Name: automated dissection protocol for tumor enrichment in low tumor content tissues
Uploaded: 2021-03-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Dissection Protocol for Tumor Enrichment in Low Tumor Content Tissues at JoVE.com

המחברים רוצים להודות לקרמינה אספיריטו ורובין א. טיילור על תמיכתם בפיתוח דיסקציה אוטומטית, כמו גם לצוות המעבדה המרכזית לפתולוגיה של Genentech שתמך בעבודה זו.

לפני תחילת העבודה, השג דגימות רקמות מתאימות על פי פרוטוקולי מועצת הביקורת המוסדית (IRB). כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של Genentech, Inc.
1. הכנת רקמות ושקופיות
<ol><li>בחר בלוקי FFPE או רקמות קפואות טריות והשתמש בשיטת העיבוד המתאימה להלן...

<ol>
	<li>Cho, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+recommendations+for+precision+cancer+therapy+using+next+generation+sequencing:+a+comprehensive+single+cancer+center's+experiences.">Tissue recommendations for precision cancer therapy using next generation sequencing: a comprehensive single cancer center's experiences.</a> Oncotarget. 8 (26), 42478-42486 (2017).</li><li>Smits, A. J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+estimation+of+tumor+cell+percentage+for+molecular+testing+by+pathologists+is+not+accurate.">The estimation of tumor cell percentage for molecular testing by pathologists is not accurate.</a> Modern Pathology: An Official Journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 27 (2), 168-174 (2014).</li><li>Poole-Wilson, P. A., Langer, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+on+ionic+exchange+and+function+in+rat+and+rabbit+myocardium.">Effect of pH on ionic exchange and function in rat and rabbit myocardium.</a> The American Journal of Physiology. 229 (3), 570-581 (1975).</li><li>Viray, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+prospective,+multi-institutional+diagnostic+trial+to+determine+pathologist+accuracy+in+estimation+of+percentage+of+malignant+cells.">A prospective, multi-institutional diagnostic trial to determine pathologist accuracy in estimation of percentage of malignant cells.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 137 (11), 1545-1549 (2013).</li><li>El-Serag, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+in+Barrett's+Esophagus:+Laser+capture+versus+whole+tissue.">Gene Expression in Barrett's Esophagus: Laser capture versus whole tissue.</a> Scandinavian Journal of Gastroenterology. 44 (7), 787-795 (2009).</li><li>Harrell, J. C., Dye, W. W., Harvell, D. M. E., Sartorius, C. A., Horwitz, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contaminating+cells+alter+gene+signatures+in+whole+organ+versus+laser+capture+microdissected+tumors:+a+comparison+of+experimental+breast+cancers+and+their+lymph+node+metastases.">Contaminating cells alter gene signatures in whole organ versus laser capture microdissected tumors: a comparison of experimental breast cancers and their lymph node metastases.</a> Clinical &amp; Experimental Metastasis. 25 (1), 81-88 (2008).</li><li>Kim, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinctions+in+gastric+cancer+gene+expression+signatures+derived+from+laser+capture+microdissection+versus+histologic+macrodissection.">Distinctions in gastric cancer gene expression signatures derived from laser capture microdissection versus histologic macrodissection.</a> BMC Medical Genomics. 4, 48 (2011).</li><li>Klee, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+sample+acquisition+and+linear+amplification+on+gene+expression+profiling+of+lung+adenocarcinoma:+laser+capture+micro-dissection+cell-sampling+versus+bulk+tissue-sampling.">Impact of sample acquisition and linear amplification on gene expression profiling of lung adenocarcinoma: laser capture micro-dissection cell-sampling versus bulk tissue-sampling.</a> BMC Medical Genomics. 2, 13 (2009).</li><li>Civita, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+and+RNA-seq+analysis:+High+sensitivity+approaches+to+explain+histopathological+heterogeneity+in+human+glioblastoma+FFPE+archived+tissues.">Laser capture microdissection and RNA-seq analysis: High sensitivity approaches to explain histopathological heterogeneity in human glioblastoma FFPE archived tissues.</a> Frontiers in Oncology. 9, 482 (2019).</li><li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection.">Laser capture microdissection.</a> Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).</li><li>Bonner, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection:+molecular+analysis+of+tissue.">Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue.</a> Science. 278 (5342), 1481-1483 (1997).</li><li>Hunt, J. L., Finkelstein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdissection+techniques+for+molecular+testing+in+surgical+pathology.">Microdissection techniques for molecular testing in surgical pathology.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 128 (12), 1372-1378 (2004).</li><li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection.">Laser-capture microdissection.</a> Nature Protocols. 1, 586-603 (2006).</li><li>Grafen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+expression-based+microdissection+of+formalin-fixed+lung+cancer+tissue.">Optimized expression-based microdissection of formalin-fixed lung cancer tissue.</a> Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 97 (7), 863-872 (2017).</li><li>Javey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=innovative+tumor+tissue+dissection+tool+for+molecular+oncology+diagnostics.">innovative tumor tissue dissection tool for molecular oncology diagnostics.</a> The Journal of Molecular Diagnnostics: JMD. (21), 1525-1578 (2021).</li><li>Adey, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mill+based+instrument+and+software+system+for+dissecting+slide-mounted+tissue+that+provides+digital+guidance+and+documentation.">A mill based instrument and software system for dissecting slide-mounted tissue that provides digital guidance and documentation.</a> BMC Clinical Pathology. 13 (1), 29 (2013).</li></ol>

מוצג כאן פרוטוקול ליישום של ביאור דיגיטלי וכריתה אוטומטית לנתח אזורי גידול מתכולת גידול נמוכה FFPE או רקמות קפואות טריות להעשרת הגידול והשימוש בו ב- WES. שילוב של ביאור דיגיטלי ויצירת מסכה עם דיסקציה אוטומטית מפחית באופן משמעותי את הזמן והמומחיות המעשיים הנדרשים הנפוצים בשיטות קלאסיות של הע...

ריצוף הדור הבא (NGS) מנוצל יותר ויותר הן לטיפול בחולים והן לחקר הסרטן כדי לסייע בהנחיית טיפולים ובהקלה על גילוי מדעי. רקמה היא לעתים קרובות מוגבלת ודגימות קטנות עם תוכן גידול משתנה משמשים באופן שגרתי. הלימות הגידול ושלמותו, אם כן, נותרו מחסום להשגת נתונים משמעותיים. דגימות עם אחוזי גידול נמוכים יותר עלולות לגרום לקושי להבחין בין וריאנטים אמיתיים לבין ממצאי ריצוף ולעתים קרובות אינן זכאיות ל- NGS1. העשרת גידולים של מקרים בעלי תכולת גידול נמוכה, אלה הנמוכים מ-20%, הוכחה כמסייעת להניב מספיק חומר על מנת לייצר נתוני ריצוף הניתנים לשחזור ולהבטיח שגרסאות בתדר נמוך לא יחמיצו 2,3. עם זאת, המגבלות ישתנו בהתאם לפלטפורמות המשמשות והשימוש המתוכנן בנתונים שנוצרו.
באופן מסורתי, העשרה של אזורי גידול למיצוי מתבצעת על ידי מקרודיסקציה ידנית או מיקרו-דיסקציה של לכידת לייזר (LCM) של שקופיות מוטבעות פרפין קבועות פורמלין (FFPE). מקרו-דיסקציה ידנית, או גירוד אזורי רקמה מוגדרים משקופיות, מאפשרת להסיר אזורי גידול לשימוש בבדיקות במורד הזרם בעלות נמוכה יחסית, אך עם דיוק נמוך ודיוק נמוך 2,4. דיוק טכני מינימלי יכול להיות יעיל מאוד במקרים של תכולת גידול גבוהה יותר בהם קיימים חלקים גדולים של גידול ו/או אובדן רקמות מינימלי אינו משפיע באופן משמעותי על התוצאות, אך מקרים של תכולת גידול נמוכה או מקרים עם גידול מפוזר יותר דורשים דיוק מוגבר. LCM הומצא אפוא בשנות ה-90 של המאה ה-20 והפך לדרך רבת ערך להסיר במדויק אזורים קטנים, מוגדרים ומיקרוסקופיים של רקמה משקופיות פרפין קבוע פורמלין (FFPE) 5,6,7,8. ניתן להשתמש ב-LCM כדי לאסוף אוכלוסיות של תאים בודדים כאשר ההטרוגניות המורכבת של הדגימה קיימת9 ומאפשרת איסוף של אוכלוסיות תאים שבעבר היה קשה להפריד. עם זאת, LCM דורש מכונות יקרות הדורשות מומחיות טכנית נרחבת וזמן מעשי 10,11,12,13,14.
המכשיר המשמש לניתוח אוטומטי של רקמות הוא בעל דיוק בין זה של LCM (~10 מיקרומטר) לבין מקרו-דיסקציות (~1 מ"מ)15. בנוסף, הוא מציג הן דרישות עלות והן דרישות מומחיות טכניות בין זו של מקרודיסקציה ו- LCM ונועד לבצע העשרת רקמות מהירה משקופיות FFPE רציפות כדי להקל על החסרונות של שיטות קודמות15. כריתה אוטומטית באופן זה משתמשת בביאורים דיגיטליים או בשכבות-על של תמונות ייחוס שקופיות על הבמה על גבי שקופיות רקמה לא מוכתמות בחתך סדרתי לצורך ניתוח והעשרה של אזורי עניין. המכשיר משתמש בקצות כרסום להב מסתובב מפלסטיק, צינורות איסוף של 1.5 מ"ל וניתן להשתמש בו עם מספר נוזלים שונים לצורך כריתה כדי לאסוף אזורי עניין לבדיקות במורד הזרם הכוללות מיצוי גרעין וריצוף. קצה הטחינה הפלסטי המסתובבת משתמש במאגרי חבית מזרקים פנימיים וחיצוניים ובוכנה לאיסוף חיץ, ואז טוחן ואוסף רקמות16. קוטר גודל קצה הטחינה המשתנה (250 מיקרומטר, 525 מיקרומטר, 725 מיקרומטר) יכול לאפשר כריתה של אזורי רקמה נפרדים לצורך השוואה, אזורים מולטיפוקליים שניתן לאגד או אזורים קטנים בודדים משקופיות FFPE בודדות או מרובות. ניתן להתאים את עוביי המקטעים המשמשים לקציר על סמך צרכי הניסוי האינדיבידואליים והמשתמשים יכולים להבטיח שאזורי העניין לא התרוקנו על ידי ביצוע H&E נוסף בקטע טורי אחד מיד לאחר הקטע האחרון ששימש לקציר.
כריתה אוטומטית זוהתה כדרך להעשיר את תכולת הגידול במקרים של תכולת גידול נמוכה ובדקנו והרחבנו את הפונקציונליות המיועדת של מכשיר כריתת רקמות אוטומטי, המשווק כיום לשימוש בדגימות קליניות של FFPE בעובי של עד 10 מיקרומטר. העבודה מראה כי ניתן ליישם כריתה אוטומטית הן על FFPE והן על מקטעי רקמות קפואות טריות של בני אדם או בעלי חיים בעובי של עד 20 מיקרומטר למטרות מחקר. הפרוטוקול גם מדגים גישה לביאור דיגיטלי ולאוטומציה של כריתה להעשרת גידולים ברקמות עם תכולת גידול נמוכה ו/או מקרים של גידול מקונן ומפוזר שבו מקרו-דיסקציה משמעותית היא מאתגרת או לא אפשרית ומראה הן איכות והן תפוקה של חומצת גרעין המספיקה ל-NGS. לפיכך, דיסקציה אוטומטית יכולה לספק דיוק ברמה בינונית ותפוקה מוגברת להעשרת גידולים, וניתן ליישם אותה גם כדי להעשיר אזורי עניין אחרים או לשלב אותה עם פלטפורמות אחרות כדי לענות על שאלות מחקריות או קליניות.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agilent SureSelectXT</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G9611A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AVENIO Millisect Fill Station</td>
			<td>Roche</td>
			<td>8106533001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AVENIO Millisect Instrument, Base</td>
			<td>Roche</td>
			<td>8106568001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AVENIO Millisect Instrument, Head</td>
			<td>Roche</td>
			<td>8106550001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AVENIO Millisect Milling Tips Small</td>
			<td>Roche</td>
			<td>8106509001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AVENIO Millisect PC</td>
			<td>Roche</td>
			<td>8106495001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioAnalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5427R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620700</td>
			<td>Micro-centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubation Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>D920D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Autostainer XL</td>
			<td>Leica</td>
			<td>ST5010</td>
			<td>Automated stainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Grade Mineral Oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5904-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V302B</td>
			<td>Digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen AllPrep DNA/RNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RLT Plus buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus positively charged microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>6776214</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated dissection protocol for tumor enrichment in low tumor content tissues

העשרת גידולים ברקמות בעלות תכולת גידול נמוכה, אלה שמתחת לתכולת הגידול של 20% בהתאם לשיטה, נדרשת כדי להפיק נתונים איכותיים באופן משוחזר עם בדיקות רבות במורד הזרם כגון ריצוף הדור הבא. כריתת רקמות אוטומטית היא מתודולוגיה חדשה שהופכת ומשפרת את העשרת הגידולים ברקמות הנפוצות והנמוכות הללו על ידי הפחתת חוסר הדיוק התלוי במשתמש של ניתוח מאקרו מסורתי ומגבלות זמן, עלות ומומחיות של מיקרו-דיסקציה של לכידת לייזר על-ידי שימוש בשכבת-על של ביאור תמונה דיגיטלי על גבי שקופיות לא מוכתמות. כאן, ביאורים דיגיטליים של המטוקסילין ואאוזין (H&E) משמשים כדי להתמקד באזורי גידול קטנים באמצעות להב בקוטר 250 מיקרומטר2 בפרפין קבוע פורמלין לא מוכתם משובץ (FFPE) או מקטעים קפואים טריים בעובי של עד 20 מיקרומטר להעשרת גידולים אוטומטית לפני מיצוי חומצות גרעין וריצוף אקסום שלם (WES). כריתה אוטומטית יכולה לקצור אזורים מבוארים ברקמות בעלות תכולת גידול נמוכה מקטעים בודדים או מרובים למיצוי חומצות גרעין. הוא גם מאפשר לכידה של מדדי איסוף נרחבים לפני ואחרי הקציר תוך שיפור הדיוק, יכולת השכפול והגדלת התפוקה תוך ניצול של פחות שקופיות. הפרוטוקול המתואר מאפשר ביאור דיגיטלי עם דיסקציה אוטומטית על FFPE של בעלי חיים ו/או בני אדם או רקמות קפואות טריות עם תכולת גידול נמוכה ויכול לשמש גם לכל אזור העשרת עניין כדי להגביר את ההלימה ליישומי ריצוף במורד הזרם בתהליכי עבודה קליניים או מחקריים.

נבחרו מקטעי כבד של עכברי FFPE ו-FF המכילים סרטן מעי גס גרורתי בנצרי קסנוגרפט. המקטעים הוכתמו ב-H&E (איור 1A,E,I) ונסרקו על תמונת שקופיות שלמה בהגדלה של פי 20. פתולוג ציין באופן דיגיטלי אזורי גידול מעניינים ומסכה נוצרה באמצעות תוכנה מסחרית ועוצבה כתמונת ייחוס דיגיטלית של png (...

Watch this Scientific Journal Video about Automated Dissection Protocol for Tumor Enrichment in Low Tumor Content Tissues at JoVE.com

Automated Dissection Protocol for Tumor Enrichment in Low Tumor Content Tissues

ביאור דיגיטלי עם דיסקציה אוטומטית של רקמות מספק גישה חדשנית להעשרת הגידול במקרים של תכולת גידול נמוכה וניתן להתאמה הן לסוגי פרפין והן לסוגי רקמות קפואות. זרימת העבודה המתוארת משפרת את הדיוק, יכולת השכפול והתפוקה וניתן ליישם אותה הן על הגדרות המחקר והן על ההגדרות הקליניות.

פרוטוקול דיסקציה אוטומטי להעשרת גידולים ברקמות בעלות תכולת גידול נמוכה

Tumor enrichment in low tumor content tissues, those below 20% tumor content depending on the method, is required to generate quality data reproducibly ...

בידוד או העשרה של אזורים קטנים מפוזרים בעלי עניין מ- FFPE, או חומר קפוא טרי, ניתן להשיג עם דיסקציה אוטומטית במהירות וביעילות רבה יותר מאשר בשיטות מסורתיות. מיצוי של חומר גנומי מ-FFPE, או רקמות קפואות טריות, הוא דרישה למעבדות מחקר קליניות ותרגומיות רבות. דיסקציה אוטומטית ממלאת פער משמעותי בין כריתת מאקרו למיקרו דיסקציה של לכידת לייזר.כדי להתחיל, הוסף את הערות השקופיות הסרוקות עבור אזורי הגידול המעניינים, באמצעות פלטפורמת צפייה המסופקת על ידי הספק, או צופה בקוד פתוח. מקם את שקופית רקמת הדגימה הלא מוכתמת על הבמה במיקום השקופית הראשונה עד הרביעית בעת שימוש בהפניה לשקופית דיגיטלית. צור משימת כרסום באמצעות תוכנת ניתוח הרקמות האוטומטית על-ידי פתיחת רשימת משימות, ולאחר מכן בחר צור עבודה חדשה והזן את מזהה המקרה ואת השם כדי להזין את שם המשרה.עבור אל עובי ובחר עובי מקטע באמצעות הכרטיסיה חץ למעלה או למטה. לאחר מכן, עבור אל הכנת רקמות, ובחר Paraffinized, או Deparaffinized. בחר תמונת הפניה "מתוך הקובץ, ויבא תמונה.לאחר מכן, בחר את הקובץ לייבוא מהתפריט הנפתח כהפניה הדיגיטלית. סרוק את השלב על-ידי בחירה בלחצן שלב הסריקה בפינה השמאלית התחתונה כדי ללכוד כל שקופית רקמת דגימה במיקום הראשון עד הרביעי. עבור ההפניה על הבמה, גרור את התיבה כדי ליצור אזור מלבני מעל הרקמה, ובחר את הבועה העגולה מתחת לאזור המלבני כדי לצלם את תמונת הפניה לבמה.העתק שדה מלבן זה לשקופיות רקמות הדגימה הנותרות במיקומי השקופית השנייה עד הרביעית על-ידי בחירה באפשרות ההעתקה בפינה השמאלית העליונה של תמונת ההפניה. לאחר מכן, יישרו את גודלכם ושינו את גודלם לפי הצורך. עבור תמונת ההפניה הדיגיטלית, הוסיפו את שכבת-העל של התמונה באזור המלבני שנבחר.לאחר מכן, שנה את גודל ההפניה הדיגיטלית ויישר אותה בצורה גסה, כמובן, זום, כך שיתאים בצורה הטובה ביותר לגודל ולמיקום מעל רקמת הדגימה. העתק שדה מלבן זה לשקופיות רקמות הדגימה הנותרות במיקומי השקופית השנייה עד הרביעית על-ידי בחירה באפשרות ההעתקה בפינה השמאלית העליונה של תמונת ההפניה. לאחר מכן, יישרו את גודלכם ושינו את גודלם לפי הצורך.בחר בלחצן שלב הסריקה בפינה השמאלית התחתונה כדי לעבור לשלב הכוונון העדין. בחר את מיקום השלב הראשון ואת סמל הכלי 'שינוי צורה' בסרגל הכלים הימני, כדי לבצע התאמות יישור וזום עדינות של ההפניה כך שיתאימו בצורה הטובה ביותר לכיסוי השקופית לדוגמה. השתמש בהפניה לפס הזזה לדוגמה בתחתית המסך, תוך מעבר בין ההפניה לתמונות לדוגמה.בנוסף, תכונת ההגדלה וההגדלה כדי להתאים ולהשיג את היישור של כל מיקום שקופית. לאחר השגת שכבת-העל האופטימלית לדוגמה, צייר את הכינויים של נתיב הטחינה על החלק הצבעוני של תמונת הייחוס במסכה על-ידי בחירת סמל הכלי בורר הצבעים בסרגל הכלים הימני. צייר את נתיבי הטחינה לשקופיות לדוגמה על-ידי בחירה בלחצן קבל ביאורים בפינה השמאלית התחתונה של המסך.ללכוד ולאסוף את אזור העניין המבואר עם ארבעה טיפים כרסומים או פחות כאשר מחושב נתיב הטחינה. השימוש בקצה הטחינה בפינה השמאלית העליונה מחושב על סמך השטח המכוסה, וגודל הקצה שנבחר. ניתן לשנות את גודל הקצה תחת חץ קצה הטחינה, והשימוש בקצה יחושב מחדש.כאשר נתיב הטחינה נבחר במיקום השקופית הראשון, הוא יועתק למיקומי השקופיות הנותרים. בחר בלחצן "שלב ההתקנה" בפינה הימנית התחתונה של המסך לטעינה מהירה של קצות הטחינה מצינורות האיסוף בייעודם הנכון על הבמה. מלאו את המאגר בשלושה מיליליטרים של מאגר דיסקציה מתאים לסוג הרקמה, ולמיצוי חומצות גרעין במורד הזרם.לאחר מכן, בחר בלחצן Dissect" בפינה השמאלית התחתונה של המסך. לאחר הנתיחה האוטומטית, הסר את צינורות האיסוף ואת שקופיות הדגימה המנותקות מהבמה. מקם את צינורות האיסוף במדף הצינורות, ואת המגלשות במדף השקופיות.הפורמלין המוכתם של H&E, הפרפין הקבוע משובץ, ומקטעי כבד עכבר קפואים טריים המכילים סרטן מעי גס גרורתי ב-xenografts נסרקו על גבי מצלמת שקופיות שלמה בהגדלה של פי 20, ושימשו כשקופיות הייחוס. שקופיות הייחוס המוכתמות של H&E הוסתרו והוסוו באופן דיגיטלי לאזורי הגידול לצורך כריתה ומיצוי חומצות גרעין. שקופיות הדגימה שלאחר הניתוח הוכתמו ב-H&E כדי לאשר את אזורי הנתיחה בשקופיות של 10 מיקרומטר ו-20 מיקרומטר.מדדים שנתפסו הדגימו את ההצלחה של הנתיחה האוטומטית ומיצוי חומצות גרעין. כאשר מנסים פרוטוקול זה, יש לזכור כי השגת שכבת-על מדויקת יחסית של ביאור על השקופיות הלא מוכתמות חשובה לבידוד תחומי העניין.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

ה<em&gt; תסיסנית</em&gt; דגם גידול דיסק דמותי: ויזואליזציה וכימות של ביטוי גנים סרטניים הפולשנות שימוש פסיפסים גנטי

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System

מודל גידול Murine Orthotopic שלפוחית ​​השתן סרטן מערכת איתור

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified ...

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

הגברה עושר מראש ולא כל הגנום תא היעד עבור אפיון במורד הזרם תא בודד

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

הקמת Assay קולוניזציה הריאה עבור מחזור הגידול ויזואליזציה תאים ברקמות הריאה

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues

פלטפורמה משולבת עבור מיפוי הגנום כולו של כרומטין הברית באמצעות שבב בתפוקה גבוהה-רצף ברקמות הגידול

Histone modifications constitute a major component of the epigenome and play important regulatory roles in determining the transcriptional status of ...

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

רדיונוקלידים-זריחה מדווח הדמיה כדי לעקוב אחר התקדמות הגידול במודלים הגידול מכרסמים

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

A Method to Define the Effects of Environmental Enrichment on Colon Microbiome Biodiversity in a Mouse Colon Tumor Model

שיטה כדי להגדיר את ההשפעות של העשרה סביבתית על המגוון הביולוגי Microbiome המעי הגס במודל של עכברים המעי הגס גידול

Several recent studies have illustrated the beneficial effects of living in an enriched environment on improving human disease. In mice, environmental ...

Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors

העשרה ואפיון של Microenvironments המערכת החיסונית והחיסון של הגידול הוקמה גידולים מאתר תת עורית

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

פולימראז דיגיטלי Assay תגובת שרשרת עבור הווריאציה גנטי לחולה סדיר פוליפוזיס באמצעות התבנית שבב-ב--שפופרת

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Paramyxoviruses עבור Immunomodulation, ממוקדות הגידול: הערכה לשעבר Vivo ועיצוב

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...