Name: automated dissection protocol for tumor enrichment in low tumor content tissues
Uploaded: 2021-03-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Dissection Protocol for Tumor Enrichment in Low Tumor Content Tissues at JoVE.com

De auteurs willen Carmina Espiritu en Robin E. Taylor bedanken voor hun steun bij de ontwikkeling van geautomatiseerde dissecties, evenals het personeel van het Genentech Pathology Core Laboratory dat dit werk heeft ondersteund.

Verkrijg voorafgaand aan de start geschikte weefselmonsters volgens de protocollen van de Institutional Review Board (IRB). Alle hier beschreven methoden zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van Genentech, Inc.
1. Weefsel- en diavoorbereiding
<ol><li>Selecteer FFPE of vers ingevroren weefselblokken en gebruik de bijbehorende verwerkingsmethode hieronder.</li>
	<li>Snijd weefselbloksecties op positief geladen glasglaasjes met de gewenste dikte. Sectie h...

<ol>
	<li>Cho, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+recommendations+for+precision+cancer+therapy+using+next+generation+sequencing:+a+comprehensive+single+cancer+center's+experiences.">Tissue recommendations for precision cancer therapy using next generation sequencing: a comprehensive single cancer center's experiences.</a> Oncotarget. 8 (26), 42478-42486 (2017).</li><li>Smits, A. J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+estimation+of+tumor+cell+percentage+for+molecular+testing+by+pathologists+is+not+accurate.">The estimation of tumor cell percentage for molecular testing by pathologists is not accurate.</a> Modern Pathology: An Official Journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 27 (2), 168-174 (2014).</li><li>Poole-Wilson, P. A., Langer, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+on+ionic+exchange+and+function+in+rat+and+rabbit+myocardium.">Effect of pH on ionic exchange and function in rat and rabbit myocardium.</a> The American Journal of Physiology. 229 (3), 570-581 (1975).</li><li>Viray, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+prospective,+multi-institutional+diagnostic+trial+to+determine+pathologist+accuracy+in+estimation+of+percentage+of+malignant+cells.">A prospective, multi-institutional diagnostic trial to determine pathologist accuracy in estimation of percentage of malignant cells.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 137 (11), 1545-1549 (2013).</li><li>El-Serag, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+in+Barrett's+Esophagus:+Laser+capture+versus+whole+tissue.">Gene Expression in Barrett's Esophagus: Laser capture versus whole tissue.</a> Scandinavian Journal of Gastroenterology. 44 (7), 787-795 (2009).</li><li>Harrell, J. C., Dye, W. W., Harvell, D. M. E., Sartorius, C. A., Horwitz, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contaminating+cells+alter+gene+signatures+in+whole+organ+versus+laser+capture+microdissected+tumors:+a+comparison+of+experimental+breast+cancers+and+their+lymph+node+metastases.">Contaminating cells alter gene signatures in whole organ versus laser capture microdissected tumors: a comparison of experimental breast cancers and their lymph node metastases.</a> Clinical &amp; Experimental Metastasis. 25 (1), 81-88 (2008).</li><li>Kim, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinctions+in+gastric+cancer+gene+expression+signatures+derived+from+laser+capture+microdissection+versus+histologic+macrodissection.">Distinctions in gastric cancer gene expression signatures derived from laser capture microdissection versus histologic macrodissection.</a> BMC Medical Genomics. 4, 48 (2011).</li><li>Klee, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+sample+acquisition+and+linear+amplification+on+gene+expression+profiling+of+lung+adenocarcinoma:+laser+capture+micro-dissection+cell-sampling+versus+bulk+tissue-sampling.">Impact of sample acquisition and linear amplification on gene expression profiling of lung adenocarcinoma: laser capture micro-dissection cell-sampling versus bulk tissue-sampling.</a> BMC Medical Genomics. 2, 13 (2009).</li><li>Civita, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+and+RNA-seq+analysis:+High+sensitivity+approaches+to+explain+histopathological+heterogeneity+in+human+glioblastoma+FFPE+archived+tissues.">Laser capture microdissection and RNA-seq analysis: High sensitivity approaches to explain histopathological heterogeneity in human glioblastoma FFPE archived tissues.</a> Frontiers in Oncology. 9, 482 (2019).</li><li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection.">Laser capture microdissection.</a> Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).</li><li>Bonner, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection:+molecular+analysis+of+tissue.">Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue.</a> Science. 278 (5342), 1481-1483 (1997).</li><li>Hunt, J. L., Finkelstein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdissection+techniques+for+molecular+testing+in+surgical+pathology.">Microdissection techniques for molecular testing in surgical pathology.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 128 (12), 1372-1378 (2004).</li><li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection.">Laser-capture microdissection.</a> Nature Protocols. 1, 586-603 (2006).</li><li>Grafen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+expression-based+microdissection+of+formalin-fixed+lung+cancer+tissue.">Optimized expression-based microdissection of formalin-fixed lung cancer tissue.</a> Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 97 (7), 863-872 (2017).</li><li>Javey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=innovative+tumor+tissue+dissection+tool+for+molecular+oncology+diagnostics.">innovative tumor tissue dissection tool for molecular oncology diagnostics.</a> The Journal of Molecular Diagnnostics: JMD. (21), 1525-1578 (2021).</li><li>Adey, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mill+based+instrument+and+software+system+for+dissecting+slide-mounted+tissue+that+provides+digital+guidance+and+documentation.">A mill based instrument and software system for dissecting slide-mounted tissue that provides digital guidance and documentation.</a> BMC Clinical Pathology. 13 (1), 29 (2013).</li></ol>

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de toepassing van digitale annotatie en geautomatiseerde dissectie om tumorgebieden te ontleden van FFPE met een laag tumorgehalte of vers ingevroren weefsels voor tumorverrijking en gebruik in WES. Het combineren van digitale annotatie en maskercreatie met geautomatiseerde dissectie vermindert aanzienlijk de vereiste hands-on tijd en expertise die gebruikelijk zijn voor klassieke methoden van tumorverrijking, inclusief handmatige macrodissectie en LCM. Het protocol demonstreert...

Next generation sequencing (NGS) wordt steeds vaker gebruikt voor zowel patiëntenzorg als in kankeronderzoek om behandelingen te begeleiden en wetenschappelijke ontdekkingen te vergemakkelijken. Weefsel is vaak beperkt en kleine monsters met een variabel tumorgehalte worden routinematig gebruikt. Tumortoereikendheid en integriteit blijven daarom een barrière voor het verkrijgen van zinvolle gegevens. Monsters met lagere tumorpercentages kunnen problemen veroorzaken bij het onderscheiden van echte varianten van sequencingartefacten en komen vaak niet in aanmerking voor NGS1. Tumorverrijking van gevallen met een laag tumorgehalte, die lager zijn dan 20%, heeft aangetoond dat het helpt voldoende materiaal te produceren om reproduceerbare sequencinggegevens te genereren en ervoor te zorgen dat laagfrequente varianten niet worden gemist 2,3. Limieten variëren echter afhankelijk van de gebruikte platforms en het geplande gebruik van de gegenereerde gegevens.
Traditioneel wordt verrijking van tumorgebieden voor extractie uitgevoerd door handmatige macrodissectie of laser capture microdissection (LCM) van formaline fixed paraffin embedded (FFPE) dia's. Handmatige macrodissectie, of het schrapen van gespecificeerde weefselgebieden van dia's, maakt het mogelijk om tumorgebieden te verwijderen voor gebruik in downstream-testen met relatief lage kosten, maar met lage nauwkeurigheid en lage precisie 2,4. Minimale technische nauwkeurigheid kan zeer effectief zijn bij gevallen met een hoger tumorgehalte waarbij grote tumorstroken aanwezig zijn en / of minimaal weefselverlies geen significante invloed heeft op de resultaten, maar gevallen met een laag tumorgehalte of gevallen met een meer verspreide tumor vereisen een verhoogde precisie. LCM werd daarom uitgevonden in de jaren 1990 en werd een waardevolle manier om kleine, gedefinieerde, microscopische weefselgebieden nauwkeurig te verwijderen uit formaline fixed paraffin embedded (FFPE) dia's 5,6,7,8. LCM kan worden gebruikt om eencellige populaties te verzamelen wanneer er complexe heterogeniteit van de steekproef bestaat9 waardoor voorheen moeilijk te scheiden celpopulaties kunnen worden verzameld. LCM vereist echter dure machines die uitgebreide technische expertise en hands-on tijd 10,11,12,13,14 vereisen.
Het instrument dat wordt gebruikt voor geautomatiseerde weefseldissectie heeft een precisie tussen die van LCM (~ 10 μm) en macrodissecties (~ 1 mm)15. Bovendien vertoont het zowel kosten- als technische expertisevereisten tussen die van macrodissectie en LCM en is het ontworpen om snelle weefselverrijking uit te voeren van sequentiële FFPE-dia's om de nadelen van eerdere methoden te verlichten15. Geautomatiseerde dissectie op deze manier maakt gebruik van digitale annotaties of referentieafbeeldingen op het podium dia-referentieafbeeldingen op serieel gesneden niet-gekleurde weefseldia's voor het ontleden en verrijken van interessante gebieden. Het instrument maakt gebruik van kunststof spinmes freespunten, 1,5 ml verzamelbuizen en kan worden gebruikt met een aantal verschillende vloeistoffen voor dissectie om gebieden te verzamelen die van belang zijn voor downstream-assays, inclusief nucleïsche extractie en sequencing. De draaiende plastic freespunt maakt gebruik van binnen- en buitenspuitvatreservoirs en een zuiger om buffer te verzamelen, vervolgens molens en verzamelt weefsel16. De variabele diameter van de freespunt (250 μm, 525 μm, 725 μm) kan dissectie van afzonderlijke weefselgebieden voor vergelijking mogelijk maken, multifocale gebieden die kunnen worden samengevoegd of individuele kleine gebieden van enkele of meerdere FFPE-dia's. Sectiediktes die voor de oogst worden gebruikt, kunnen worden aangepast op basis van individuele experimentbehoeften en gebruikers kunnen ervoor zorgen dat interessante regio's niet zijn uitgeput door een extra H &E uit te voeren op één seriële sectie onmiddellijk na de laatste sectie die voor de oogst is gebruikt.
Geautomatiseerde dissectie werd geïdentificeerd als een manier om het tumorgehalte te verrijken in gevallen met een laag tumorgehalte en we hebben de beoogde functionaliteit van een geautomatiseerd weefseldissectie-instrument getest en uitgebreid, dat momenteel op de markt wordt gebracht voor gebruik op klinische FFPE-monsters met een dikte tot 10 μm. Het werk toont aan dat geautomatiseerde dissectie kan worden toegepast op zowel FFPE als vers ingevroren menselijke of dierlijke weefselsecties tot 20 μm in dikte voor onderzoeksdoeleinden. Het protocol demonstreert ook een benadering voor het digitaal annoteren en automatiseren van dissectie voor tumorverrijking in weefsels met een laag tumorgehalte en / of gevallen met geneste, gedispergeerde tumor waar zinvolle macrodissectie een uitdaging of niet haalbaar is en toont zowel de kwaliteit als de opbrengst van nucleïnezuur voldoende voor NGS. Geautomatiseerde dissectie kan daarom middelmatige precisie en verhoogde doorvoer voor tumorverrijking bieden en kan ook worden toegepast om andere interessante regio's te verrijken of te combineren met andere platforms om onderzoek of klinische vragen te beantwoorden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agilent SureSelectXT</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G9611A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AVENIO Millisect Fill Station</td>
			<td>Roche</td>
			<td>8106533001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AVENIO Millisect Instrument, Base</td>
			<td>Roche</td>
			<td>8106568001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AVENIO Millisect Instrument, Head</td>
			<td>Roche</td>
			<td>8106550001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AVENIO Millisect Milling Tips Small</td>
			<td>Roche</td>
			<td>8106509001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AVENIO Millisect PC</td>
			<td>Roche</td>
			<td>8106495001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioAnalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5427R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620700</td>
			<td>Micro-centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubation Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>D920D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Autostainer XL</td>
			<td>Leica</td>
			<td>ST5010</td>
			<td>Automated stainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Grade Mineral Oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5904-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V302B</td>
			<td>Digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen AllPrep DNA/RNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RLT Plus buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus positively charged microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>6776214</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated dissection protocol for tumor enrichment in low tumor content tissues

Tumorverrijking in weefsels met een laag tumorgehalte, die lager zijn dan 20% tumorgehalte, afhankelijk van de methode, is vereist om kwaliteitsgegevens reproduceerbaar te genereren met veel downstream-testen zoals de volgende generatie sequencing. Geautomatiseerde weefseldissectie is een nieuwe methodologie die tumorverrijking in deze gemeenschappelijke weefsels met een laag tumorgehalte automatiseert en verbetert door de gebruikersafhankelijke onnauwkeurigheid van traditionele macrodissectie en tijd-, kosten- en expertisebeperkingen van laser capture microdissectie te verminderen door gebruik te maken van digitale beeldannotatie-overlay op niet-gekleurde dia's. Hier worden digitale hematoxyline- en eosine (H &E) annotaties gebruikt om kleine tumorgebieden te targeten met behulp van een mes met een diameter van 250 μm2 in niet-gekleurd formaline vaste paraffine ingebed (FFPE) of vers bevroren secties tot 20 μm in dikte voor geautomatiseerde tumorverrijking voorafgaand aan nucleïnezuurextractie en whole exome sequencing (WES). Geautomatiseerde dissectie kan geannoteerde regio's in weefsels met een laag tumorgehalte oogsten uit enkele of meerdere secties voor nucleïnezuurextractie. Het maakt het ook mogelijk om uitgebreide verzamelstatistieken voor en na de oogst vast te leggen, terwijl de nauwkeurigheid, reproduceerbaarheid en het verhogen van de doorvoer worden verbeterd met minder dia's. Het beschreven protocol maakt digitale annotatie mogelijk met geautomatiseerde dissectie op dierlijke en/of menselijke FFPE of vers ingevroren weefsels met een laag tumorgehalte en kan ook worden gebruikt voor elke regio van belang verrijking om de geschiktheid voor downstream sequencing-toepassingen in klinische of onderzoeksworkflows te vergroten.

FFPE en FF muis lever secties met gemetastaseerde colorectale kanker in xenografts werden geselecteerd. Secties werden H &E gekleurd (figuur 1A, E, I) en gescand op een hele dia imager met 20x vergroting. Een patholoog heeft tumorgebieden van belang digitaal geannoteerd en een masker werd gegenereerd met behulp van commerciële software en opgemaakt als een digitale png-referentieafbeelding (figuur 1B, F, J). Seriële 10 μm en ...

Watch this Scientific Journal Video about Automated Dissection Protocol for Tumor Enrichment in Low Tumor Content Tissues at JoVE.com

Automated Dissection Protocol for Tumor Enrichment in Low Tumor Content Tissues

Digitale annotatie met geautomatiseerde weefseldissectie biedt een innovatieve benadering voor het verrijken van tumoren in gevallen met een laag tumorgehalte en kan worden aangepast aan zowel paraffine- als bevroren weefseltypen. De beschreven workflow verbetert de nauwkeurigheid, reproduceerbaarheid en doorvoer en kan worden toegepast op zowel onderzoeks- als klinische omgevingen.

Geautomatiseerd dissectieprotocol voor tumorverrijking in weefsels met een laag tumorgehalte

Tumor enrichment in low tumor content tissues, those below 20% tumor content depending on the method, is required to generate quality data reproducibly ...

Isolatie of verrijking van kleine verspreide gebieden van belang van FFPE, of vers bevroren materiaal, kan sneller en efficiënter worden bereikt met geautomatiseerde dissectie dan met traditionele methoden. Extractie van genomisch materiaal uit FFPE, of vers ingevroren weefsel, is een vereiste voor veel klinische en translationele onderzoekslaboratoria. Geautomatiseerde dissectie vult een aanzienlijke kloof tussen macrodissectie en laser capture microdissectie.Annoteer om te beginnen de gescande diaafbeeldingen voor de tumorgebieden van belang, met behulp van een door de leverancier geleverd weergaveplatform of een open source-viewer. Plaats de niet-gekleurde monsterweefselschuif op het werkgebied in de eerste tot en met de vierde diapositie wanneer u een digitale diareferentie gebruikt. Maak een freestaak met behulp van de geautomatiseerde weefseldissectiesoftware door de takenlijst te openen, selecteer vervolgens Nieuwe taak maken en voer de hoofdletter-ID en -naam in om de naam van de taak in te voeren.Ga naar Dikte en selecteer sectiedikte met behulp van het pijltje omhoog of omlaag. Ga vervolgens naar Weefselvoorbereiding en selecteer Geparaffiniseerd of Gedeparaffineerd. Selecteer Referentieafbeelding"Van bestand en Afbeelding importeren.Selecteer vervolgens het bestand dat u wilt importeren in de vervolgkeuzelijst als de digitale referentie. Scan de fase door de knop Scan stage" in de rechterbenedenhoek te selecteren om elke monsterweefseldia in de eerste tot en met de vierde positie vast te leggen. Voor de verwijzing in het werkgebied sleept u het vak om een rechthoekig gebied over het weefsel te maken en selecteert u de cirkelvormige bel onder het rechthoekige gebied om de werkgebiedverwijzingsafbeelding vast te leggen.Kopieer dit rechthoekige veld naar de resterende voorbeeldweefseldia's in de tweede tot en met vierde diapositie door de optie kopiëren in de rechterbovenhoek van de referentieafbeelding te selecteren. Pas vervolgens uit en wijzig het formaat indien nodig. Voor de digitale referentieafbeelding legt u de afbeelding over het geselecteerde rechthoekige gebied.Wijzig vervolgens het formaat en lijn de digitale referentie grof uit, natuurlijk zoomen, om het beste aan te sluiten bij de grootte en de positie over het monsterweefsel. Kopieer dit rechthoekige veld naar de resterende voorbeeldweefseldia's in de tweede tot en met vierde diapositie door de optie kopiëren in de rechterbovenhoek van de referentieafbeelding te selecteren. Pas vervolgens uit en wijzig het formaat indien nodig.Selecteer de knop Fase scannen in de rechterbenedenhoek om naar de stap voor fijnaanpassing te gaan. Selecteer de positie van het eerste werkgebied en het pictogram van het gereedschap Transformeren in de rechterwerkbalk om de verwijzing nauwkeurig uit te lijnen en in te zoomen om het beste overeen te komen met de voorbeelddia-overlay. Gebruik de verwijzing om een voorbeeld van een schuifbalk onder aan het scherm te nemen en schakel tussen de referentie- en voorbeeldafbeeldingen.En de in- en uitzoomfunctie om de uitlijning van elke diapositie aan te passen en te bereiken. Zodra de optimale voorbeeldoverlay is bereikt, tekent u de aanduidingen van het freespad op het gekleurde gedeelte van de gemaskeerde referentieafbeelding door het pictogram van het gereedschap Kleurkiezer in de rechterwerkbalk te selecteren. Teken de freespaden op de voorbeelddia's door de knop Annotaties ophalen in de rechterbenedenhoek van het scherm te selecteren.Leg het geannoteerde interessegebied vast en verzamel het met vier of minder freespunten wanneer het freespad wordt berekend. Het gebruik van de freespunt in de linkerbovenhoek wordt berekend op basis van het bestreken gebied en de geselecteerde tipgrootte. De tipgrootte kan worden gewijzigd onder de freespijl en het tipgebruik wordt opnieuw berekend.Wanneer het freespad in de eerste diapositie is geselecteerd, wordt het gekopieerd naar de resterende diaposities. Selecteer de knop Setup stage" in de rechterbenedenhoek van het scherm voor het snel laden van de freespunten van de verzamelbuizen in hun juiste aanduiding op het podium. Vul het reservoir met drie milliliter geschikte dissectiebuffer voor het weefseltype en voor downstream nucleïnezuurextractie.Selecteer vervolgens de knop Ontleden in de rechterbenedenhoek van het scherm. Verwijder na de geautomatiseerde dissectie de verzamelbuizen en de ontleedde monsterglijders uit het podium. Plaats de opvangbuizen in het buizenrek en de dia's in het schuifrek.De H &E-gekleurde formaline, vaste paraffine ingebed en vers bevroren muizenleversecties met gemetastaseerde colorectale kanker in xenografts werden gescand op een hele diabeeldcamera met 20x vergroting en gebruikt als referentiedia's. De H&E-gekleurde referentiedia's werden geannoteerd en digitaal gemaskeerd voor tumorgebieden voor dissectie en nucleïnezuurextractie. De nagesneden monsterdia's waren H &E-gekleurd om de dissectiegebieden in dia's van 10 micrometer en 20 micrometer te bevestigen.Vastgelegde statistieken toonden het succes aan van de geautomatiseerde dissectie en nucleïnezuurextractie. Houd er bij het proberen van dit protocol rekening mee dat het bereiken van een relatief nauwkeurige overlay van annotatie op de niet-gekleurde dia's belangrijk is voor het isoleren van interessegebieden.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

De<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Disc Tumor Model: visualisatie en kwantificering van genexpressie en Tumor Invasiviteit met behulp van genetische Mozaïeken

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System

Een muizen orthotope Blaas Tumor Model en Tumor Detection System

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified ...

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Target cel pre verrijking en hele genoom versterking voor eencellige Downstream karakterisering

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

De oprichting van een Long kolonisatie Assay voor het circulerende Tumor visualisatie van de cel in de weefsels van de longen

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues

Een geïntegreerd Platform voor het toewijzen van de genoom-brede van chromatine Staten met behulp van High-throughput ChIP-sequencing in Tumor weefsels

Histone modifications constitute a major component of the epigenome and play important regulatory roles in determining the transcriptional status of ...

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

Radionuclide-fluorescentie Reporter Gene Imaging als u wilt bijhouden van de Tumor progressie in knaagdier Tumor modellen

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

A Method to Define the Effects of Environmental Enrichment on Colon Microbiome Biodiversity in a Mouse Colon Tumor Model

Een methode om de effecten van milieu verrijking op de dikke darm Microbiome biodiversiteit in een muismodel van het Colon-Tumor definiëren

Several recent studies have illustrated the beneficial effects of living in an enriched environment on improving human disease. In mice, environmental ...

Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors

Verrijking en karakterisering van de Tumor immuun en niet-immune Microenvironments in gevestigde subcutane lymfkliertest tumoren

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Digitale Polymerase Chain Reaction Assay voor de genetische variatie in een sporadische familiale adenomateuze Polyposis patiënt met behulp van de Chip-in-a-tube-indeling

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Paramyxovirussen voor Tumor-gerichte immunomodulatie: ontwerp en evaluatie Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...