Name: automated dissection protocol for tumor enrichment in low tumor content tissues
Uploaded: 2021-03-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Dissection Protocol for Tumor Enrichment in Low Tumor Content Tissues at JoVE.com

يود المؤلفون أن يشكروا كارمينا إسبيريتو وروبن تايلور على دعمهم في تطوير التشريح الآلي وكذلك موظفي مختبر Genentech Pathology Core Laboratory الذين دعموا هذا العمل.

قبل البدء ، احصل على عينات الأنسجة المناسبة وفقا لبروتوكولات مجلس المراجعة المؤسسية (IRB). تمت الموافقة على جميع الطرق الموضحة هنا من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) التابعة لشركة Genentech، Inc.
1. إعداد الأنسجة والشرائح
<ol><li>حدد FFPE أو كتل الأنسجة المجمدة الطاز?...

<ol>
	<li>Cho, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+recommendations+for+precision+cancer+therapy+using+next+generation+sequencing:+a+comprehensive+single+cancer+center's+experiences.">Tissue recommendations for precision cancer therapy using next generation sequencing: a comprehensive single cancer center's experiences.</a> Oncotarget. 8 (26), 42478-42486 (2017).</li><li>Smits, A. J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+estimation+of+tumor+cell+percentage+for+molecular+testing+by+pathologists+is+not+accurate.">The estimation of tumor cell percentage for molecular testing by pathologists is not accurate.</a> Modern Pathology: An Official Journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 27 (2), 168-174 (2014).</li><li>Poole-Wilson, P. A., Langer, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+on+ionic+exchange+and+function+in+rat+and+rabbit+myocardium.">Effect of pH on ionic exchange and function in rat and rabbit myocardium.</a> The American Journal of Physiology. 229 (3), 570-581 (1975).</li><li>Viray, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+prospective,+multi-institutional+diagnostic+trial+to+determine+pathologist+accuracy+in+estimation+of+percentage+of+malignant+cells.">A prospective, multi-institutional diagnostic trial to determine pathologist accuracy in estimation of percentage of malignant cells.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 137 (11), 1545-1549 (2013).</li><li>El-Serag, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+in+Barrett's+Esophagus:+Laser+capture+versus+whole+tissue.">Gene Expression in Barrett's Esophagus: Laser capture versus whole tissue.</a> Scandinavian Journal of Gastroenterology. 44 (7), 787-795 (2009).</li><li>Harrell, J. C., Dye, W. W., Harvell, D. M. E., Sartorius, C. A., Horwitz, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contaminating+cells+alter+gene+signatures+in+whole+organ+versus+laser+capture+microdissected+tumors:+a+comparison+of+experimental+breast+cancers+and+their+lymph+node+metastases.">Contaminating cells alter gene signatures in whole organ versus laser capture microdissected tumors: a comparison of experimental breast cancers and their lymph node metastases.</a> Clinical &amp; Experimental Metastasis. 25 (1), 81-88 (2008).</li><li>Kim, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinctions+in+gastric+cancer+gene+expression+signatures+derived+from+laser+capture+microdissection+versus+histologic+macrodissection.">Distinctions in gastric cancer gene expression signatures derived from laser capture microdissection versus histologic macrodissection.</a> BMC Medical Genomics. 4, 48 (2011).</li><li>Klee, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+sample+acquisition+and+linear+amplification+on+gene+expression+profiling+of+lung+adenocarcinoma:+laser+capture+micro-dissection+cell-sampling+versus+bulk+tissue-sampling.">Impact of sample acquisition and linear amplification on gene expression profiling of lung adenocarcinoma: laser capture micro-dissection cell-sampling versus bulk tissue-sampling.</a> BMC Medical Genomics. 2, 13 (2009).</li><li>Civita, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+and+RNA-seq+analysis:+High+sensitivity+approaches+to+explain+histopathological+heterogeneity+in+human+glioblastoma+FFPE+archived+tissues.">Laser capture microdissection and RNA-seq analysis: High sensitivity approaches to explain histopathological heterogeneity in human glioblastoma FFPE archived tissues.</a> Frontiers in Oncology. 9, 482 (2019).</li><li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection.">Laser capture microdissection.</a> Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).</li><li>Bonner, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection:+molecular+analysis+of+tissue.">Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue.</a> Science. 278 (5342), 1481-1483 (1997).</li><li>Hunt, J. L., Finkelstein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdissection+techniques+for+molecular+testing+in+surgical+pathology.">Microdissection techniques for molecular testing in surgical pathology.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 128 (12), 1372-1378 (2004).</li><li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection.">Laser-capture microdissection.</a> Nature Protocols. 1, 586-603 (2006).</li><li>Grafen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+expression-based+microdissection+of+formalin-fixed+lung+cancer+tissue.">Optimized expression-based microdissection of formalin-fixed lung cancer tissue.</a> Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 97 (7), 863-872 (2017).</li><li>Javey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=innovative+tumor+tissue+dissection+tool+for+molecular+oncology+diagnostics.">innovative tumor tissue dissection tool for molecular oncology diagnostics.</a> The Journal of Molecular Diagnnostics: JMD. (21), 1525-1578 (2021).</li><li>Adey, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mill+based+instrument+and+software+system+for+dissecting+slide-mounted+tissue+that+provides+digital+guidance+and+documentation.">A mill based instrument and software system for dissecting slide-mounted tissue that provides digital guidance and documentation.</a> BMC Clinical Pathology. 13 (1), 29 (2013).</li></ol>

يظهر هنا بروتوكول لتطبيق التعليق التوضيحي الرقمي والتشريح الآلي لتشريح مناطق الورم من FFPE منخفض محتوى الورم أو الأنسجة المجمدة الطازجة لإثراء الورم واستخدامه في WES. إن الجمع بين التعليق التوضيحي الرقمي وإنشاء القناع مع التشريح الآلي يقلل بشكل كبير من الوقت العملي المطلوب والخبرة الشائعة ...

يتم استخدام تسلسل الجيل التالي (NGS) بشكل متزايد لكل من رعاية المرضى وفي أبحاث السرطان للمساعدة في توجيه العلاجات وتسهيل الاكتشاف العلمي. غالبا ما تكون الأنسجة محدودة ويتم استخدام عينات صغيرة ذات محتوى ورم متغير بشكل روتيني. وبالتالي، تظل كفاية الورم وسلامته عائقا أمام الحصول على بيانات ذات مغزى. قد تسبب العينات ذات النسب المئوية المنخفضة للورم صعوبة في التمييز بين المتغيرات الحقيقية والقطع الأثرية المتسلسلة وغالبا ما تكون غير مؤهلة للحصول على NGS1. وقد ثبت أن إثراء الورم لحالات محتوى الورم المنخفض ، تلك التي تقل عن 20٪ ، يساعد في إنتاج مواد كافية من أجل توليد بيانات تسلسل قابلة للتكرار وضمان عدم تفويت المتغيرات منخفضة التردد 2,3. ومع ذلك ، ستختلف الحدود اعتمادا على المنصات المستخدمة والاستخدام المخطط للبيانات التي تم إنشاؤها.
تقليديا ، يتم إجراء إثراء مناطق الورم لاستخراجها عن طريق التشريح الكلي اليدوي أو التشريح المجهري لالتقاط الليزر (LCM) لشرائح الفورمالين الثابتة البارافين المدمجة (FFPE). يسمح التشريح الكلي اليدوي ، أو كشط مناطق الأنسجة المحددة من الشرائح ، بإزالة مناطق الورم لاستخدامها في الفحوصات النهائية بتكلفة منخفضة نسبيا ، ولكن بدقة منخفضة ودقة منخفضة 2,4. يمكن أن يكون الحد الأدنى من الدقة التقنية فعالا جدا مع حالات محتوى الورم الأعلى حيث توجد مساحات كبيرة من الورم و / أو الحد الأدنى من فقدان الأنسجة لا يؤثر بشكل كبير على النتائج ، ولكن الحالات ذات المحتوى المنخفض للورم أو الحالات ذات الورم الأكثر تشتتا تتطلب دقة أكبر. لذلك تم اختراع LCM في 1990s وأصبح وسيلة قيمة لإزالة المناطق الصغيرة والمحددة والمجهرية بدقة من الأنسجة من شرائح الفورمالين الثابتة البارافين المدمجة (FFPE)5،6،7،8. يمكن استخدام LCM لجمع مجموعات الخلايا الواحدة عند وجود عدم تجانس معقد للعينة9 مما يسمح بجمع مجموعات الخلايا التي كان من الصعب فصلها سابقا. ومع ذلك ، تتطلب LCM آلات مكلفة تتطلب خبرة تقنية واسعة ووقتا عمليا10،11،12،13،14.
تتميز الأداة المستخدمة في تشريح الأنسجة الآلي بدقة بين دقة LCM (~ 10 ميكرومتر) والتشريح الكلي (~ 1 مم)15. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يعرض متطلبات التكلفة والخبرة التقنية بين متطلبات التشريح الكلي و LCM وهو مصمم لإجراء إثراء سريع للأنسجة من شرائح FFPE المتسلسلة للتخفيف من عيوب الطرق السابقة15. يستخدم التشريح الآلي بهذه الطريقة التعليقات التوضيحية الرقمية أو تراكبات الصور المرجعية للشرائح على المسرح على شرائح الأنسجة غير الملطخة المجزأة بشكل متسلسل لتشريح وإثراء المناطق ذات الاهتمام. تستخدم الأداة أطراف طحن شفرة الغزل البلاستيكية ، وأنابيب جمع 1.5 مل ويمكن استخدامها مع عدد من السوائل المختلفة للتشريح لجمع المناطق ذات الأهمية للمقايسات النهائية بما في ذلك استخراج النواة وتسلسلها. يستخدم طرف الطحن البلاستيكي الغزل خزانات برميل المحاقن الداخلية والخارجية ومكبس لجمع المخزن المؤقت ، ثم يطحن ويجمع الأنسجة16. يمكن أن يسمح قطر حجم طرف الطحن المتغير (250 ميكرومتر ، 525 ميكرومتر ، 725 ميكرومتر) بتشريح مناطق الأنسجة المنفصلة للمقارنة ، أو المناطق متعددة البؤر التي يمكن تجميعها أو المناطق الصغيرة الفردية من شرائح FFPE مفردة أو متعددة. يمكن تعديل سمك القسم المستخدم للحصاد بناء على احتياجات التجربة الفردية ويمكن للمستخدمين ضمان عدم استنفاد المناطق ذات الأهمية من خلال إجراء H & E إضافي على قسم تسلسلي واحد مباشرة بعد القسم الأخير المستخدم للحصاد.
تم تحديد التشريح الآلي كوسيلة لإثراء محتوى الورم في حالات محتوى الورم المنخفض وقمنا باختبار وتوسيع الوظيفة المقصودة لأداة تشريح الأنسجة الآلية ، والتي يتم تسويقها حاليا للاستخدام على عينات FFPE السريرية التي يصل سمكها إلى 10 ميكرومتر. يظهر العمل أنه يمكن تطبيق التشريح الآلي على كل من FFPE وأقسام الأنسجة البشرية أو الحيوانية المجمدة الطازجة التي يصل سمكها إلى 20 ميكرومتر لأغراض البحث. يوضح البروتوكول أيضا نهجا لشرح وأتمتة تشريح الورم رقميا لإثراء الورم في الأنسجة ذات المحتوى المنخفض من الورم و / أو الحالات ذات الورم المتداخل والمشتت حيث يكون التشريح الكلي ذي المغزى صعبا أو غير ممكن وإظهار كل من جودة وإنتاجية الحمض النووي الكافي ل NGS. وبالتالي ، يمكن أن يوفر التشريح الآلي دقة متوسطة المستوى وزيادة الإنتاجية لإثراء الورم ويمكن تطبيقه أيضا لإثراء المناطق الأخرى ذات الاهتمام أو دمجه مع منصات أخرى للإجابة على الأسئلة البحثية أو السريرية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agilent SureSelectXT</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G9611A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AVENIO Millisect Fill Station</td>
			<td>Roche</td>
			<td>8106533001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AVENIO Millisect Instrument, Base</td>
			<td>Roche</td>
			<td>8106568001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AVENIO Millisect Instrument, Head</td>
			<td>Roche</td>
			<td>8106550001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AVENIO Millisect Milling Tips Small</td>
			<td>Roche</td>
			<td>8106509001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AVENIO Millisect PC</td>
			<td>Roche</td>
			<td>8106495001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioAnalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5427R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620700</td>
			<td>Micro-centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubation Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>D920D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Autostainer XL</td>
			<td>Leica</td>
			<td>ST5010</td>
			<td>Automated stainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Grade Mineral Oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5904-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V302B</td>
			<td>Digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen AllPrep DNA/RNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RLT Plus buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus positively charged microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>6776214</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated dissection protocol for tumor enrichment in low tumor content tissues

مطلوب إثراء الورم في الأنسجة منخفضة محتوى الورم ، تلك التي تقل عن 20 ٪ من محتوى الورم اعتمادا على الطريقة ، لتوليد بيانات عالية الجودة بشكل متكرر مع العديد من الفحوصات النهائية مثل تسلسل الجيل التالي. تشريح الأنسجة الآلي هو منهجية جديدة تعمل على أتمتة وتحسين إثراء الورم في هذه الأنسجة الشائعة منخفضة محتوى الورم عن طريق تقليل عدم الدقة المعتمدة على المستخدم للتشريح الكلي التقليدي وقيود الوقت والتكلفة والخبرة للتشريح المجهري لالتقاط الليزر باستخدام تراكب التعليق التوضيحي للصور الرقمية على شرائح غير ملطخة. هنا ، يتم استخدام التعليقات التوضيحية الرقمية للهيماتوكسيلين والإيوسين (H & E) لاستهداف مناطق الورم الصغيرة باستخدام شفرة يبلغ قطرها 250 ميكرومتر2 في الفورمالين غير الملون البارافين الثابت المضمن (FFPE) أو الأقسام المجمدة الطازجة التي يصل سمكها إلى 20 ميكرومتر لإثراء الورم الآلي قبل استخراج الحمض النووي وتسلسل الإكسوم الكامل (WES). يمكن للتشريح الآلي حصاد المناطق المشروحة في أنسجة منخفضة محتوى الورم من أقسام واحدة أو متعددة لاستخراج الحمض النووي. كما يسمح بالتقاط مقاييس جمع واسعة النطاق قبل وبعد الحصاد مع تحسين الدقة وقابلية التكرار وزيادة الإنتاجية باستخدام عدد أقل من الشرائح. يتيح البروتوكول الموصوف التعليق التوضيحي الرقمي مع التشريح الآلي على FFPE الحيواني و / أو البشري أو الأنسجة المجمدة الطازجة ذات المحتوى المنخفض من الورم ويمكن استخدامه أيضا لأي منطقة ذات إثراء ذي أهمية لتعزيز كفاية تطبيقات التسلسل النهائي في سير العمل السريري أو البحثي.

تم اختيار أقسام كبد الماوس FFPE و FF التي تحتوي على سرطان القولون والمستقيم النقيلي في xenografts. كانت الأقسام ملطخة H & E (الشكل 1A و E و I) وتم مسحها ضوئيا على جهاز تصوير شريحة كامل عند تكبير 20x. قام أخصائي علم الأمراض بشرح مناطق الأورام ذات الأهمية رقميا وتم إنشاء قناع باستخد...

Watch this Scientific Journal Video about Automated Dissection Protocol for Tumor Enrichment in Low Tumor Content Tissues at JoVE.com

Automated Dissection Protocol for Tumor Enrichment in Low Tumor Content Tissues

يوفر التعليق التوضيحي الرقمي مع تشريح الأنسجة الآلي نهجا مبتكرا لإثراء الورم في الحالات ذات المحتوى المنخفض من الورم وهو قابل للتكيف مع كل من أنواع البارافين والأنسجة المجمدة. يعمل سير العمل الموصوف على تحسين الدقة والتكرار والإنتاجية ويمكن تطبيقه على كل من الإعدادات البحثية والسريرية.

بروتوكول التشريح الآلي لإثراء الورم في الأنسجة منخفضة محتوى الورم

Tumor enrichment in low tumor content tissues, those below 20% tumor content depending on the method, is required to generate quality data reproducibly ...

يمكن عزل أو إثراء المناطق الصغيرة المتناثرة ذات الأهمية من FFPE ، أو المواد المجمدة الطازجة ، عن طريق التشريح الآلي بسرعة وكفاءة أكبر من الطرق التقليدية. استخراج المواد الجينومية من FFPE ، أو الأنسجة المجمدة الطازجة ، هو شرط للعديد من مختبرات البحوث السريرية والانتقالية. يملأ التشريح الآلي فجوة كبيرة بين التشريح الكلي والتشريح الجزئي لالتقاط الليزر.للبدء، أضف تعليقات توضيحية على صور الشرائح الممسوحة ضوئيا لمناطق الورم ذات الاهتمام، باستخدام منصة عرض يوفرها المورد، أو عارض مفتوح المصدر. ضع شريحة أنسجة العينة غير الملطخة على المسرح في موضع الشريحة من الأول إلى الرابع عند استخدام مرجع شريحة رقمي. قم بإنشاء مهمة طحن باستخدام برنامج تشريح الأنسجة التلقائي عن طريق فتح قائمة الوظائف، ثم حدد إنشاء وظيفة جديدة، وأدخل معرف الحالة والاسم لإدخال اسم الوظيفة.انتقل إلى السماكة، وحدد سمك القسم باستخدام علامة التبويب السهم لأعلى أو لأسفل. ثم انتقل إلى إعداد الأنسجة، وحدد البارافينيز، أو المنزوع البارافين. حدد صورة مرجعية"من ملف، واستيراد صورة.ثم حدد الملف المراد استيراده من القائمة المنسدلة كمرجع رقمي. امسح المرحلة ضوئيا عن طريق تحديد الزر "مرحلة المسح الضوئي" في الزاوية السفلية اليمنى لالتقاط كل شريحة من أنسجة العينة في الموضع الأول إلى الرابع. بالنسبة للمرجع على المسرح، اسحب المربع لإنشاء مساحة مستطيلة فوق الأنسجة، وحدد الفقاعة الدائرية أسفل المساحة المستطيلة لالتقاط صورة مرجع المرحلة.انسخ حقل المستطيل هذا إلى شرائح أنسجة العينة المتبقية في مواضع الشرائح من الثانية إلى الرابعة عن طريق تحديد خيار النسخ في الزاوية العلوية اليسرى من الصورة المرجعية. ثم قم بالمحاذاة وتغيير الحجم حسب الضرورة. بالنسبة للصورة المرجعية الرقمية، قم بتراكب الصورة على المساحة المستطيلة المحددة.بعد ذلك ، قم بتغيير حجم المرجع الرقمي ومحاذاته بشكل كبير ، بالطبع ، التكبير / التصغير ، لمطابقة الحجم والموضع على أفضل وجه فوق أنسجة العينة. انسخ حقل المستطيل هذا إلى شرائح أنسجة العينة المتبقية في مواضع الشرائح من الثانية إلى الرابعة عن طريق تحديد خيار النسخ في الزاوية العلوية اليسرى من الصورة المرجعية. ثم قم بالمحاذاة وتغيير الحجم حسب الضرورة.حدد الزر "مرحلة المسح الضوئي" في الزاوية السفلية اليمنى للانتقال إلى خطوة الضبط الدقيق. حدد موضع المرحلة الأولى، وأيقونة أداة التحويل في شريط الأدوات الأيمن، لإجراء محاذاة دقيقة ومعايرات تكبير/تصغير للمرجع لمطابقة تراكب شريحة العينة على أفضل وجه. استخدم المرجع لعينة من الشريط المنزلق في أسفل الشاشة، مع التبديل بين المرجع وعينة الصور.وميزة التكبير والتصغير لضبط وتحقيق محاذاة كل موضع شريحة. بمجرد تحقيق تراكب العينة الأمثل، ارسم تسميات مسار الطحن على الجزء الملون من الصورة المرجعية المقنعة عن طريق تحديد أيقونة أداة انتقاء الألوان في شريط الأدوات الأيمن. ارسم مسارات الطحن على شرائح العينة عن طريق تحديد الزر "الحصول على التعليقات التوضيحية" في الزاوية السفلية اليسرى من الشاشة.التقط المنطقة المشروحة ذات الأهمية واجمعها باستخدام أربع نصائح طحن أو أقل عند حساب مسار الطحن. يتم حساب استخدام طرف الطحن في الزاوية العلوية اليسرى بناء على المساحة المغطاة وحجم الطرف المحدد. يمكن تغيير حجم الطرف تحت سهم طرف الطحن ، وسيتم إعادة حساب استخدام الطرف.عند تحديد مسار الطحن في موضع الشريحة الأول، سيتم نسخه إلى مواضع الشريحة المتبقية. حدد زر مرحلة الإعداد "في الزاوية السفلية اليمنى من الشاشة للتحميل الفوري لنصائح الطحن من أنابيب التجميع في تعيينها الصحيح على المسرح. املأ الخزان بثلاثة ملليلترات من مخزن التشريح المناسب لنوع الأنسجة ، ولاستخراج الحمض النووي في المصب.ثم حدد الزر تشريح "في الزاوية اليمنى السفلى من الشاشة. بعد التشريح الآلي ، قم بإزالة أنابيب التجميع وشرائح العينة التشريحية من المرحلة. ضع أنابيب التجميع في رف الأنبوب، والشرائح في رف الشرائح.تم مسح الفورمالين الملطخ H&E ، والبارافين الثابت المضمن ، وأقسام كبد الفئران المجمدة الطازجة التي تحتوي على سرطان القولون والمستقيم النقيلي في xenografts على جهاز تصوير شريحة كامل عند تكبير 20x ، واستخدامها كشرائح مرجعية. تم شرح الشرائح المرجعية الملطخة H & E وملثمة رقميا لمناطق الورم للتشريح واستخراج الحمض النووي. تم تلطيخ شرائح العينة بعد تشريحها H & E لتأكيد مناطق التشريح في شرائح 10 ميكرومتر و 20 ميكرومتر.أظهرت المقاييس التي تم التقاطها نجاح التشريح الآلي واستخراج الحمض النووي. عند محاولة استخدام هذا البروتوكول، ضع في اعتبارك أن تحقيق تراكب دقيق نسبيا للتعليق التوضيحي على الشرائح غير الملطخة أمر مهم لعزل مجالات الاهتمام.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

ال<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; تخيلي ورم القرص نموذج: التصور والكمي للالتعبير الجيني وغزو الورم عن طريق الفسيفساء الوراثية

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System

والفئران مثلي المثانة نموذج ورم والورم نظام لكشف

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified ...

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

الخلية الهدف الجينوم قبل التخصيب وكله التضخيم لتوصيف المصب خلية مفردة

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

إنشاء مقايسة الاستعمار الرئة لتعميم التصور خلية الورم في أنسجة الرئة

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues

برنامج متكامل لرسم خرائط الجينوم على نطاق الدول الكروماتين استخدام رقاقة الفائق-التسلسل في أنسجة الورم

Histone modifications constitute a major component of the epigenome and play important regulatory roles in determining the transcriptional status of ...

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

الجينات مراسل fluorescence النويدات المشعة التصوير لتتبع تطور الورم في نماذج القوارض الورم

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

A Method to Define the Effects of Environmental Enrichment on Colon Microbiome Biodiversity in a Mouse Colon Tumor Model

أسلوب لتحديد آثار الإثراء البيئي في القولون ميكروبيومي التنوع البيولوجي في نموذج ورم القولون الماوس

Several recent studies have illustrated the beneficial effects of living in an enriched environment on improving human disease. In mice, environmental ...

Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors

تخصيب اليورانيوم وتوصيف ميكرونفيرونمينتس المناعي والمناعة غير ورم في المنشأة الأورام مورين تحت الجلد

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

بوليميريز الرقمية سلسلة من ردود الفعل المقايسة للتنوع الوراثي في مريض متفرقة مرجلات غدومي استخدام تنسيق رقاقة في أنبوب

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

باراميكسوفيروسيس لاستهداف الورم المرباة: التصميم والتقييم السابقين فيفو

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...