Name: automated dissection protocol for tumor enrichment in low tumor content tissues
Uploaded: 2021-03-29T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Dissection Protocol for Tumor Enrichment in Low Tumor Content Tissues at JoVE.com

Yazarlar, Carmina Espiritu ve Robin E. Taylor'a otomatik diseksiyon geliştirmedeki destekleri ve bu çalışmayı destekleyen Genentech Patoloji Çekirdek Laboratuvarı personeline teşekkür eder.

Başlamadan önce, Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) protokollerine göre uygun doku örnekleri alın. Burada açıklanan tüm yöntemler, Genentech, Inc.'in Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Doku ve slayt hazırlama
<ol><li>FFPE veya taze dondurulmuş doku bloklarını seçin ve aşağıdaki ilgili işleme yöntemini kullanın.</li>
	<li>Doku bloğu bölümlerini pozitif yüklü cam slaytlar üzerine istenen kalınlıkta kesin. FFPE doku...

<ol>
	<li>Cho, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+recommendations+for+precision+cancer+therapy+using+next+generation+sequencing:+a+comprehensive+single+cancer+center's+experiences.">Tissue recommendations for precision cancer therapy using next generation sequencing: a comprehensive single cancer center's experiences.</a> Oncotarget. 8 (26), 42478-42486 (2017).</li><li>Smits, A. J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+estimation+of+tumor+cell+percentage+for+molecular+testing+by+pathologists+is+not+accurate.">The estimation of tumor cell percentage for molecular testing by pathologists is not accurate.</a> Modern Pathology: An Official Journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 27 (2), 168-174 (2014).</li><li>Poole-Wilson, P. A., Langer, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+on+ionic+exchange+and+function+in+rat+and+rabbit+myocardium.">Effect of pH on ionic exchange and function in rat and rabbit myocardium.</a> The American Journal of Physiology. 229 (3), 570-581 (1975).</li><li>Viray, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+prospective,+multi-institutional+diagnostic+trial+to+determine+pathologist+accuracy+in+estimation+of+percentage+of+malignant+cells.">A prospective, multi-institutional diagnostic trial to determine pathologist accuracy in estimation of percentage of malignant cells.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 137 (11), 1545-1549 (2013).</li><li>El-Serag, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression+in+Barrett's+Esophagus:+Laser+capture+versus+whole+tissue.">Gene Expression in Barrett's Esophagus: Laser capture versus whole tissue.</a> Scandinavian Journal of Gastroenterology. 44 (7), 787-795 (2009).</li><li>Harrell, J. C., Dye, W. W., Harvell, D. M. E., Sartorius, C. A., Horwitz, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contaminating+cells+alter+gene+signatures+in+whole+organ+versus+laser+capture+microdissected+tumors:+a+comparison+of+experimental+breast+cancers+and+their+lymph+node+metastases.">Contaminating cells alter gene signatures in whole organ versus laser capture microdissected tumors: a comparison of experimental breast cancers and their lymph node metastases.</a> Clinical &amp; Experimental Metastasis. 25 (1), 81-88 (2008).</li><li>Kim, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinctions+in+gastric+cancer+gene+expression+signatures+derived+from+laser+capture+microdissection+versus+histologic+macrodissection.">Distinctions in gastric cancer gene expression signatures derived from laser capture microdissection versus histologic macrodissection.</a> BMC Medical Genomics. 4, 48 (2011).</li><li>Klee, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+sample+acquisition+and+linear+amplification+on+gene+expression+profiling+of+lung+adenocarcinoma:+laser+capture+micro-dissection+cell-sampling+versus+bulk+tissue-sampling.">Impact of sample acquisition and linear amplification on gene expression profiling of lung adenocarcinoma: laser capture micro-dissection cell-sampling versus bulk tissue-sampling.</a> BMC Medical Genomics. 2, 13 (2009).</li><li>Civita, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+and+RNA-seq+analysis:+High+sensitivity+approaches+to+explain+histopathological+heterogeneity+in+human+glioblastoma+FFPE+archived+tissues.">Laser capture microdissection and RNA-seq analysis: High sensitivity approaches to explain histopathological heterogeneity in human glioblastoma FFPE archived tissues.</a> Frontiers in Oncology. 9, 482 (2019).</li><li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection.">Laser capture microdissection.</a> Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).</li><li>Bonner, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection:+molecular+analysis+of+tissue.">Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue.</a> Science. 278 (5342), 1481-1483 (1997).</li><li>Hunt, J. L., Finkelstein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdissection+techniques+for+molecular+testing+in+surgical+pathology.">Microdissection techniques for molecular testing in surgical pathology.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 128 (12), 1372-1378 (2004).</li><li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection.">Laser-capture microdissection.</a> Nature Protocols. 1, 586-603 (2006).</li><li>Grafen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+expression-based+microdissection+of+formalin-fixed+lung+cancer+tissue.">Optimized expression-based microdissection of formalin-fixed lung cancer tissue.</a> Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 97 (7), 863-872 (2017).</li><li>Javey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=innovative+tumor+tissue+dissection+tool+for+molecular+oncology+diagnostics.">innovative tumor tissue dissection tool for molecular oncology diagnostics.</a> The Journal of Molecular Diagnnostics: JMD. (21), 1525-1578 (2021).</li><li>Adey, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mill+based+instrument+and+software+system+for+dissecting+slide-mounted+tissue+that+provides+digital+guidance+and+documentation.">A mill based instrument and software system for dissecting slide-mounted tissue that provides digital guidance and documentation.</a> BMC Clinical Pathology. 13 (1), 29 (2013).</li></ol>

Burada, tümör zenginleştirme ve WES'de kullanım için düşük tümör içerikli FFPE veya taze dondurulmuş dokulardan tümör bölgelerini diseke etmek için dijital ek açıklama ve otomatik diseksiyon uygulaması için bir protokol sunulmaktadır. Dijital ek açıklama ve maske oluşturmayı otomatik diseksiyonla birleştirmek, manuel makrodiseksiyon ve LCM dahil olmak üzere klasik tümör zenginleştirme yöntemlerinde yaygın olan gerekli uygulamalı zamanı ve uzmanlığı önemli ölçüde azaltır. Protokol...

Yeni nesil dizileme (NGS), tedavileri yönlendirmeye ve bilimsel keşfi kolaylaştırmaya yardımcı olmak için hem hasta bakımı hem de kanser araştırmalarında giderek daha fazla kullanılmaktadır. Doku genellikle sınırlıdır ve değişken tümör içeriğine sahip küçük örnekler rutin olarak kullanılır. Bu nedenle, tümör yeterliliği ve bütünlüğü, anlamlı veriler elde etmenin önünde bir engel olmaya devam etmektedir. Daha düşük tümör yüzdelerine sahip örnekler, gerçek varyantları dizileme artefaktlarından ayırt etmede zorluğa neden olabilir ve genellikle NGS 1 için uygundeğildir. Düşük tümör içerikli vakaların tümör zenginleştirilmesinin, %20'nin altındakilerin, tekrarlanabilir dizileme verileri üretmek ve düşük frekanslı varyantların kaçırılmamasını sağlamak için yeterli materyal elde edilmesine yardımcı olduğu gösterilmiştir 2,3. Bununla birlikte, sınırlar kullanılan platformlara ve üretilen verilerin planlanan kullanımına bağlı olarak değişecektir.
Geleneksel olarak, ekstraksiyon için tümör bölgelerinin zenginleştirilmesi, formalin sabit parafin gömülü (FFPE) slaytların manuel makrodiseksiyonu veya lazer yakalama mikrodiseksiyonu (LCM) ile gerçekleştirilir. Manuel makrodiseksiyon veya slaytlardan belirli doku alanlarının kazınması, tümör bölgelerinin aşağı akış tahlillerinde kullanılmak üzere nispeten düşük maliyetli, ancak düşük doğruluk ve düşük hassasiyetle çıkarılmasına izin verir 2,4. Minimal teknik doğruluk, büyük tümör alanlarının bulunduğu ve / veya minimal doku kaybının sonuçları önemli ölçüde etkilemediği daha yüksek tümör içerikli vakalarda çok etkili olabilir, ancak düşük tümör içerikli vakalar veya daha dağınık tümörlü vakalar daha fazla hassasiyet gerektirir. LCM bu nedenle 1990'larda icat edildi ve formalin sabit parafin gömülü (FFPE) slaytlar 5,6,7,8'den dokunun küçük, tanımlanmış, mikroskobik bölgelerini hassas bir şekilde çıkarmak için değerli bir yol haline geldi. LCM, numunenin karmaşık heterojenliği mevcut olduğunda tek hücreli popülasyonları toplamak için kullanılabilir9, daha önce ayrılması zor hücre popülasyonlarının toplanmasına izin verir. Ancak LCM, kapsamlı teknik uzmanlık ve uygulamalı zaman gerektiren maliyetli makineler gerektirir10,11,12,13,14.
Otomatik doku diseksiyonu için kullanılan cihaz, LCM (~10 μm) ile makrodiseksiyonlar (~1 mm)15 arasında hassasiyete sahiptir. Ek olarak, makrodiseksiyon ve LCM arasında hem maliyet hem de teknik uzmanlık gereksinimleri sergiler ve önceki yöntemlerin dezavantajlarını hafifletmek için sıralı FFPE slaytlarından hızlı doku zenginleştirme gerçekleştirmek üzere tasarlanmıştır15. Bu şekilde otomatik diseksiyon, ilgilenilen bölgeleri diseke etmek ve zenginleştirmek için seri olarak kesitlenmiş lekesiz doku slaytları üzerine dijital ek açıklamalar veya sahnede slayt referans görüntüsü kaplamaları kullanır. Cihaz, plastik eğirme bıçağı frezeleme uçları, 1,5 mL toplama boruları kullanır ve nükleik ekstraksiyon ve dizileme dahil olmak üzere aşağı akış analizleri için ilgi çekici bölgeleri toplamak üzere diseksiyon için bir dizi farklı sıvı ile birlikte kullanılabilir. İplik plastik frezeleme ucu, tampon toplamak için iç ve dış şırınga namlu rezervuarları ve bir piston kullanır, ardından doku16'yı frezeler ve toplar. Değişken frezeleme ucu boyutu çapı (250 μm, 525 μm, 725 μm), karşılaştırma için ayrı doku alanlarının, havuzlanabilen çok odaklı bölgelerin veya tek veya çoklu FFPE kızaklarından ayrı küçük alanların diseksiyonuna izin verebilir. Hasat için kullanılan kesit kalınlıkları, bireysel deney ihtiyaçlarına göre ayarlanabilir ve kullanıcılar, hasat için kullanılan son bölümden hemen sonra bir seri bölüm üzerinde ek bir H&E gerçekleştirerek ilgili bölgelerin tükenmemesini sağlayabilir.
Otomatik diseksiyon, düşük tümör içerikli vakalarda tümör içeriğini zenginleştirmenin bir yolu olarak tanımlandı ve şu anda 10 μm kalınlığa kadar FFPE klinik örneklerinde kullanılmak üzere pazarlanan otomatik bir doku diseksiyon cihazının amaçlanan işlevselliğini test ettik ve genişlettik. Çalışma, otomatik diseksiyonun araştırma amacıyla hem FFPE hem de taze dondurulmuş insan veya hayvan dokusu kesitlerine 20 μm kalınlığa kadar uygulanabileceğini göstermektedir. Protokol ayrıca, düşük tümör içeriğine sahip dokularda ve / veya anlamlı makrodiseksiyonun zor olduğu veya mümkün olmadığı iç içe geçmiş, dağınık tümörlü vakalarda tümör zenginleştirme için diseksiyonu dijital olarak açıklama ekleme ve otomatikleştirme yaklaşımını göstermektedir ve NGS için yeterli nükleik asidin hem kalitesini hem de verimini göstermektedir. Bu nedenle otomatik diseksiyon, tümör zenginleştirme için orta düzeyde hassasiyet ve daha fazla verim sağlayabilir ve ayrıca diğer ilgi alanlarını zenginleştirmek için uygulanabilir veya araştırma veya klinik soruları cevaplamak için diğer platformlarla birleştirilebilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agilent SureSelectXT</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G9611A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AVENIO Millisect Fill Station</td>
			<td>Roche</td>
			<td>8106533001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AVENIO Millisect Instrument, Base</td>
			<td>Roche</td>
			<td>8106568001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AVENIO Millisect Instrument, Head</td>
			<td>Roche</td>
			<td>8106550001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AVENIO Millisect Milling Tips Small</td>
			<td>Roche</td>
			<td>8106509001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AVENIO Millisect PC</td>
			<td>Roche</td>
			<td>8106495001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioAnalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5427R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620700</td>
			<td>Micro-centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubation Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>D920D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Autostainer XL</td>
			<td>Leica</td>
			<td>ST5010</td>
			<td>Automated stainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Grade Mineral Oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5904-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V302B</td>
			<td>Digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen AllPrep DNA/RNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RLT Plus buffer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus positively charged microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>6776214</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated dissection protocol for tumor enrichment in low tumor content tissues

Düşük tümör içerikli dokularda tümör zenginleştirme, yönteme bağlı olarak% 20 tümör içeriğinin altında olanlar, yeni nesil dizileme gibi birçok aşağı akış tahlili ile tekrarlanabilir şekilde kaliteli veriler üretmek için gereklidir. Otomatik doku diseksiyonu, lekesiz slaytlar üzerine dijital görüntü ek açıklama bindirmesi kullanarak geleneksel makro-diseksiyonun kullanıcıya bağlı kesinsizliğini ve lazer yakalama mikrodiseksiyonunun zaman, maliyet ve uzmanlık sınırlamalarını azaltarak bu yaygın, düşük tümör içerikli dokularda tümör zenginleştirmesini otomatikleştiren ve geliştiren yeni bir metodolojidir. Burada, dijital hematoksilin ve eozin (H & E) ek açıklamaları, nükleik asit ekstraksiyonu ve tüm ekzom dizilemesi (WES) öncesinde otomatik tümör zenginleştirmesi için boyanmamış formalin sabit parafin gömülü (FFPE) veya kalınlığı 20 μm'ye kadar taze dondurulmuş kesitlerde çapı 250μm olan bir bıçak kullanarak küçük tümör alanlarını hedeflemek için kullanılır. Otomatik diseksiyon, düşük tümör içerikli dokulardaki açıklamalı bölgeleri, nükleik asit ekstraksiyonu için tek veya çoklu bölümlerden toplayabilir. Ayrıca, kapsamlı hasat öncesi ve sonrası toplama ölçümlerinin yakalanmasına olanak tanırken, doğruluğu, tekrarlanabilirliği iyileştirir ve daha az slayt kullanarak verimi artırır. Açıklanan protokol, hayvan ve / veya insan FFPE'si veya düşük tümör içeriğine sahip taze dondurulmuş dokular üzerinde otomatik diseksiyon ile dijital ek açıklama sağlar ve ayrıca klinik veya araştırma iş akışlarında aşağı akış dizileme uygulamaları için yeterliliği artırmak için herhangi bir ilgi alanı zenginleştirme için kullanılabilir.

Ksenogreftlerde metastatik kolorektal kanser içeren FFPE ve FF fare karaciğer kesitleri seçildi. Kesitler H&E boyalıydı (Şekil 1A, E,I) ve 20x büyütmede bütün bir slayt görüntüleyicide tarandı. Bir patolog, ilgilenilen tümör bölgelerine dijital olarak açıklama ekledi ve ticari yazılım kullanılarak bir maske oluşturuldu ve dijital png referans görüntüsü olarak biçimlendirildi (Şekil 1B, F, J). Sahneye...

Watch this Scientific Journal Video about Automated Dissection Protocol for Tumor Enrichment in Low Tumor Content Tissues at JoVE.com

Automated Dissection Protocol for Tumor Enrichment in Low Tumor Content Tissues

Otomatik doku diseksiyonu ile dijital ek açıklama, düşük tümör içerikli vakalarda tümörü zenginleştirmek için yenilikçi bir yaklaşım sağlar ve hem parafin hem de dondurulmuş doku tiplerine uyarlanabilir. Açıklanan iş akışı doğruluğu, tekrarlanabilirliği ve verimi artırır ve hem araştırma hem de klinik ortamlara uygulanabilir.

Düşük Tümör İçeriği Dokularında Tümör Zenginleştirme için Otomatik Diseksiyon Protokolü

Tumor enrichment in low tumor content tissues, those below 20% tumor content depending on the method, is required to generate quality data reproducibly ...

FFPE'den veya taze dondurulmuş malzemeden küçük dağınık bölgelerin izolasyonu veya zenginleştirilmesi, otomatik diseksiyon ile geleneksel yöntemlerden daha hızlı ve verimli bir şekilde sağlanabilir. FFPE'den veya taze dondurulmuş dokudan genomik materyalin çıkarılması, birçok klinik ve translasyonel araştırma laboratuvarı için bir gerekliliktir. Otomatik diseksiyon, makro diseksiyon ve lazer yakalama mikro diseksiyonu arasındaki önemli bir boşluğu doldurur.Başlamak için, satıcı tarafından sağlanan bir görüntüleme platformu veya açık kaynaklı bir görüntüleyici kullanarak taranan slayt görüntülerine ilgilenilen tümör bölgeleri için açıklama ekleyin. Dijital slayt referansı kullanırken lekesiz numune dokusu slaytını birinci ila dördüncü slayt konumunda sahneye yerleştirin. İş listesi'ni açarak otomatik doku diseksiyonu yazılımını kullanarak bir frezeleme işi oluşturun, ardından Yeni iş oluştur'u seçin ve işin adını girmek için servis talebi kimliğini ve adını girin.Kalınlık'a gidin ve yukarı veya aşağı ok sekmesini kullanarak bölüm kalınlığını seçin. Ardından, Doku hazırlama'ya gidin ve Parafinize veya Deparafinize seçeneğini belirleyin. Referans görüntü"Dosyadan" seçeneğini belirleyin ve Görüntüyü içe aktar'ı seçin.Ardından, açılır menüden içe aktarılacak dosyayı dijital başvuru olarak seçin. Her örnek doku slaytını birinci ila dördüncü konumda yakalamak için sağ alt köşedeki "Tarama aşaması" düğmesini seçerek aşamayı tarayın. Sahne alanında başvuru için, doku üzerinde dikdörtgen bir alan oluşturmak üzere kutuyu sürükleyin ve sahne alanı referans görüntüsünü yakalamak için dikdörtgen alanın altındaki dairesel kabarcığı seçin.Bu dikdörtgen alanı, referans görüntünün sağ üst köşesindeki kopyala seçeneğini belirleyerek ikinci ila dördüncü slayt konumlarında kalan örnek doku slaytlarına kopyalayın. Ardından, gerektiği gibi hizalayın ve yeniden boyutlandırın. Dijital referans görüntüsü için, görüntüyü seçilen dikdörtgen alanın üzerine yerleştirin.Ardından, dijital referansı büyük ölçüde yeniden boyutlandırın ve hizalayın, tabii ki yakınlaştırın, böylece boyut ve numune dokusu üzerindeki konumla en iyi şekilde eşleşin. Bu dikdörtgen alanı, referans görüntünün sağ üst köşesindeki kopyala seçeneğini belirleyerek ikinci ila dördüncü slayt konumlarında kalan örnek doku slaytlarına kopyalayın. Ardından, gerektiği gibi hizalayın ve yeniden boyutlandırın.İnce ayar adımına geçmek için sağ alt köşedeki "Tarama aşaması" düğmesini seçin. Örnek slayt kaplamasıyla en iyi şekilde eşleşecek şekilde referansın ince hizalamasını ve yakınlaştırma ayarlarını yapmak için ilk aşama konumunu ve sağ araç çubuğundaki Dönüştürme aracı simgesini seçin. Referans ve örnek görüntüler arasında geçiş yaparak ekranın altındaki kayar çubuğu örneklemek için referansı kullanın.Ayrıca, her slayt konumunun hizalamasını ayarlamak ve elde etmek için yakınlaştırma ve uzaklaştırma özelliği. En uygun numune kaplaması elde edildikten sonra, sağ araç çubuğundaki renk seçici takım simgesini seçerek maskelenmiş referans görüntüsünün renkli kısmına frezeleme yolu atamalarını çizin. Ekranın sağ alt köşesindeki Ek açıklamaları al" düğmesini seçerek frezeleme yollarını örnek slaytların üzerine çizin.Frezeleme yolu hesaplanırken açıklamalı ilgili bölgeyi dört veya daha az frezeleme ucuyla yakalayın ve toplayın. Sol üst köşedeki frezeleme ucu kullanımı, kaplanan alana ve seçilen uç boyutuna göre hesaplanır. Uç boyutu frezeleme ucu oku altında değiştirilebilir ve uç kullanımı yeniden hesaplanır.Frezeleme yolu ilk kızak konumunda seçildiğinde, kalan kızak konumlarına kopyalanır. Frezeleme uçlarının toplama borularından sahnede doğru şekilde atanmış şekilde hızlı bir şekilde yüklenmesi için ekranın sağ alt köşesindeki Kurulum aşaması" düğmesini seçin. Rezervuarı, doku tipi ve aşağı akış nükleik asit ekstraksiyonu için üç mililitre uygun diseksiyon tamponu ile doldurun.Ardından, ekranın sağ alt köşesindeki "Dissect" düğmesini seçin. Otomatik diseksiyondan sonra, toplama tüplerini ve disseke edilmiş numune slaytlarını sahneden çıkarın. Toplama tüplerini tüp rafına, kızakları da sürgü rafına yerleştirin.H&E boyalı formalin, sabit parafin gömülü ve ksenogreftlerde metastatik kolorektal kanser içeren taze dondurulmuş fare karaciğeri bölümleri, 20x büyütmede bütün bir slayt görüntüleyicide tarandı ve referans slaytlar olarak kullanıldı. H&E boyalı referans slaytlarına diseksiyon ve nükleik asit ekstraksiyonu için tümör bölgeleri için açıklama eklendi ve dijital olarak maskelendi. Diseksiyon sonrası numune slaytları, diseksiyon alanlarını 10 mikrometre ve 20 mikrometre slaytlarında doğrulamak için H & E boyandı.Yakalanan metrikler, otomatik diseksiyon ve nükleik asit ekstraksiyonunun başarısını göstermiştir. Bu protokolü denerken, lekesiz slaytlara nispeten doğru bir ek açıklama bindirmesi elde etmenin ilgi alanlarını yalıtmak için önemli olduğunu unutmayın.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

<em&gt; Drosophila</em&gt; Hayali Disk Tümör Modeli: Genetik Mozaikler kullanma Gen İfade ve Tümör invazivliğinin Görselleştirme ve

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

A Murine Orthotopic Bladder Tumor Model and Tumor Detection System

Bir Fare Ortotopik Mesane Tümör Modeli ve Tümör Tespit Sistemi

This protocol describes the generation of bladder tumors in female C57BL/6J mice using the murine bladder cancer cell line MB49, which has been modified ...

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Hedef hücre ön zenginleştirme ve tüm genom amplifikasyon tek hücre aşağı akım karakterizasyonu için

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

Tümör hücre görselleştirme akciğer dokusu içinde dolaşan bir akciğer kolonizasyon tahlil kurulması

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

An Integrated Platform for Genome-wide Mapping of Chromatin States Using High-throughput ChIP-sequencing in Tumor Tissues

Yüksek işlem hacmi ChIP-sıralama tümör dokularda kullanarak genom geniş eşleme Kromatin devletler için entegre bir Platform

Histone modifications constitute a major component of the epigenome and play important regulatory roles in determining the transcriptional status of ...

Radionuclide-fluorescence Reporter Gene Imaging to Track Tumor Progression in Rodent Tumor Models

Kemirgen tümör modelleri ilerlemesinde tümör izlemek için Imaging radyonüklid Floresans muhabir gen

Metastasis is responsible for most cancer deaths. Despite extensive research, the mechanistic understanding of the complex processes governing metastasis ...

A Method to Define the Effects of Environmental Enrichment on Colon Microbiome Biodiversity in a Mouse Colon Tumor Model

Çevre zenginleştirme etkileri kolon Microbiome biyolojik çeşitliliğin bir fare kolon tümörü modeli tanımlamak için bir yöntem

Several recent studies have illustrated the beneficial effects of living in an enriched environment on improving human disease. In mice, environmental ...

Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors

Zenginleştirme ve kurulan subkutan fare tümör tümör bağışıklık ve Non-immün Microenvironments karakterizasyonu

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

Dijital polimeraz zincir reaksiyonu tahlil için tüp içinde çip biçimini kullanarak bir sporadik ailesel Adenomatous poliposis hastada genetik varyasyon

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

Paramyxoviruses for Tumor-targeted Immunomodulation: Design and Evaluation Ex Vivo

Paramyxovirusler Immunomodulation tümör hedefli için: tasarım ve değerlendirme Ex Vivo

Successful cancer immunotherapy has the potential to achieve long-term tumor control. Despite recent clinical successes, there remains an urgent need for ...