP-beroende allestädes närvarande ubiquitylation av UNC-45B, som är ett känt substrat av E3 ligase18,19 (protokoll avsnitt 3). I slutändan övervakades CHIP-beroende överföring av aktiverad Ub från Ub ~ E2-tioester (protokoll avsnitt 4).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amershan Protran 0.1 &#181;m NC</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>10600000</td>
			<td>nitrocellulose membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CHIP</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>2080</td>
			<td>Monoclonal rabbit anti-CHIP antibody, clone C3B6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MYC</td>
			<td>Roche</td>
			<td>OP10</td>
			<td>Monoclonal mouse anti-MYC antibody, clone 9E10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ubiquitin</td>
			<td>Upstate</td>
			<td>05-944</td>
			<td>Monoclonal mouse anti-Ub antibody, clone P4D1-A11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apyrase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6535-100UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP (10x)</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>12091903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6003-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Roth</td>
			<td>8043.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Roth</td>
			<td>6781.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P749.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3904.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LDS sample buffer (4x)</td>
			<td>novex</td>
			<td>B0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L5501-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4256.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MeOH</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>2,08,47,307</td>
			<td>100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milchpulver</td>
			<td>Roth</td>
			<td>T145.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Roth</td>
			<td>P029.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Antioxidant</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>NP0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Transfer buffer (20x)</td>
			<td>novex</td>
			<td>NP0006-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Page ruler plus</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>26619</td>
			<td>Protein ladder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RotiBlock</td>
			<td>Roth</td>
			<td>A151.1</td>
			<td>Blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS (20%)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>1057.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S1000 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1852196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-Blot Turbo</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1704150EDU</td>
			<td>Transfer system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Roth</td>
			<td>4855.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Roth</td>
			<td>9127.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UbcH Enzyme Set</td>
			<td>BostonBiochem</td>
			<td>K-980B</td>
			<td>E2 enzymes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubiquitin</td>
			<td>BostonBiochem</td>
			<td>U-100H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubiquitin-activating enzyme E1</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>BML-UW941U-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ubiquitylation buffer (10x)</td>
			<td>Enzo</td>
			<td>BML-KW9885-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman blotting paper</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>1703969</td>
			<td>Extra thick filter paper</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro analysis of e3 ubiquitin ligase function

Den kovalenta fastsättningen av ubiquitin (Ub) till inre lysinrester av ett substratprotein, en process som kallas allestädes närvarande, representerar en av de viktigaste post-translationella modifieringarna i eukaryota organismer. Ubiquitylation medieras av en sekventiell kaskad av tre enzymklasser inklusive ubiquitinaktiverande enzymer (E1 enzymer), ubiquitinkonjugerande enzymer (E2-enzymer) och ubiquitinligaser (E3-enzymer), och ibland ubiquitin-kedjan långsträckningsfaktorer (E4 enzymer). Här tillhandahålls in vitro-protokoll för allestädes närvarande analyser, som möjliggör bedömning av E3 ubiquitin ligase verksamhet, samarbetet mellan E2-E3-par och substratval. Samarbetande E2-E3-par kan screenas genom övervakning av generering av fria poly-ubiquitinkedjor och/eller automatisk allestädes närvarande inge av E3-ligasen. Substrat ubiquitylation definieras genom selektiv bindning av E3 ligase och kan detekteras genom western blotting av in vitro reaktionen. Dessutom beskrivs en E2~Ub-avslutningsanalys, vilket är ett användbart verktyg för direkt bedömning av funktionellt E2-E3-samarbete. Här följs den E3-beroende överföringen av ubiquitin från motsvarande E2-enzym till fria lysin aminosyror (härma substrat ubiquitylation) eller inre lysin i själva E3-ligasen (auto-ubiquitylation). Sammanfattningsvis tillhandahålls tre olika in vitro-protokoll som är snabba och enkla att utföra för att hantera E3 ligase katalytisk funktionalitet.

För att identifiera E2-enzymer som samarbetar med ubiquitin ligase CHIP testades en uppsättning E2-kandidater i individuella in vitro-ubiquitylationsreaktioner. Samarbetande E2-E3-par övervakades genom bildandet av E3-beroende allestädes närvarande produkter, dvs.automatisk allestädes närvarande 1999 av E3-ligasen och bildandet av fria Ub-polymerer. Ubiquitylation produkter analyserades av västra blotting. Datatolkningen baseras på storleksjämförelsen av de resulterande proteinbanden med mol...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function at JoVE.com

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

Denna studie ger detaljerade in vitro ubiquitylation analys protokoll för analys av E3 ubiquitin ligase katalytisk aktivitet. Rekombinanta proteiner uttrycktes med hjälp av prokaryota system såsom Escherichia coli kultur.

In vitro Analys av E3 Ubiquitin Ligase Funktion

The covalent attachment of ubiquitin (Ub) to internal lysine residue(s) of a substrate protein, a process termed ubiquitylation, represents one of the ...

Det övergripande målet med detta protokoll är att analysera viktiga viktiga aspekter av E3 ligase funktion, inklusive E2 enzym specificitet, substrat val och ubiquitin överföring. Den största fördelen med denna teknik är dess breda tillämplighet, eftersom proteiner från alla eukaryota källor kan rekombinant uttryckas och studeras in vitro utan behov av speciell utrustning. Vid användning av lysinurladdningstekniken för första gången är det viktigt att optimera analysparametrar, såsom enzymkoncentrationer, för att identifiera de idealiska urladdningsförhållandena för den E3-ligase som valts.För att utföra en in vitro auto-ubiquitylation analys, inrätta ett pipettering schema för att testa den funktionella förmågan hos olika E2 enzymer och förbereda en master mix på is för alla allestädes närvarande reaktioner plus en ytterligare reaktion. Tillsätt sedan en mikromolar av E2-enzymer till lämpliga rör och inkubera proverna i en PCR termisk cyklist i två timmar under de angivna förhållandena. Efter inkubationen lägger du till SDS-provbufferten till varje reaktion och blandar genom pipettering flera gånger.Koka sedan omedelbart proverna vid 95 grader Celsius i fem minuter och lagra de denaturerade proteinerna vid 20 grader Celsius. För att utföra en in vitro substrat ubiquitylationsanalys, förbered pipetteringsschemat för alla reaktioner. Efter beräkning av mängden masterblandning som krävs för en reaktion, förbered huvudblandningen för alla reaktioner på is och tillsätt huvudblandningen till varje rör.Lägg till respektive E3-ligases individuellt. Inkubera sedan proverna i PCR-termiska cyklisten i två timmar enligt vad som visats. I slutet av inkubationen tillsätt två gånger SDS-provbuffert till varje reaktion, blanda flera gånger genom pipettering och koka proverna i fem minuter vid 95 grader Celsius.För att utföra en lysinutsläppsanalys, ställ in pipetteringsschemat för laddningsreaktionen och inkubera laddningsreaktionerna i 15 minuter vid 37 grader Celsius. För att stoppa laddningsreaktionen, tillsätt apyras till en slutlig koncentration på 1,8 enheter per milliliter och inkubera reaktionen i fem minuter vid rumstemperatur. I slutet av inkubationen tillsätt EDTA till en slutlig koncentration på 30 millimolar och använd dubbeldestillerat vatten för att justera reaktionsvolymen till 30 mikroliter.För att släppa ut E2-allestädes närvarande med E3 sätter du upp fem rör som motsvarar tidspunkterna för experimentet, lägger till 6,7 mikroliter icke-reducerande provbuffert till varje rör, tar bort sex mikroliter av den stoppade laddningsreaktionen från tidspunkten nollröret och justerar den totala volymen till 26,7 mikroliter. För att ställa in utsläppsreaktionerna, tillsätt dubbeldestillerat vatten, allestädes närvarande buffert, BSA, lysin, E3 ligase och den laddade E2 till varje reaktion. Överför 20 mikroliterprover från varje utloppsreaktion till motsvarande provrör efter de valda tidsperioderna.Virvla sedan omedelbart proverna och placera dem vid 70 grader Celsius i 10 minuter. I denna representativa western blot analys var inaktiva CHIP inte automatiskt-allestädes närvarande. De E3-oberoende ubiquitinprodukterna bildades dock i närvaro av inaktiv CHIP och i avsaknad av CHIP.Den vilda typen CHIP var auto-ubiquitylated i kombination med proteinerna i UBE2D och UBE2E familjer, medan de fria polyubiquitin kedjorna producerades i samarbete med proteinerna i UBE2D familjen men inte med proteinerna i UBE2E familjen. Bindningen av ubiquitin av UBE2N/V1 riktade bildandet av fria ubiquitinkedjor. Auto-ubiquitylation och allestädes närvarande unc-45B observerades med vilda chip men inte med den inaktiva mutanten av CHIP, vilket indikerar att UNC-45B fungerar som ett bevarat substrat för CHIP.När den katalytiska aktiviteten av CHIP analyserades med hjälp av en lysin ansvarsfrihet analys, hade det oladdade UBE2D2 enzymet en molekylvikt på 17 kilodalton och den laddade UBE2D2 med en enda ubiquitin molekyl hade en molekylvikt på cirka 26 kilodalton. Vid tid 0 observerades hela den laddade E2-avkastningen. I närvaro av inaktiv CHIP upptäcktes en svag E3 ligase-oberoende urladdning av UBE2D2 men inte automatisk-allestädes närvarande CHIP.I närvaro av vilda chip, utsläpp av UBE2D2 var snabb och slutföras inom 60 minuter, och auto-ubiquitylation av CHIP anges en överföring av ubiquitin på sina egna lysin rester. På grund av den begränsade E2-förmågan, arbeta så snabbt som möjligt och omedelbart fortsätta med urladdningsreaktionen följt av SDS-PAGE och Western blotting. Efter dessa in vitro allestädes närvarande protokoll, de specifika ubiquitylation länkning typer kan identifieras genom att undersöka de västra fläckar med länkning-specifika antikroppar.

Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro Analysis of E3 Ubiquitin Ligase Function

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

Betydelsen av korrekt proteinkoncentration för kinetik och affinitet Bestämning i struktur och funktion Analys

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Analys av utveckling av en morfologisk Fenotyp som en funktion av proteinkoncentration i Budding Jäst

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Analys av Schwann-astrocyternas interaktioner Använda In Vitro Analyser

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

In vitro analys av PDZ-beroende Signaling CFTR makromolekylära komplex

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Snabb genetisk analys av Epithelial-mesenkymala Signaling Under Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer's Vesicle

Analys av geners funktion och Visualisering av Cilia-genererade vätskeflöde i Kupffer s vesikel

Internal organs such as the  heart, brain, and gut develop left-right (LR) asymmetries that are critical for  their normal functions1. Motile cilia are ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

siRNA Screening för att identifiera Ubiquitin och Ubiquitin-liknande system Regulatorer av biologiska banor i odlade däggdjursceller

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

Analys av Nephron sammansättning och funktion i vuxen Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

Funktionell beredning och Kanalaktivitets Mätningar av renat Vildtyps och Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

A Rapid Automated Protocol for Muscle Fiber Population Analysis in Rat Muscle Cross Sections Using Myosin Heavy Chain Immunohistochemistry

En Rapid Automatiserad Protokoll för Muscle Fiber Population Analysis i råttmuskel Cross sektioner med hjälp tunga kedjan från myosin Immunohistokemi

Quantification of muscle fiber populations provides a deeper insight into the effects of disease, trauma, and various other influences on skeletal muscle ...