Name: automated dissection protocol for tumor enrichment in low tumor content tissues
Uploaded: 2021-03-29T14:00:00
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Os autores gostariam de agradecer a Carmina Espiritu e Robin E. Taylor por seu apoio no desenvolvimento de dissecção automatizada, bem como a equipe do Genentech Pathology Core Laboratory que apoiou este trabalho.

Antes da iniciação, obtenha amostras de tecido adequadas de acordo com os protocolos do Conselho de Revisão Institucional (IRB). Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Genentech, Inc.
1. Preparação de tecidos e slides
<ol><li>Selecione FFPE ou blocos de tecido congelados frescos e utilize o método de processamento correspondente abaixo.</li>
	<li>Corte as seções do bloco de tecido em lâminas de vidro carreg...

<ol>
	<li>Cho, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+recommendations+for+precision+cancer+therapy+using+next+generation+sequencing:+a+comprehensive+single+cancer+center's+experiences.">Tissue recommendations for precision cancer therapy using next generation sequencing: a comprehensive single cancer center's experiences.</a> Oncotarget. 8 (26), 42478-42486 (2017).</li><li>Smits, A. J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+estimation+of+tumor+cell+percentage+for+molecular+testing+by+pathologists+is+not+accurate.">The estimation of tumor cell percentage for molecular testing by pathologists is not accurate.</a> Modern Pathology: An Official Journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 27 (2), 168-174 (2014).</li><li>Poole-Wilson, P. A., Langer, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+on+ionic+exchange+and+function+in+rat+and+rabbit+myocardium.">Effect of pH on ionic exchange and function in rat and rabbit myocardium.</a> The American Journal of Physiology. 229 (3), 570-581 (1975).</li><li>Viray, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+prospective,+multi-institutional+diagnostic+trial+to+determine+pathologist+accuracy+in+estimation+of+percentage+of+malignant+cells.">A prospective, multi-institutional diagnostic trial to determine pathologist accuracy in estimation of percentage of malignant cells.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 137 (11), 1545-1549 (2013).</li><li>El-Serag, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+in+Barrett's+Esophagus:+Laser+capture+versus+whole+tissue.">Gene Expression in Barrett's Esophagus: Laser capture versus whole tissue.</a> Scandinavian Journal of Gastroenterology. 44 (7), 787-795 (2009).</li><li>Harrell, J. C., Dye, W. W., Harvell, D. M. E., Sartorius, C. A., Horwitz, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contaminating+cells+alter+gene+signatures+in+whole+organ+versus+laser+capture+microdissected+tumors:+a+comparison+of+experimental+breast+cancers+and+their+lymph+node+metastases.">Contaminating cells alter gene signatures in whole organ versus laser capture microdissected tumors: a comparison of experimental breast cancers and their lymph node metastases.</a> Clinical &amp; Experimental Metastasis. 25 (1), 81-88 (2008).</li><li>Kim, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinctions+in+gastric+cancer+gene+expression+signatures+derived+from+laser+capture+microdissection+versus+histologic+macrodissection.">Distinctions in gastric cancer gene expression signatures derived from laser capture microdissection versus histologic macrodissection.</a> BMC Medical Genomics. 4, 48 (2011).</li><li>Klee, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+sample+acquisition+and+linear+amplification+on+gene+expression+profiling+of+lung+adenocarcinoma:+laser+capture+micro-dissection+cell-sampling+versus+bulk+tissue-sampling.">Impact of sample acquisition and linear amplification on gene expression profiling of lung adenocarcinoma: laser capture micro-dissection cell-sampling versus bulk tissue-sampling.</a> BMC Medical Genomics. 2, 13 (2009).</li><li>Civita, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+and+RNA-seq+analysis:+High+sensitivity+approaches+to+explain+histopathological+heterogeneity+in+human+glioblastoma+FFPE+archived+tissues.">Laser capture microdissection and RNA-seq analysis: High sensitivity approaches to explain histopathological heterogeneity in human glioblastoma FFPE archived tissues.</a> Frontiers in Oncology. 9, 482 (2019).</li><li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection.">Laser capture microdissection.</a> Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).</li><li>Bonner, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection:+molecular+analysis+of+tissue.">Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue.</a> Science. 278 (5342), 1481-1483 (1997).</li><li>Hunt, J. L., Finkelstein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdissection+techniques+for+molecular+testing+in+surgical+pathology.">Microdissection techniques for molecular testing in surgical pathology.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 128 (12), 1372-1378 (2004).</li><li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection.">Laser-capture microdissection.</a> Nature Protocols. 1, 586-603 (2006).</li><li>Grafen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+expression-based+microdissection+of+formalin-fixed+lung+cancer+tissue.">Optimized expression-based microdissection of formalin-fixed lung cancer tissue.</a> Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 97 (7), 863-872 (2017).</li><li>Javey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=innovative+tumor+tissue+dissection+tool+for+molecular+oncology+diagnostics.">innovative tumor tissue dissection tool for molecular oncology diagnostics.</a> The Journal of Molecular Diagnnostics: JMD. (21), 1525-1578 (2021).</li><li>Adey, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mill+based+instrument+and+software+system+for+dissecting+slide-mounted+tissue+that+provides+digital+guidance+and+documentation.">A mill based instrument and software system for dissecting slide-mounted tissue that provides digital guidance and documentation.</a> BMC Clinical Pathology. 13 (1), 29 (2013).</li></ol>

Apresentado aqui é um protocolo para a aplicação de anotação digital e dissecção automatizada para dissecar regiões tumorais a partir de baixo teor de tumor FFPE ou tecidos congelados frescos para enriquecimento tumoral e uso em WES. A combinação de anotação digital e criação de máscaras com dissecção automatizada reduz significativamente o tempo prático e a experiência necessárias comuns aos métodos clássicos de enriquecimento tumoral, incluindo a macrodisseção manual e lCM. O protocolo demonstra...

O sequenciamento da próxima geração (NGS) é cada vez mais utilizado tanto para o cuidado do paciente quanto para a pesquisa sobre câncer para ajudar a orientar os tratamentos e facilitar a descoberta científica. O tecido é muitas vezes limitado e pequenos espécimes com conteúdo tumoral variável são usados rotineiramente. A adequação e integridade tumorais, portanto, continuam a ser uma barreira para a obtenção de dados significativos. Amostras com menores percentuais tumorais podem causar dificuldade em distinguir variantes verdadeiras de artefatos sequenciamento e são muitas vezes inelegíveis para NGS1. O enriquecimento tumoral de casos de baixo teor de tumores, aqueles abaixo de 20%, tem sido mostrado para ajudar a produzir material suficiente para gerar dados de sequenciamento reprodutível e garantir que variantes de baixa frequência não sejam perdidas 2,3. No entanto, os limites variam dependendo das plataformas utilizadas e do uso planejado dos dados gerados.
Tradicionalmente, o enriquecimento das regiões tumorais para extração é realizado por macrodissecção manual ou microdissecção de captura a laser (LCM) de lâminas de parafina fixa formalina incorporada (FFPE). A macrodisseção manual, ou raspar áreas de tecido especificadas de lâminas, permite que as regiões tumorais sejam removidas para uso em ensaios a jusante com custo relativamente baixo, mas com baixa precisão e baixa precisão 2,4. A precisão técnica mínima pode ser muito eficaz com casos de maior teor de tumores onde grandes faixas de tumor estão presentes e/ou perda mínima de tecido não impacta significativamente os resultados, mas casos de baixo teor de tumores ou casos com tumor mais disperso requerem maior precisão. A LCM foi, portanto, inventada na década de 1990 e tornou-se uma forma valiosa de remover precisamente pequenas, definidas, regiões microscópicas de tecido de lâminas de parafina fixa formalina incorporadas (FFPE) 5,6,7,8. O LCM pode ser utilizado para coletar populações de células únicas quando existe heterogeneidade complexa da amostra9 permitindo a coleta de populações celulares anteriormente difíceis de separar. No entanto, a LCM requer maquinário dispendioso que requer ampla experiência técnica e tempo prático 10,11,12,13,14.
O instrumento utilizado para dissecção automatizada de tecido tem precisão entre a de LCM (~10 μm) e macrodisseções (~1 mm)15. Além disso, apresenta requisitos de custo e perícia técnica entre o de macrodisseção e LCM e foi projetado para realizar o rápido enriquecimento tecidual a partir de lâminas FFPE sequenciais para aliviar as desvantagens dos métodos anteriores15. A dissecção automatizada desta forma utiliza anotações digitais ou sobreposições de imagem de referência de slides no palco em lâminas de tecido não manchadas em série para dissecar e enriquecer regiões de interesse. O instrumento utiliza pontas de fresagem de lâmina giratórias plásticas, tubos de coleta de 1,5 mL e pode ser usado com uma série de fluidos diferentes para dissecção para coletar regiões de interesse para ensaios a jusante, incluindo extração nucleica e sequenciamento. A ponta de moagem de plástico giratório utiliza reservatórios internos e externos de barris de seringa e um êmbolo para coletar tampão, em seguida, moinhos e coleta tecido16. O diâmetro variável do tamanho da ponta de fresagem (250 μm, 525 μm, 725 μm) pode permitir a dissecção de áreas separadas de tecido para comparação, regiões multifocais que podem ser agrupadas ou pequenas áreas individuais de lâminas FFPE únicas ou múltiplas. As espessuras da seção utilizadas para a colheita podem ser ajustadas com base nas necessidades individuais de experimentos e os usuários podem garantir que regiões de interesse não tenham sido esgotadas realizando um H&E adicional em uma seção serial imediatamente após a última seção usada para a colheita.
A dissecção automatizada foi identificada como uma forma de enriquecer o conteúdo tumoral em casos de baixo teor de tumores e testamos e expandimos a funcionalidade pretendida de um instrumento automatizado de dissecção tecidual, que atualmente é comercializado para uso em amostras clínicas FFPE até 10 μm de espessura. O trabalho mostra que a dissecção automatizada pode ser aplicada tanto ao FFPE quanto a seções frescas de tecido humano ou animal congelados até 20 μm de espessura para fins de pesquisa. O protocolo também demonstra uma abordagem para anotar digitalmente e automatizar dissecção para enriquecimento tumoral em tecidos com baixo teor de tumor e/ou casos com tumor aninhado e disperso onde a macrodisseção significativa é desafiadora ou inviável e mostra qualidade e rendimento de ácido nucleico suficiente para NGS. A dissecção automatizada pode, portanto, fornecer precisão de nível médio e aumento da produtividade para o enriquecimento tumoral e também pode ser aplicada para enriquecer outras regiões de interesse ou combinada com outras plataformas para responder a pesquisas ou perguntas clínicas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agilent SureSelectXT</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G9611A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AVENIO Millisect Fill Station</td>
			<td>Roche</td>
			<td>8106533001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AVENIO Millisect Instrument, Base</td>
			<td>Roche</td>
			<td>8106568001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AVENIO Millisect Instrument, Head</td>
			<td>Roche</td>
			<td>8106550001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AVENIO Millisect Milling Tips Small</td>
			<td>Roche</td>
			<td>8106509001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AVENIO Millisect PC</td>
			<td>Roche</td>
			<td>8106495001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioAnalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5427R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620700</td>
			<td>Micro-centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubation Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>D920D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Autostainer XL</td>
			<td>Leica</td>
			<td>ST5010</td>
			<td>Automated stainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Grade Mineral Oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5904-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V302B</td>
			<td>Digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen AllPrep DNA/RNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RLT Plus buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus positively charged microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>6776214</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated dissection protocol for tumor enrichment in low tumor content tissues

O enriquecimento tumoral em tecidos de baixo teor de tumores, aqueles abaixo de 20% do conteúdo tumoral dependendo do método, é necessário para gerar dados de qualidade reprodutivelmente com muitos ensaios a jusante, como o sequenciamento de próxima geração. A dissecção automatizada de tecidos é uma nova metodologia que automatiza e melhora o enriquecimento tumoral nesses tecidos comuns e de baixo teor de conteúdo tumoral, diminuindo a imprecisão dependente do usuário das limitações tradicionais de macrodiscção e tempo, custo e experiência da microdisseção de captura a laser usando sobreposição de anotação de imagem digital em slides não manchados. Aqui, as anotações de hematoxilina digital e eosina (H&E) são usadas para atingir pequenas áreas tumorais usando uma lâmina de 250 μmde diâmetro em parafina fixa de formalina não manchada incorporada (FFPE) ou seções congeladas frescas de até 20 μm de espessura para enriquecimento automatizado de tumores antes da extração de ácido nucleico e sequenciamento de exomatos inteiro (WES). A dissecção automatizada pode colher regiões anotadas em tecidos de baixo teor de tumores de seções únicas ou múltiplas para extração de ácido nucleico. Ele também permite a captura de extensas métricas de coleta pré e pós-colheita, melhorando a precisão, a reprodutibilidade e aumentando o throughput com a utilização de menos slides. O protocolo descrito permite a anotação digital com dissecção automatizada em FFPE animal e/ou humano ou tecidos congelados frescos com baixo teor de tumor e também pode ser usado para qualquer região de enriquecimento de interesse para aumentar a adequação para aplicações de sequenciamento a jusante em fluxos de trabalho clínicos ou de pesquisa.

Foram selecionadas seções de fígado de camundongos FFPE e FF contendo câncer colorretal metastático em xenoenxertos. As seções foram manchadas de H&E (Figura 1A,E,I) e digitalizadas em um imager de slides inteiro a ampliação de 20x. Um patologista anotou digitalmente regiões tumorais de interesse e uma máscara foi gerada usando software comercial e formatada como uma imagem de referência png digital (Figura 1B,F,J). ...

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Automated Dissection Protocol for Tumor Enrichment in Low Tumor Content Tissues

A anotação digital com dissecção automatizada de tecidos fornece uma abordagem inovadora para enriquecer tumores em casos de baixo teor de tumor e é adaptável tanto parafina quanto para tipos de tecido congelado. O fluxo de trabalho descrito melhora a precisão, a reprodutibilidade e o throughput e pode ser aplicado tanto em pesquisas quanto em configurações clínicas.

Protocolo automatizado de dissecção para enriquecimento de tumores em tecidos de baixo teor de tumores

Tumor enrichment in low tumor content tissues, those below 20% tumor content depending on the method, is required to generate quality data reproducibly ...

O isolamento ou enriquecimento de pequenas regiões dispersas de interesse da FFPE, ou material congelado fresco, pode ser alcançado com dissecção automatizada de forma mais rápida e eficiente do que com os métodos tradicionais. A extração de material genômico da FFPE, ou tecido congelado fresco, é um requisito para muitos laboratórios de pesquisa clínica e translacional. A dissecção automatizada preenche uma lacuna significativa entre a dissecção macro e a micro dissecção de captura a laser.Para começar, anote as imagens de slides digitalizadas para as regiões de interesse do tumor, usando uma plataforma de visualização fornecida pelo fornecedor ou um visualizador de código aberto. Coloque o deslizamento de tecido amostral não manchado no palco da primeira à quarta posição de slide ao usar uma referência de slide digital. Crie um trabalho de moagem usando o software automatizado de dissecção de tecido, abrindo a lista de empregos, selecione Criar novo emprego e digite o ID e o nome do caso para digitar o nome do trabalho.Vá para Espessura e selecione a espessura da seção usando a aba de seta para cima ou para baixo. Em seguida, vá para a preparação de tecidos, e selecione Parafinado, ou Desparaffinizado. Selecione Imagem de referência"Do arquivo e da imagem de importação.Em seguida, selecione o arquivo para importar do dropdown como referência digital. Escaneie o estágio selecionando o botão "Estágio Scan" no canto inferior direito para capturar cada deslizamento de tecido amostral na primeira e quarta posição. Para a referência no palco, arraste a caixa para criar uma área retangular sobre o tecido e selecione a bolha circular sob a área retangular para capturar a imagem de referência do palco.Copie este campo retângulo nas lâminas restantes do tecido da amostra nas posições de segunda a quarta lâmina, selecionando a opção de cópia no canto superior direito da imagem de referência. Em seguida, alinhe e redimensione conforme necessário. Para a imagem de referência digital, sobreponha a imagem na área retangular selecionada.Em seguida, redimensione e alinhe a referência digital grosseiramente, em curso, zoom, para melhor combinar com o tamanho e a posição sobre o tecido amostral. Copie este campo retângulo nas lâminas restantes do tecido da amostra nas posições de segunda a quarta lâmina, selecionando a opção de cópia no canto superior direito da imagem de referência. Em seguida, alinhe e redimensione conforme necessário.Selecione o botão "Digitalizar" no canto inferior direito para mover-se para a etapa de ajuste fino. Selecione a posição do primeiro estágio e o ícone da ferramenta Transformar na barra de ferramentas da mão direita, para fazer ajustes finos de alinhamento e zoom da referência para melhor corresponder à sobreposição do slide da amostra. Use a referência para amostrar barra deslizante na parte inferior da tela, toggling entre as imagens de referência e amostra.E o recurso de zoom e zoom para ajustar e alcançar o alinhamento de cada posição de slides. Uma vez alcançada a sobreposição de amostra ideal, desenhe as designações do caminho de fresagem na porção colorida da imagem de referência mascarada, selecionando o ícone da ferramenta de seletor de cores na barra de ferramentas da mão direita. Desenhe os caminhos de fresagem para os slides de amostra selecionando o botão Obter anotações no canto inferior direito da tela.Capture e colete a região anotada de interesse com quatro ou menos dicas de fresagem quando o caminho de fresagem é calculado. O uso da ponta de fresagem no canto superior esquerdo é calculado com base na área coberta, e o tamanho da ponta selecionado. O tamanho da ponta pode ser alterado sob a seta de ponta de fresagem, e o uso da ponta será recalculado.Quando o caminho de fresar for selecionado na primeira posição de deslizamento, ele será copiado nas posições restantes do slide. Selecione o botão "Configuração" no canto inferior direito da tela para o carregamento imediato das pontas de fresagem dos tubos de coleta em sua designação adequada no palco. Encha o reservatório com três mililitros de tampão de dissecção apropriado para o tipo de tecido, e para extração de ácido nucleico a jusante.Em seguida, selecione o botão Disseco"no canto inferior direito da tela. Após a dissecção automatizada, remova os tubos de coleta e os slides de amostra dissecados do estágio. Coloque os tubos de coleta no rack do tubo e os slides no rack de slides.A formalina manchada de H&E, parafina fixa embutida e seções frescas de fígado de rato congelado contendo câncer colorretal metastático em xenoenxertos foram escaneados em um inteiro imager de slides em 20x de ampliação, e usado como slides de referência. Os slides de referência manchados de H&E foram anotados e digitalmente mascarados para regiões tumorais para dissecção e extração de ácido nucleico. Os slides amostrais pós-dissecados foram manchados por H&E para confirmar as áreas de dissecção em slides de 10 micrômetros e 20 micrômetros.Métricas capturadas demonstraram o sucesso da dissecção automatizada e extração de ácido nucleico. Ao tentar este protocolo, tenha em mente que alcançar uma sobreposição relativamente precisa de anotação sobre os slides não manchados é importante para isolar áreas de interesse.

Research

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o<em&gt; Drosophila</em&gt; Imaginal Modelo Disc Tumor: visualização e quantificação da expressão gênica e invasão tumoral Usando Mosaicos Genéticos

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