Name: automated dissection protocol for tumor enrichment in low tumor content tissues
Uploaded: 2021-03-29T14:00:00
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Los autores desean agradecer a Carmina Espiritu y Robin E. Taylor por su apoyo en el desarrollo de la disección automatizada, así como al personal del Genentech Pathology Core Laboratory que apoyó este trabajo.

Antes del inicio, obtenga muestras de tejido apropiadas de acuerdo con los protocolos de la Junta de Revisión Institucional (IRB). Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de Genentech, Inc.
1. Preparación de tejidos y diapositivas
<ol><li>Seleccione FFPE o bloques de tejido fresco congelado y utilice el método de procesamiento correspondiente a continuación.</li>
	<li>Corte secciones de bloques de tejido en p...

<ol>
	<li>Cho, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+recommendations+for+precision+cancer+therapy+using+next+generation+sequencing:+a+comprehensive+single+cancer+center's+experiences.">Tissue recommendations for precision cancer therapy using next generation sequencing: a comprehensive single cancer center's experiences.</a> Oncotarget. 8 (26), 42478-42486 (2017).</li><li>Smits, A. J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+estimation+of+tumor+cell+percentage+for+molecular+testing+by+pathologists+is+not+accurate.">The estimation of tumor cell percentage for molecular testing by pathologists is not accurate.</a> Modern Pathology: An Official Journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 27 (2), 168-174 (2014).</li><li>Poole-Wilson, P. A., Langer, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+on+ionic+exchange+and+function+in+rat+and+rabbit+myocardium.">Effect of pH on ionic exchange and function in rat and rabbit myocardium.</a> The American Journal of Physiology. 229 (3), 570-581 (1975).</li><li>Viray, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+prospective,+multi-institutional+diagnostic+trial+to+determine+pathologist+accuracy+in+estimation+of+percentage+of+malignant+cells.">A prospective, multi-institutional diagnostic trial to determine pathologist accuracy in estimation of percentage of malignant cells.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 137 (11), 1545-1549 (2013).</li><li>El-Serag, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+in+Barrett's+Esophagus:+Laser+capture+versus+whole+tissue.">Gene Expression in Barrett's Esophagus: Laser capture versus whole tissue.</a> Scandinavian Journal of Gastroenterology. 44 (7), 787-795 (2009).</li><li>Harrell, J. C., Dye, W. W., Harvell, D. M. E., Sartorius, C. A., Horwitz, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contaminating+cells+alter+gene+signatures+in+whole+organ+versus+laser+capture+microdissected+tumors:+a+comparison+of+experimental+breast+cancers+and+their+lymph+node+metastases.">Contaminating cells alter gene signatures in whole organ versus laser capture microdissected tumors: a comparison of experimental breast cancers and their lymph node metastases.</a> Clinical &amp; Experimental Metastasis. 25 (1), 81-88 (2008).</li><li>Kim, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinctions+in+gastric+cancer+gene+expression+signatures+derived+from+laser+capture+microdissection+versus+histologic+macrodissection.">Distinctions in gastric cancer gene expression signatures derived from laser capture microdissection versus histologic macrodissection.</a> BMC Medical Genomics. 4, 48 (2011).</li><li>Klee, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+sample+acquisition+and+linear+amplification+on+gene+expression+profiling+of+lung+adenocarcinoma:+laser+capture+micro-dissection+cell-sampling+versus+bulk+tissue-sampling.">Impact of sample acquisition and linear amplification on gene expression profiling of lung adenocarcinoma: laser capture micro-dissection cell-sampling versus bulk tissue-sampling.</a> BMC Medical Genomics. 2, 13 (2009).</li><li>Civita, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+and+RNA-seq+analysis:+High+sensitivity+approaches+to+explain+histopathological+heterogeneity+in+human+glioblastoma+FFPE+archived+tissues.">Laser capture microdissection and RNA-seq analysis: High sensitivity approaches to explain histopathological heterogeneity in human glioblastoma FFPE archived tissues.</a> Frontiers in Oncology. 9, 482 (2019).</li><li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection.">Laser capture microdissection.</a> Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).</li><li>Bonner, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection:+molecular+analysis+of+tissue.">Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue.</a> Science. 278 (5342), 1481-1483 (1997).</li><li>Hunt, J. L., Finkelstein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdissection+techniques+for+molecular+testing+in+surgical+pathology.">Microdissection techniques for molecular testing in surgical pathology.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 128 (12), 1372-1378 (2004).</li><li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection.">Laser-capture microdissection.</a> Nature Protocols. 1, 586-603 (2006).</li><li>Grafen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+expression-based+microdissection+of+formalin-fixed+lung+cancer+tissue.">Optimized expression-based microdissection of formalin-fixed lung cancer tissue.</a> Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 97 (7), 863-872 (2017).</li><li>Javey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=innovative+tumor+tissue+dissection+tool+for+molecular+oncology+diagnostics.">innovative tumor tissue dissection tool for molecular oncology diagnostics.</a> The Journal of Molecular Diagnnostics: JMD. (21), 1525-1578 (2021).</li><li>Adey, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mill+based+instrument+and+software+system+for+dissecting+slide-mounted+tissue+that+provides+digital+guidance+and+documentation.">A mill based instrument and software system for dissecting slide-mounted tissue that provides digital guidance and documentation.</a> BMC Clinical Pathology. 13 (1), 29 (2013).</li></ol>

Aquí se presenta un protocolo para la aplicación de anotación digital y disección automatizada para diseccionar regiones tumorales de FFPE de bajo contenido tumoral o tejidos frescos congelados para el enriquecimiento tumoral y su uso en WES. La combinación de anotación digital y creación de máscaras con disección automatizada reduce significativamente el tiempo práctico y la experiencia requeridos comunes a los métodos clásicos de enriquecimiento tumoral, incluida la macrodisección manual y la LCM. El proto...

La secuenciación de próxima generación (NGS) se utiliza cada vez más tanto para la atención del paciente como en la investigación del cáncer para ayudar a guiar los tratamientos y facilitar el descubrimiento científico. El tejido a menudo es limitado y se usan muestras pequeñas con contenido tumoral variable de forma rutinaria. La adecuación y la integridad del tumor, por lo tanto, siguen siendo una barrera para obtener datos significativos. Las muestras con porcentajes tumorales más bajos pueden causar dificultad para distinguir las variantes verdaderas de los artefactos de secuenciación y, a menudo, no son elegibles para NGS1. Se ha demostrado que el enriquecimiento tumoral de casos de bajo contenido tumoral, aquellos por debajo del 20%, ayuda a producir material suficiente para generar datos de secuenciación reproducibles y garantizar que no se pierdan variantes de baja frecuencia 2,3. Sin embargo, los límites variarán dependiendo de las plataformas utilizadas y el uso planificado de los datos generados.
Tradicionalmente, el enriquecimiento de las regiones tumorales para la extracción se realiza mediante macrodisección manual o microdisección de captura láser (LCM) de portaobjetos incrustados de parafina fija de formalina (FFPE). La macrodisección manual, o raspado de áreas de tejido especificadas de diapositivas, permite extirpar regiones tumorales para su uso en ensayos posteriores con un costo relativamente bajo, pero con baja precisión y baja precisión 2,4. La precisión técnica mínima puede ser muy efectiva con casos de mayor contenido tumoral donde grandes franjas de tumor están presentes y / o la pérdida mínima de tejido no afecta significativamente los resultados, pero los casos de bajo contenido tumoral o los casos con tumores más dispersos requieren una mayor precisión. Por lo tanto, LCM se inventó en la década de 1990 y se convirtió en una forma valiosa de eliminar con precisión regiones pequeñas, definidas y microscópicas de tejido de las diapositivas de parafina fija incrustada en formalina (FFPE) 5,6,7,8. LCM se puede utilizar para recolectar poblaciones de células individuales cuando existe heterogeneidad compleja de la muestra9 que permite la recolección de poblaciones celulares previamente difíciles de separar. Sin embargo, LCM requiere maquinaria costosa que requiere una amplia experiencia técnica y tiempo práctico 10,11,12,13,14.
El instrumento utilizado para la disección automatizada de tejidos tiene una precisión entre la de LCM (~10 μm) y las macrodiseecciones (~1 mm)15. Además, exhibe requisitos de costo y experiencia técnica entre el de macrodisección y LCM y está diseñado para realizar un enriquecimiento rápido de tejidos a partir de diapositivas FFPE secuenciales para aliviar las desventajas de los métodos anteriores15. La disección automatizada de esta manera utiliza anotaciones digitales o superposiciones de imágenes de referencia de diapositivas en el escenario en diapositivas de tejido no teñidas en serie para diseccionar y enriquecer las regiones de interés. El instrumento utiliza puntas de fresado de cuchillas giratorias de plástico, tubos de recolección de 1,5 ml y se puede utilizar con una serie de fluidos diferentes para la disección para recolectar regiones de interés para ensayos aguas abajo, incluida la extracción y secuenciación nucleica. La punta de fresado de plástico giratorio utiliza depósitos de barril de jeringa internos y externos y un émbolo para recolectar tampón, luego muele y recolecta tejido16. El diámetro variable del tamaño de la punta de fresado (250 μm, 525 μm, 725 μm) puede permitir la disección de áreas de tejido separadas para la comparación, regiones multifocales que se pueden agrupar o áreas pequeñas individuales de portaobjetos FFPE individuales o múltiples. Los espesores de sección utilizados para la cosecha se pueden ajustar en función de las necesidades individuales del experimento y los usuarios pueden asegurarse de que las regiones de interés no se hayan agotado realizando un H&E adicional en una sección en serie inmediatamente después de la última sección utilizada para la cosecha.
La disección automatizada se identificó como una forma de enriquecer el contenido tumoral en casos de bajo contenido tumoral y probamos y ampliamos la funcionalidad prevista de un instrumento automatizado de disección de tejidos, que actualmente se comercializa para su uso en muestras clínicas FFPE de hasta 10 μm de espesor. El trabajo muestra que la disección automatizada se puede aplicar tanto a FFPE como a secciones de tejido humano o animal fresco congelado de hasta 20 μm de espesor con fines de investigación. El protocolo también demuestra un enfoque para anotar digitalmente y automatizar la disección para el enriquecimiento tumoral en tejidos con bajo contenido tumoral y / o casos con tumor anidado y disperso donde la macrodisección significativa es desafiante o no factible y muestra tanto la calidad como el rendimiento del ácido nucleico suficiente para NGS. Por lo tanto, la disección automatizada puede proporcionar precisión de nivel medio y un mayor rendimiento para el enriquecimiento tumoral y también podría aplicarse para enriquecer otras regiones de interés o combinarse con otras plataformas para responder preguntas clínicas o de investigación.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agilent SureSelectXT</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G9611A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AVENIO Millisect Fill Station</td>
			<td>Roche</td>
			<td>8106533001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AVENIO Millisect Instrument, Base</td>
			<td>Roche</td>
			<td>8106568001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AVENIO Millisect Instrument, Head</td>
			<td>Roche</td>
			<td>8106550001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AVENIO Millisect Milling Tips Small</td>
			<td>Roche</td>
			<td>8106509001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AVENIO Millisect PC</td>
			<td>Roche</td>
			<td>8106495001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioAnalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5427R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620700</td>
			<td>Micro-centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubation Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>D920D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Autostainer XL</td>
			<td>Leica</td>
			<td>ST5010</td>
			<td>Automated stainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Grade Mineral Oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5904-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V302B</td>
			<td>Digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen AllPrep DNA/RNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RLT Plus buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus positively charged microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>6776214</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated dissection protocol for tumor enrichment in low tumor content tissues

El enriquecimiento tumoral en tejidos de bajo contenido tumoral, aquellos por debajo del 20% de contenido tumoral dependiendo del método, es necesario para generar datos de calidad de manera reproducible con muchos ensayos posteriores, como la secuenciación de próxima generación. La disección automatizada de tejidos es una nueva metodología que automatiza y mejora el enriquecimiento tumoral en estos tejidos comunes y de bajo contenido tumoral al disminuir la imprecisión dependiente del usuario de la macrodisección tradicional y las limitaciones de tiempo, costo y experiencia de la microdisección de captura láser mediante el uso de superposición de anotación de imagen digital en diapositivas no teñidas. Aquí, las anotaciones digitales de hematoxilina y eosina (H&E) se utilizan para dirigirse a áreas tumorales pequeñas utilizando una cuchilla de 250 μm2 de diámetro en parafina fija de formalina no teñida incrustada (FFPE) o secciones frescas congeladas de hasta 20 μm de espesor para el enriquecimiento automatizado del tumor antes de la extracción de ácido nucleico y la secuenciación del exoma completo (WES). La disección automatizada puede cosechar regiones anotadas en tejidos de bajo contenido tumoral de secciones únicas o múltiples para la extracción de ácido nucleico. También permite la captura de extensas métricas de recolección antes y después de la cosecha, al tiempo que mejora la precisión, la reproducibilidad y aumenta el rendimiento con la utilización de menos diapositivas. El protocolo descrito permite la anotación digital con disección automatizada en FFPE animal y /o humano o tejidos frescos congelados con bajo contenido tumoral y también podría usarse para cualquier región de enriquecimiento de interés para aumentar la adecuación de las aplicaciones de secuenciación posterior en flujos de trabajo clínicos o de investigación.

Se seleccionaron las secciones hepáticas de ratón FFPE y FF que contenían cáncer colorrectal metastásico en xenoinjertos. Las secciones fueron teñidas de H&E (Figura 1A, E, I) y escaneadas en un generador de imágenes de diapositivas completa con un aumento de 20x. Un patólogo anotó digitalmente las regiones tumorales de interés y se generó una máscara utilizando software comercial y se formateó como una imagen de referencia png digital (Figu...

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Automated Dissection Protocol for Tumor Enrichment in Low Tumor Content Tissues

La anotación digital con disección automatizada de tejidos proporciona un enfoque innovador para enriquecer el tumor en casos de bajo contenido tumoral y es adaptable tanto a la parafina como a los tipos de tejido congelado. El flujo de trabajo descrito mejora la precisión, la reproducibilidad y el rendimiento y podría aplicarse tanto a la investigación como a los entornos clínicos.

Protocolo de disección automatizado para el enriquecimiento tumoral en tejidos de bajo contenido tumoral

Tumor enrichment in low tumor content tissues, those below 20% tumor content depending on the method, is required to generate quality data reproducibly ...

El aislamiento o enriquecimiento de pequeñas regiones dispersas de interés a partir de FFPE, o material fresco congelado, se puede lograr con disección automatizada de manera más rápida y eficiente que con los métodos tradicionales. La extracción de material genómico de FFPE, o tejido fresco congelado, es un requisito para muchos laboratorios de investigación clínica y traslacional. La disección automatizada llena un vacío significativo entre la macrodisección y la microdisección de captura láser.Para comenzar, anote las imágenes de diapositivas escaneadas para las regiones tumorales de interés, utilizando una plataforma de visualización proporcionada por el proveedor o un visor de código abierto. Coloque el portaobjetos de tejido de muestra no teñido en el escenario en la primera a la cuarta posición de la diapositiva cuando utilice una referencia de diapositiva digital. Cree un trabajo de fresado utilizando el software de disección automatizada de tejidos abriendo la lista de trabajos, luego seleccione Crear nuevo trabajo e ingrese el ID de caso y el nombre para ingresar el nombre del trabajo.Vaya a Grosor y seleccione grosor de sección con la pestaña de flecha hacia arriba o hacia abajo. Luego, vaya a Preparación de tejidos y seleccione Parafinado o Desparafinado. Seleccione Imagen de referencia"Desde archivo e Importar imagen.A continuación, seleccione el archivo que desea importar desde el menú desplegable como referencia digital. Escanee el escenario seleccionando el botón "Etapa de escaneo" en la esquina inferior derecha para capturar cada diapositiva de tejido de muestra en la primera a la cuarta posición. Para la referencia en el escenario, arrastre el cuadro para crear un área rectangular sobre el tejido y seleccione la burbuja circular debajo del área rectangular para capturar la imagen de referencia del escenario.Copie este campo rectangular en las diapositivas de tejido de muestra restantes en las posiciones de la segunda a la cuarta diapositiva seleccionando la opción de copia en la esquina superior derecha de la imagen de referencia. Luego, alinee y cambie el tamaño según sea necesario. Para la imagen de referencia digital, superponga la imagen en el área rectangular seleccionada.Luego, cambie el tamaño y alinee la referencia digital bruscamente, en curso, haga zoom, para que coincida mejor con el tamaño y la posición sobre el tejido de la muestra. Copie este campo rectangular en las diapositivas de tejido de muestra restantes en las posiciones de la segunda a la cuarta diapositiva seleccionando la opción de copia en la esquina superior derecha de la imagen de referencia. Luego, alinee y cambie el tamaño según sea necesario.Seleccione el botón "Etapa de escaneo" en la esquina inferior derecha para pasar al paso de ajuste fino. Seleccione la posición de la primera etapa y el icono de la herramienta Transformar en la barra de herramientas de la derecha para realizar ajustes finos de alineación y zoom de la referencia para que coincida mejor con la superposición de diapositivas de muestra. Utilice la referencia a la barra deslizante de muestra en la parte inferior de la pantalla, alternando entre la referencia y las imágenes de muestra.Y la función de acercar y alejar para ajustar y lograr la alineación de cada posición de la diapositiva. Una vez que se logre la superposición de muestra óptima, dibuje las designaciones de la ruta de fresado en la parte coloreada de la imagen de referencia enmascarada seleccionando el icono de la herramienta selector de color en la barra de herramientas de la derecha. Dibuje los trazados de fresado en las diapositivas de muestra seleccionando el botón Obtener anotaciones en la esquina inferior derecha de la pantalla.Capture y recoja la región anotada de interés con cuatro o menos puntas de fresado cuando se calcule la trayectoria de fresado. El uso de la punta de fresado en la esquina superior izquierda se calcula en función del área cubierta y el tamaño de la punta seleccionada. El tamaño de la punta se puede cambiar debajo de la flecha de la punta de fresado, y el uso de la punta se volverá a calcular.Cuando se selecciona el trazado de fresado en la primera posición de diapositiva, se copiará en las posiciones de deslizamiento restantes. Seleccione el botón "Etapa de configuración" en la esquina inferior derecha de la pantalla para cargar rápidamente las puntas de fresado de los tubos de recolección en su designación adecuada en el escenario. Llene el depósito con tres mililitros de tampón de disección apropiado para el tipo de tejido y para la extracción de ácido nucleico aguas abajo.Luego, seleccione el botón Diseccionar en la esquina inferior derecha de la pantalla. Después de la disección automatizada, retire los tubos de recolección y las diapositivas de muestra diseccionadas del escenario. Coloque los tubos de recogida en el bastidor de tubos y las correderas en el bastidor de diapositivas.La formalina teñida de H&E, la parafina fija incrustada y las secciones de hígado de ratón frescas congeladas que contienen cáncer colorrectal metastásico en xenoinjertos se escanearon en una imagen de diapositiva completa con un aumento de 20x, y se utilizaron como diapositivas de referencia. Las diapositivas de referencia teñidas de H&E fueron anotadas y enmascaradas digitalmente para las regiones tumorales para la disección y la extracción de ácido nucleico. Las diapositivas de muestra post-diseccionadas fueron teñidas por H&E para confirmar las áreas de disección en diapositivas de 10 micrómetros y 20 micrómetros.Las métricas capturadas demostraron el éxito de la disección automatizada y la extracción de ácidos nucleicos. Al intentar este protocolo, tenga en cuenta que lograr una superposición relativamente precisa de anotaciones en las diapositivas no manchadas es importante para aislar las áreas de interés.

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