Name: automated dissection protocol for tumor enrichment in low tumor content tissues
Uploaded: 2021-03-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Dissection Protocol for Tumor Enrichment in Low Tumor Content Tissues at JoVE.com

Die Autoren danken Carmina Espiritu und Robin E. Taylor für ihre Unterstützung bei der Entwicklung automatisierter Dissektionen sowie den Mitarbeitern des Genentech Pathology Core Laboratory, die diese Arbeit unterstützt haben.

Besorgen Sie sich vor der Einleitung geeignete Gewebeproben gemäß den Protokollen des Institutional Review Board (IRB). Alle hier beschriebenen Methoden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) von Genentech, Inc. genehmigt.
1. Gewebe- und Objektträgervorbereitung
<ol><li>Wählen Sie FFPE oder frisch gefrorene Gewebeblöcke und verwenden Sie die entsprechende Verarbeitungsmethode unten.</li>
	<li>Schneiden Sie Gewebeblockabschnitte auf positiv geladene Glasobjektträ...

<ol>
	<li>Cho, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+recommendations+for+precision+cancer+therapy+using+next+generation+sequencing:+a+comprehensive+single+cancer+center's+experiences.">Tissue recommendations for precision cancer therapy using next generation sequencing: a comprehensive single cancer center's experiences.</a> Oncotarget. 8 (26), 42478-42486 (2017).</li><li>Smits, A. J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+estimation+of+tumor+cell+percentage+for+molecular+testing+by+pathologists+is+not+accurate.">The estimation of tumor cell percentage for molecular testing by pathologists is not accurate.</a> Modern Pathology: An Official Journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 27 (2), 168-174 (2014).</li><li>Poole-Wilson, P. A., Langer, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+on+ionic+exchange+and+function+in+rat+and+rabbit+myocardium.">Effect of pH on ionic exchange and function in rat and rabbit myocardium.</a> The American Journal of Physiology. 229 (3), 570-581 (1975).</li><li>Viray, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+prospective,+multi-institutional+diagnostic+trial+to+determine+pathologist+accuracy+in+estimation+of+percentage+of+malignant+cells.">A prospective, multi-institutional diagnostic trial to determine pathologist accuracy in estimation of percentage of malignant cells.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 137 (11), 1545-1549 (2013).</li><li>El-Serag, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+in+Barrett's+Esophagus:+Laser+capture+versus+whole+tissue.">Gene Expression in Barrett's Esophagus: Laser capture versus whole tissue.</a> Scandinavian Journal of Gastroenterology. 44 (7), 787-795 (2009).</li><li>Harrell, J. C., Dye, W. W., Harvell, D. M. E., Sartorius, C. A., Horwitz, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contaminating+cells+alter+gene+signatures+in+whole+organ+versus+laser+capture+microdissected+tumors:+a+comparison+of+experimental+breast+cancers+and+their+lymph+node+metastases.">Contaminating cells alter gene signatures in whole organ versus laser capture microdissected tumors: a comparison of experimental breast cancers and their lymph node metastases.</a> Clinical &amp; Experimental Metastasis. 25 (1), 81-88 (2008).</li><li>Kim, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinctions+in+gastric+cancer+gene+expression+signatures+derived+from+laser+capture+microdissection+versus+histologic+macrodissection.">Distinctions in gastric cancer gene expression signatures derived from laser capture microdissection versus histologic macrodissection.</a> BMC Medical Genomics. 4, 48 (2011).</li><li>Klee, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+sample+acquisition+and+linear+amplification+on+gene+expression+profiling+of+lung+adenocarcinoma:+laser+capture+micro-dissection+cell-sampling+versus+bulk+tissue-sampling.">Impact of sample acquisition and linear amplification on gene expression profiling of lung adenocarcinoma: laser capture micro-dissection cell-sampling versus bulk tissue-sampling.</a> BMC Medical Genomics. 2, 13 (2009).</li><li>Civita, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+and+RNA-seq+analysis:+High+sensitivity+approaches+to+explain+histopathological+heterogeneity+in+human+glioblastoma+FFPE+archived+tissues.">Laser capture microdissection and RNA-seq analysis: High sensitivity approaches to explain histopathological heterogeneity in human glioblastoma FFPE archived tissues.</a> Frontiers in Oncology. 9, 482 (2019).</li><li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection.">Laser capture microdissection.</a> Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).</li><li>Bonner, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection:+molecular+analysis+of+tissue.">Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue.</a> Science. 278 (5342), 1481-1483 (1997).</li><li>Hunt, J. L., Finkelstein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdissection+techniques+for+molecular+testing+in+surgical+pathology.">Microdissection techniques for molecular testing in surgical pathology.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 128 (12), 1372-1378 (2004).</li><li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection.">Laser-capture microdissection.</a> Nature Protocols. 1, 586-603 (2006).</li><li>Grafen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+expression-based+microdissection+of+formalin-fixed+lung+cancer+tissue.">Optimized expression-based microdissection of formalin-fixed lung cancer tissue.</a> Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 97 (7), 863-872 (2017).</li><li>Javey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=innovative+tumor+tissue+dissection+tool+for+molecular+oncology+diagnostics.">innovative tumor tissue dissection tool for molecular oncology diagnostics.</a> The Journal of Molecular Diagnnostics: JMD. (21), 1525-1578 (2021).</li><li>Adey, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mill+based+instrument+and+software+system+for+dissecting+slide-mounted+tissue+that+provides+digital+guidance+and+documentation.">A mill based instrument and software system for dissecting slide-mounted tissue that provides digital guidance and documentation.</a> BMC Clinical Pathology. 13 (1), 29 (2013).</li></ol>

Hier wird ein Protokoll für die Anwendung von digitaler Annotation und automatisierter Dissektion vorgestellt, um Tumorregionen von FFPE mit niedrigem Tumorgehalt oder frischem gefrorenem Gewebe für die Tumoranreicherung und den Einsatz in WES zu sezieren. Die Kombination von digitaler Annotation und Maskenerstellung mit automatisierter Dissektion reduziert die erforderliche praktische Zeit und das Know-how, die für klassische Methoden der Tumoranreicherung, einschließlich manueller Makrodissektion und LCM, üblich s...

Next Generation Sequencing (NGS) wird zunehmend sowohl für die Patientenversorgung als auch in der Krebsforschung eingesetzt, um Behandlungen zu leiten und wissenschaftliche Entdeckungen zu erleichtern. Das Gewebe ist oft begrenzt und kleine Proben mit variablem Tumorgehalt werden routinemäßig verwendet. Tumoradäquanz und -integrität bleiben daher ein Hindernis für die Gewinnung aussagekräftiger Daten. Proben mit niedrigeren Tumoranteilen können Schwierigkeiten bei der Unterscheidung von wahren Varianten von Sequenzierungsartefakten verursachen und sind oft nicht für NGS1 geeignet. Es hat sich gezeigt, dass die Tumoranreicherung von Fällen mit niedrigem Tumorgehalt, die unter 20% liegen, dazu beiträgt, ausreichend Material zu liefern, um reproduzierbare Sequenzierungsdaten zu generieren und sicherzustellen, dass niederfrequente Varianten nicht übersehen werden 2,3. Die Grenzen variieren jedoch je nach den verwendeten Plattformen und der geplanten Nutzung der generierten Daten.
Traditionell erfolgt die Anreicherung von Tumorregionen für die Extraktion durch manuelle Makrodissektion oder Laser-Capture-Mikrodissektion (LCM) von Formalin fixed paraffin embedded (FFPE) Objektträgern. Die manuelle Makrodissektion oder das Abkratzen bestimmter Gewebebereiche von Objektträgern ermöglicht die Entfernung von Tumorregionen für die Verwendung in nachgeschalteten Assays mit relativ geringen Kosten, aber mit geringer Genauigkeit und geringer Präzision 2,4. Minimale technische Genauigkeit kann sehr effektiv sein bei Fällen mit höherem Tumorgehalt, in denen große Tumorschwaden vorhanden sind und / oder minimaler Gewebeverlust die Ergebnisse nicht signifikant beeinflusst, aber Fälle mit niedrigem Tumorgehalt oder Fälle mit stärker dispergiertem Tumor erfordern eine erhöhte Präzision. LCM wurde daher in den 1990er Jahren erfunden und wurde zu einem wertvollen Weg, um kleine, definierte, mikroskopisch kleine Geweberegionen aus formalin fixen Paraffin eingebetteten (FFPE) Objektträgern 5,6,7,8 präzise zu entfernen. LCM kann verwendet werden, um Einzelzellpopulationen zu sammeln, wenn eine komplexe Heterogenität der Stichprobe besteht9, was die Sammlung von zuvor schwer zu trennenden Zellpopulationen ermöglicht. LCM erfordert jedoch kostspielige Maschinen, die umfangreiches technisches Know-how und praktische Zeit erfordern 10,11,12,13,14.
Das für die automatisierte Gewebedissektion verwendete Instrument weist eine Genauigkeit zwischen LCM (~10 μm) und Makrodissektionen (~1 mm)15 auf. Darüber hinaus weist es sowohl Kosten- als auch technische Qualifikationsanforderungen zwischen Makrodissektion und LCM auf und wurde entwickelt, um eine schnelle Gewebeanreicherung von sequentiellen FFPE-Objektträgern durchzuführen, um die Nachteile früherer Methodenzu lindern 15. Die automatisierte Dissektion auf diese Weise verwendet digitale Anmerkungen oder Referenzbildüberlagerungen auf der Bühne auf seriell geschnittene, ungefärbte Gewebeobjektträger, um Bereiche von Interesse zu sezieren und anzureichern. Das Instrument verwendet Kunststoff-Spinnmesser-Frässpitzen, 1,5-ml-Sammelrohre und kann mit einer Reihe verschiedener Flüssigkeiten zur Dissektion verwendet werden, um Bereiche zu sammeln, die für nachgeschaltete Assays von Interesse sind, einschließlich der Nukleinextraktion und -sequenzierung. Die sich drehende Kunststoff-Frässpitze verwendet innere und äußere Spritzenbehälter und einen Kolben, um Puffer zu sammeln, dann zu mahlen und sammelt Gewebe16. Der variable Durchmesser der Frässpitze (250 μm, 525 μm, 725 μm) kann die Dissektion von separaten Gewebebereichen zum Vergleich, multifokalen Regionen, die gepoolt werden können, oder einzelnen kleinen Bereichen aus einzelnen oder mehreren FFPE-Objektträgern ermöglichen. Die für die Ernte verwendeten Abschnittsdicken können basierend auf den individuellen Experimentanforderungen angepasst werden, und die Benutzer können sicherstellen, dass die interessierenden Regionen nicht erschöpft sind, indem sie unmittelbar nach dem letzten für die Ernte verwendeten Abschnitt eine zusätzliche H & E an einem seriellen Abschnitt durchführen.
Die automatisierte Dissektion wurde als eine Möglichkeit identifiziert, den Tumorgehalt in Fällen mit niedrigem Tumorgehalt anzureichern, und wir testeten und erweiterten die beabsichtigte Funktionalität eines automatisierten Gewebedissektionsinstruments, das derzeit für den Einsatz an klinischen FFPE-Proben mit einer Dicke von bis zu 10 μm vermarktet wird. Die Arbeit zeigt, dass die automatisierte Dissektion sowohl auf FFPE- als auch auf frisch gefrorene menschliche oder tierische Gewebeschnitte mit einer Dicke von bis zu 20 μm für Forschungszwecke angewendet werden kann. Das Protokoll demonstriert auch einen Ansatz zur digitalen Annotation und Automatisierung der Dissektion für die Tumoranreicherung in Geweben mit niedrigem Tumorgehalt und / oder Fällen mit verschachtelten, dispergierten Tumoren, bei denen eine sinnvolle Makrodissektion eine Herausforderung darstellt oder nicht durchführbar ist, und zeigt sowohl die Qualität als auch die Ausbeute an Nukleinsäuren, die für NGS ausreichen. Die automatisierte Dissektion kann daher eine mittlere Präzision und einen erhöhten Durchsatz für die Tumoranreicherung bieten und könnte auch zur Bereicherung anderer interessanter Regionen oder in Kombination mit anderen Plattformen zur Beantwortung von Forschungs- oder klinischen Fragen eingesetzt werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agilent SureSelectXT</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G9611A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AVENIO Millisect Fill Station</td>
			<td>Roche</td>
			<td>8106533001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AVENIO Millisect Instrument, Base</td>
			<td>Roche</td>
			<td>8106568001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AVENIO Millisect Instrument, Head</td>
			<td>Roche</td>
			<td>8106550001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AVENIO Millisect Milling Tips Small</td>
			<td>Roche</td>
			<td>8106509001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AVENIO Millisect PC</td>
			<td>Roche</td>
			<td>8106495001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioAnalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5427R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620700</td>
			<td>Micro-centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubation Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>D920D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Autostainer XL</td>
			<td>Leica</td>
			<td>ST5010</td>
			<td>Automated stainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Grade Mineral Oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5904-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V302B</td>
			<td>Digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen AllPrep DNA/RNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RLT Plus buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus positively charged microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>6776214</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated dissection protocol for tumor enrichment in low tumor content tissues

Eine Tumoranreicherung in Geweben mit niedrigem Tumorgehalt, die je nach Methode unter 20% Tumorgehalt liegen, ist erforderlich, um Qualitätsdaten reproduzierbar mit vielen nachgelagerten Assays wie Next Generation Sequencing zu generieren. Die automatisierte Gewebedissektion ist eine neue Methodik, die die Tumoranreicherung in diesen häufigen Geweben mit niedrigem Tumorgehalt automatisiert und verbessert, indem sie die benutzerabhängige Ungenauigkeit der traditionellen Makrodissektion und die Zeit-, Kosten- und Fachkenntnissebeschränkungen der Laser-Capture-Mikrodissektion durch die Verwendung digitaler Bildannotationsüberlagerungen auf ungefärbten Objektträgern verringert. Hier werden digitale Hämatoxylin- und Eosin (H&E)-Annotationen verwendet, um kleine Tumorbereiche mit einer Klinge mit einem Durchmesser von250 μm 2 in ungefärbtem Formalin fixed paraffin embedded (FFPE) oder frischen gefrorenen Abschnitten mit einer Dicke von bis zu 20 μm für die automatisierte Tumoranreicherung vor der Nukleinsäureextraktion und der Sequenzierung ganzer Exome (WES) anzusprechen. Die automatisierte Dissektion kann annotierte Regionen in Geweben mit niedrigem Tumorgehalt aus einzelnen oder mehreren Abschnitten für die Nukleinsäureextraktion ernten. Es ermöglicht auch die Erfassung umfangreicher Erfassungsmetriken vor und nach der Ernte bei gleichzeitiger Verbesserung der Genauigkeit, Reproduzierbarkeit und Erhöhung des Durchsatzes bei Auslastung von weniger Objektträgern. Das beschriebene Protokoll ermöglicht eine digitale Annotation mit automatisierter Dissektion von tierischem und/oder menschlichem FFPE oder frischem gefrorenem Gewebe mit niedrigem Tumorgehalt und könnte auch für jede Region von Interesse verwendet werden, um die Angemessenheit für nachgelagerte Sequenzierungsanwendungen in klinischen oder Forschungsabläufen zu erhöhen.

FFPE- und FF-Mausleberschnitte, die metastasierenden Darmkrebs in Xenotransplantaten enthielten, wurden ausgewählt. Die Abschnitte wurden H & E-gefärbt (Abbildung 1A, E, I) und auf einem ganzen Dia-Imager mit 20-facher Vergrößerung gescannt. Ein Pathologe annotierte digitale Tumorregionen von Interesse und eine Maske wurde mit kommerzieller Software generiert und als digitales png-Referenzbild formatiert (Abbildung 1B, F, J)...

Watch this Scientific Journal Video about Automated Dissection Protocol for Tumor Enrichment in Low Tumor Content Tissues at JoVE.com

Automated Dissection Protocol for Tumor Enrichment in Low Tumor Content Tissues

Die digitale Annotation mit automatisierter Gewebedissektion bietet einen innovativen Ansatz zur Anreicherung von Tumoren in Fällen mit niedrigem Tumorgehalt und ist sowohl an Paraffin- als auch an gefrorene Gewebetypen anpassbar. Der beschriebene Workflow verbessert die Genauigkeit, Reproduzierbarkeit und den Durchsatz und kann sowohl in der Forschung als auch in der klinischen Umgebung angewendet werden.

Automatisiertes Dissektionsprotokoll zur Tumoranreicherung in Geweben mit niedrigem Tumorgehalt

Tumor enrichment in low tumor content tissues, those below 20% tumor content depending on the method, is required to generate quality data reproducibly ...

Die Isolierung oder Anreicherung kleiner dispergierter Regionen von Interesse aus FFPE oder frischem Tiefkühlmaterial kann mit automatisierter Dissektion schneller und effizienter als mit herkömmlichen Methoden erreicht werden. Die Extraktion von genomischem Material aus FFPE oder frischem gefrorenem Gewebe ist eine Voraussetzung für viele klinische und translationale Forschungslabors. Die automatisierte Dissektion füllt eine signifikante Lücke zwischen Makrodissektion und Laser-Capture-Mikrodissektion.Kommentieren Sie zunächst die gescannten Folienbilder für die interessierenden Tumorregionen mit einer vom Anbieter bereitgestellten Anzeigeplattform oder einem Open-Source-Viewer. Platzieren Sie den unbefleckten Objektträger auf dem Tisch in der ersten bis vierten Objektträgerposition, wenn Sie eine digitale Objektträgerreferenz verwenden. Erstellen Sie einen Fräsauftrag mit der automatisierten Gewebedissektionssoftware, indem Sie die Auftragsliste öffnen, dann Neuen Auftrag erstellen auswählen und die Fall-ID und den Namen eingeben, um den Namen des Auftrags einzugeben.Wechseln Sie zu Dicke, und wählen Sie die Schnittstärke mithilfe der Pfeilregisterkarte nach oben oder unten aus. Gehen Sie dann zu Gewebepräparation und wählen Sie Paraffinisiert oder Deparaffinisiert. Wählen Sie "Referenzbild" aus der Datei und Bild importieren.Wählen Sie dann die zu importierende Datei aus der Dropdown-Liste als digitale Referenz aus. Scannen Sie die Stufe, indem Sie die Schaltfläche "Scan-Stufe" in der unteren rechten Ecke auswählen, um jeden Probengewebeträger an der ersten bis vierten Position zu erfassen. Ziehen Sie für die Referenz auf der Bühne das Feld, um einen rechteckigen Bereich über dem Gewebe zu erstellen, und wählen Sie die kreisförmige Blase unter dem rechteckigen Bereich aus, um das Bühnenreferenzbild aufzunehmen.Kopieren Sie dieses Rechteckfeld auf die verbleibenden Objektträger der Probe in der zweiten bis vierten Objektträgerposition, indem Sie die Kopieroption in der oberen rechten Ecke des Referenzbildes auswählen. Richten Sie dann die Größe aus und ändern Sie die Größe nach Bedarf. Überlagern Sie das Bild für das digitale Referenzbild auf dem ausgewählten rechteckigen Bereich.Ändern Sie dann die Größe und richten Sie die digitale Referenz grob aus, natürlich zoomen, um sie am besten an die Größe und die Position über dem Probengewebe anzupassen. Kopieren Sie dieses Rechteckfeld auf die verbleibenden Objektträger der Probe in der zweiten bis vierten Objektträgerposition, indem Sie die Kopieroption in der oberen rechten Ecke des Referenzbildes auswählen. Richten Sie dann die Größe aus und ändern Sie die Größe nach Bedarf.Wählen Sie die Schaltfläche "Scan-Phase" in der unteren rechten Ecke, um in den Feinjustierungsschritt zu gelangen. Wählen Sie die Position der ersten Stufe und das Symbol "Werkzeug transformieren" in der rechten Symbolleiste aus, um feine Ausrichtungs- und Zoomanpassungen der Referenz vorzunehmen, die am besten zur Beispielfolienüberlagerung passen. Verwenden Sie den Verweis auf die Sample-Schiebeleiste am unteren Bildschirmrand, und wechseln Sie zwischen den Referenz- und Sample-Bildern.Und die Zoom- und Zoom-Out-Funktion, um die Ausrichtung jeder Folienposition anzupassen und zu erreichen. Sobald die optimale Probenüberlagerung erreicht ist, zeichnen Sie die Fräsbahnbezeichnungen auf den farbigen Teil des maskierten Referenzbildes, indem Sie das Farbauswahlwerkzeugsymbol in der rechten Symbolleiste auswählen. Zeichnen Sie die Fräspfade auf die Beispielfolien, indem Sie die Schaltfläche "Anmerkungen abrufen" in der unteren rechten Ecke des Bildschirms auswählen.Erfassen und erfassen Sie den annotierten Bereich von Interesse mit vier oder weniger Frässpitzen, wenn der Fräsweg berechnet wird. Die Frässpitzennutzung in der oberen linken Ecke wird basierend auf der abgedeckten Fläche und der ausgewählten Spitzengröße berechnet. Die Spitzengröße kann unter dem Frässpitzenpfeil geändert werden, und die Spitzenverwendung wird neu berechnet.Wenn der Fräspfad in der ersten Schlittenposition ausgewählt wird, wird er auf die verbleibenden Schlittenpositionen kopiert. Wählen Sie die Schaltfläche "Setup-Stufe" in der unteren rechten Ecke des Bildschirms, um die Frässpitzen aus den Auffangrohren in ihrer richtigen Bezeichnung auf der Bühne zeitnah zu laden. Füllen Sie das Reservoir mit drei Millilitern geeignetem Dissektionspuffer für den Gewebetyp und für die nachgeschaltete Nukleinsäureextraktion.Wählen Sie dann die Schaltfläche "Sezieren" in der unteren rechten Ecke des Bildschirms. Entfernen Sie nach der automatisierten Dissektion die Auffangröhrchen und die sezierten Probenobjektträger von der Bühne. Legen Sie die Auffangrohre in das Rohrgestell und die Schlitten in das Diagestell.Die H & E-gefärbten Formalin, festes Paraffin eingebettet und frische gefrorene Mausleberabschnitte, die metastasierenden Darmkrebs in Xenotransplantaten enthielten, wurden auf einem ganzen Dia-Imager mit 20-facher Vergrößerung gescannt und als Referenzobjektträger verwendet. Die H&E-gefärbten Referenzobjektträger wurden für die Dissektion und Nukleinsäureextraktion mit Anmerkungen versehen und digital für Tumorregionen maskiert. Die nachsezierten Probenobjektträger wurden H & E gefärbt, um die Sezierbereiche in 10-Mikrometer- und 20-Mikrometer-Objektträgern zu bestätigen.Erfasste Metriken zeigten den Erfolg der automatisierten Dissektion und Nukleinsäureextraktion. Beachten Sie beim Versuch dieses Protokolls, dass das Erreichen einer relativ genauen Überlagerung der Anmerkungen auf den unbefleckten Folien wichtig ist, um Interessenbereiche zu isolieren.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Das<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginalscheibe Tumormodell: Visualisierung und Quantifizierung von Genexpression und Tumorinvasivität mit Genetischen Mosaiken

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Forschung

Krebsforschung

A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System

Ein Murine Orthotopische Blasentumormodell und Tumor Detection System

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified ...

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Ziel Zelle Voranreicherung und ganze Genome Amplifikation für einzelne Zelle nachgelagerten Charakterisierung

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

Die Einrichtung eines Lunge Kolonisation Assays für zirkulierenden Tumor Zelle Visualisierung im Lungengewebe

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues

Eine integrierte Plattform für genomweite Kartierung von Chromatin Staaten mit hohem Durchsatz ChIP-Sequenzierung im Tumorgewebe

Histone modifications constitute a major component of the epigenome and play important regulatory roles in determining the transcriptional status of ...

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

Radionuklid-Fluoreszenz-Reporter-Gen Imaging zu Tumorprogression in Nagetier Tumormodellen verfolgen

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

A Method to Define the Effects of Environmental Enrichment on Colon Microbiome Biodiversity in a Mouse Colon Tumor Model

Eine Methode, um die Auswirkungen der Umweltanreicherung Doppelpunkt Microbiome Biodiversitätskonvention in einem Mausmodell Doppelpunkt Tumor definieren

Several recent studies have illustrated the beneficial effects of living in an enriched environment on improving human disease. In mice, environmental ...

Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors

Bereicherung und Charakterisierung von dem Tumor immun und nicht-immunen Mikroumgebungen in etablierte subkutane murinen Tumoren

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Digitalen Polymerase-Kettenreaktion-Assay für die genetische Variation bei einem sporadischen familiäre adenomatöse Polyposis Patienten mit dem Chip-in-Rohr-Format

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Paramyxoviruses für Tumor-gezielte Immunmodulation: Gestaltung und Evaluation Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...