Name: 15n cpmg relaxation dispersion for the investigation of protein conformational dynamics on the &#181;s-ms timescale
Uploaded: 2021-04-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about 15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the Ã‚Âµs-ms Timescale at JoVE.com

وقد تم دعم هذا العمل بأموال من NIGMS R35GM133488 ومن صندوق روي ج. كارفر الخيري إلى V.V.

1. إعداد عينة NMR
<ol><li>التعبير عن وتنقية 2H،15N-labled عينة من البروتين من الفائدة. ملاحظة: في حين يمكن استخدام عينة بروتين 15N المسمى للحصول على تجربة CPMG RD، perdeuteration (حيثما أمكن) يزيد بشكل كبير من جودة البيانات التي تم الحصول عليها. بروتوكولات لإنتاج البروتينات perdeuterated متوفرة في ا...

<ol>
	<li>Anthis, N. J., Clore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+transient+dark+states+by+NMR+spectroscopy.">Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (1), 35-116 (2015).</li><li>Lisi, G. P., Loria, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+NMR+spectroscopy+for+the+study+of+enzyme+allostery.">Solution NMR spectroscopy for the study of enzyme allostery.</a> Chemical Reviews. 116 (11), 6323-6369 (2016).</li><li>Mittermaier, A., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+provide+new+insights+in+NMR+studies+of+protein+dynamics.">New tools provide new insights in NMR studies of protein dynamics.</a> Science. 312 (5771), 224-228 (2006).</li><li>Venditti, V., Clore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+selection+and+substrate+binding+regulate+the+monomer/dimer+equilibrium+of+the+C-terminal+domain+of+Escherichia+coli+enzyme+I.">Conformational selection and substrate binding regulate the monomer/dimer equilibrium of the C-terminal domain of Escherichia coli enzyme I.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 26989-26998 (2012).</li><li>Venditti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+interdomain+rearrangement+triggered+by+suppression+of+micro-+to+millisecond+dynamics+in+bacterial+Enzyme+I.">Large interdomain rearrangement triggered by suppression of micro- to millisecond dynamics in bacterial Enzyme I.</a> Nature Communications. 6, 5960 (2015).</li><li>Yip, G. N., Zuiderweg, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+cycle+scheme+that+significantly+suppresses+offset-dependent+artifacts+in+the+R2-CPMG+15N+relaxation+experiment.">A phase cycle scheme that significantly suppresses offset-dependent artifacts in the R2-CPMG 15N relaxation experiment.</a> Journal of Magnetic Resonance. 171 (1), 25-36 (2004).</li><li>Mulder, F. A., Skrynnikov, N. R., Hon, B., Dahlquist, F. W., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+slow+(micros-ms)+time+scale+dynamics+in+protein+side+chains+by+(15)N+relaxation+dispersion+NMR+spectroscopy:+application+to+Asn+and+Gln+residues+in+a+cavity+mutant+of+T4+lysozyme.">Measurement of slow (micros-ms) time scale dynamics in protein side chains by (15)N relaxation dispersion NMR spectroscopy: application to Asn and Gln residues in a cavity mutant of T4 lysozyme.</a> Journal of the American Chemical Society. 123 (5), 967-975 (2001).</li><li>Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+TROSY+CPMG+sequence+for+characterizing+chemical+exchange+in+large+proteins.">A TROSY CPMG sequence for characterizing chemical exchange in large proteins.</a> Journal of Biomolecular NMR. 15 (2), 151-155 (1999).</li><li>Dotas, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+thermophilic/mesophilic+enzymes+reveal+a+role+for+conformational+disorder+in+regulation+of+bacterial+Enzyme+I.">Hybrid thermophilic/mesophilic enzymes reveal a role for conformational disorder in regulation of bacterial Enzyme I.</a> Journal of Molecular Biology. 432 (16), 4481-4498 (2020).</li><li>Purslow, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+site+breathing+of+human+Alkbh5+revealed+by+solution+NMR+and+accelerated+molecular+dynamics.">Active site breathing of human Alkbh5 revealed by solution NMR and accelerated molecular dynamics.</a> Biophysical Journal. 115, 1895-1905 (2018).</li><li>Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+relaxation-compensated+Carr&#8722;Purcell&#8722;Meiboom&#8722;Gill+sequence+for+characterizing+chemical+exchange+by+NMR+Spectroscopy.">A relaxation-compensated Carr&#8722;Purcell&#8722;Meiboom&#8722;Gill sequence for characterizing chemical exchange by NMR Spectroscopy.</a> Journal of the American Chemical Society. 121 (10), 2331-2332 (1999).</li><li>Hansen, D. F., Vallurupalli, P., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+15N+relaxation+dispersion+experiment+for+the+measurement+of+millisecond+time-scale+dynamics+in+proteins.">An improved 15N relaxation dispersion experiment for the measurement of millisecond time-scale dynamics in proteins.</a> Journal of Physical Chemistry B. 112 (19), 5898-5904 (2008).</li><li>Tugarinov, V., Kanelis, V., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotope+labeling+strategies+for+the+study+of+high-molecular-weight+proteins+by+solution+NMR+spectroscopy.">Isotope labeling strategies for the study of high-molecular-weight proteins by solution NMR spectroscopy.</a> Nature Protocols. 1 (2), 749-754 (2006).</li><li>Niklasson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+analysis+of+NMR+data+using+advanced+line+shape+fitting.">Comprehensive analysis of NMR data using advanced line shape fitting.</a> Journal of Biomolecular NMR. 69, 93-99 (2017).</li><li>Palmer, A. G., Kroenke, C. D., Loria, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+magnetic+resonance+methods+for+quantifying+microsecond-to-millisecond+motions+in+biological+macromolecules.">Nuclear magnetic resonance methods for quantifying microsecond-to-millisecond motions in biological macromolecules.</a> Methods in Enzymology. 339, 204-238 (2001).</li><li>Tollinger, M., Skrynnikov, N. R., Mulder, F. A., Forman-Kay, J. D., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+dynamics+in+folded+and+unfolded+states+of+an+SH3+domain.">Slow dynamics in folded and unfolded states of an SH3 domain.</a> Journal of the American Chemical Society. 123, 11341-11352 (2001).</li><li>Carver, J. P., Richards, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+two-site+solution+for+the+chemical+exchange+produced+dependence+of+T2+upon+the+Carr-Purcell+pulse+separation.">A general two-site solution for the chemical exchange produced dependence of T2 upon the Carr-Purcell pulse separation.</a> Journal of Magnetic Resonance. 6 (1), 89-105 (1972).</li><li>Egner, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+Contrast'+NMR+Reveals+Non-innocent+Role+of+Support+in+Pd/CeO2+Catalyzed+Phenol+Hydrogenation.">Surface Contrast' NMR Reveals Non-innocent Role of Support in Pd/CeO2 Catalyzed Phenol Hydrogenation.</a> ChemCatChem. 12 (6), 4160-4166 (2020).</li><li>Egner, T. K., Naik, P., Nelson, N. C., Slowing, I. I., Venditti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+Insight+into+Nanoparticle+Surface+Adsorption+by+Solution+NMR+Spectroscopy+in+an+Aqueous+Gel.">Mechanistic Insight into Nanoparticle Surface Adsorption by Solution NMR Spectroscopy in an Aqueous Gel.</a> Angewandte Chemie (International Edition in English). 56, 9802-9806 (2017).</li><li>Tugarinov, V., Libich, D. S., Meyer, V., Roche, J., Clore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+energetics+of+a+three-state+protein+folding+system+probed+by+high-pressure+relaxation+dispersion+NMR+spectroscopy.">The energetics of a three-state protein folding system probed by high-pressure relaxation dispersion NMR spectroscopy.</a> Angewandte Chemie (International Edition in English). 54, 11157-11161 (2015).</li><li>Korzhnev, D. M., Kloiber, K., Kanelis, V., Tugarinov, V., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+slow+dynamics+in+high+molecular+weight+proteins+by+methyl-TROSY+NMR+spectroscopy:+application+to+a+723-residue+enzyme.">Probing slow dynamics in high molecular weight proteins by methyl-TROSY NMR spectroscopy: application to a 723-residue enzyme.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3964-3973 (2004).</li><li>Mayzel, M., Ahlner, A., Lundstrom, P., Orekhov, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+backbone+(13)CO+and+(15)N+relaxation+dispersion+at+high+resolution.">Measurement of protein backbone (13)CO and (15)N relaxation dispersion at high resolution.</a> Journal of Biomolecular NMR. 69, 1-12 (2017).</li><li>Pritchard, R. B., Hansen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterising+side+chains+in+large+proteins+by+protonless+(13)C-detected+NMR+spectroscopy.">Characterising side chains in large proteins by protonless (13)C-detected NMR spectroscopy.</a> Nature Communications. 10, 1747 (2019).</li></ol>

تصف هذه المخطوطة البروتوكول المنفذ في المختبر للحصول على 15N RD من البيانات المتعلقة بالبروتينات وتحليلها. وعلى وجه الخصوص، يتم تغطية الخطوات الحاسمة لإعداد عينة NMR، وقياس بيانات NMR، وتحليل ملامح RD. وفيما يلي بعض الجوانب الهامة المتعلقة باقتناء وتحليل تجارب RD. ومع ذلك ، للحصول على وصف ?...

كار بورسيل ميبوم جيل (CPMG) يتم استخدام تجارب تشتت الاسترخاء (RD) على قاعدة روتينية لتوصيف التوازنات التوافقية التي تحدث على مقياس الوقت μs-ms عن طريق التحليل الطيفي NMR الحل1،2،3،4،5. بالمقارنة مع الطرق الأخرى للتحقيق في الديناميات التوافقية ، فإن تقنيات CPMG سهلة التنفيذ نسبيا على مطياف NMR الحديث ، ولا تتطلب خطوات إعداد عينات متخصصة (أي التبلور أو تجميد العينة أو المحاذاة ، و / أو اقتران التكافؤ مع علامة فلورية أو مغناطيسية) ، وتوفر وصفا شاملا للتوازنات التركيبية العائدة للمعلومات الهيكلية والحركية والدينامية الحرارية حول عمليات التبادل. ولكي تقدم تجربة CPMG تقريرا عن التوازن التوافقي، يجب تطبيق شرطين: '1' يجب أن تكون للدورات المعدلة بالرنين المغناطيسي الملاحظة تحولات كيميائية مختلفة في الولايات التي تخضع لتبادل تشكيلي (حالات صغرى) و'2' يجب أن يحدث التبادل في مقياس زمني يتراوح بين ~ 50 ميكروس إلى ~ 10 مللي ثانية. في ظل هذه الظروف، ومعدل الاسترخاء العرضي الملاحظ <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq01v2.jpg"> () هو مجموع R2 الجوهرية (R2 تقاس في غياب ديناميات ميكروس مللي ثانية، <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq02v3.jpg"> ) ومساهمة الصرف إلى الاسترخاء العرضي (Rex). يمكن إخمادمساهمة R ex إلى R2obs تدريجيا عن طريق تقليل التباعد بين النبضات 180 درجة التي تشكل كتلة CPMG من تسلسل النبض ، ويمكن تصميم منحنيات RD الناتجة باستخدام نظرية Bloch-McConnell للحصول على الفرق في التحول الكيميائي بين الدول الصغيرة ، والسكان الكسور في كل ولاية صغيرة ، ومعدلات التبادل بين الدول الصغيرة (الشكل 1)1،2،3.
وقد تم الإبلاغ عن عدة تسلسلات نبض مختلفة وبروتوكولات التحليل في الأدبيات ل15تجارب N CPMG. هنا، يتم وصف البروتوكول المنفذ في المختبر. وعلى وجه الخصوص، سيتم إدخال الخطوات الحاسمة لإعداد عينة NMR، وإعداد واكتساب تجارب NMR، ومعالجة وتحليل بيانات NMR(الشكل 2). لتسهيل نقل البروتوكول إلى مختبرات أخرى، يتم توفير برنامج النبض، ومخطوطات المعالجة والتحليل، وإحدى مجموعات البيانات على سبيل المثال كملفات تكميلية وهي متاحة للتنزيل في (https://group.chem.iastate.edu/Venditti/downloads.html). يتضمن تسلسل النبض المقدم دورة مرحلية من أربع خطوات في كتلة CPMG لقمع القطع الأثرية المعتمدة على الإزاحة6 ويتم ترميزها للحصول على العديد من التجارب المتشابكة. هذه التجارب interleaved لها فترة استرخاء متطابقة ولكن أعداد مختلفة من نبضات إعادة التركيز من أجل تحقيق مختلف الحقول CPMG7. من المهم أيضا ملاحظة أن برنامج النبض الموصوف يقيس 15N R2 من مكون TROSY لإشارة NMR8. عموما، تم تطبيق البروتوكول بنجاح لتوصيف التبادل التوافقي في البروتينات متوسطة وكبيرة الحجم4،5،9،10. بالنسبة للأنظمة الأصغر (<20 كيلودا)، ينصح باستخدام تسلسل النبض الذبذبي الأحادي الترونو نووي (HSQC)11و12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cryoprobe</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>5mm TCI 800 H-C/N-D cryoprobe</td>
			<td>Improve sensitivity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium Oxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>756822-1</td>
			<td>&#62;99.8% pure, utilised in preparing NMR samples and deuterated cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand driven centrifuge</td>
			<td>United Scientific supply</td>
			<td>CENTFG1</td>
			<td>Used to remove any air bubbles or residual liquid stuck on the walls of NMR tube.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Field NMR spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Bruker Avance II 600, Bruker Avance 800</td>
			<td>acquisition of the NMR data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html</td>
			<td>Modeling of the NMR data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR pasteur Pipette</td>
			<td>Corning Incorporation</td>
			<td>7095D-NMR</td>
			<td>Pyrex glass pastuer pipette to transfer liquid sample in NMR tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR tube</td>
			<td>Willmad Precision</td>
			<td>535-PP-7</td>
			<td>5mm thin wall 7&#39;&#39; cylinderical glass tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMRPipe</td>
			<td>Institute of Biosciences and Biotechnology research</td>
			<td>https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html</td>
			<td>NMR data processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPARKY</td>
			<td>University of California, San Francisco</td>
			<td>https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/</td>
			<td>Analysis of the NMR data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tospin 3.2 (or newer)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html</td>
			<td>acquisition software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

15n cpmg relaxation dispersion for the investigation of protein conformational dynamics on the &#181;s-ms timescale

تلعب الديناميكيات التوافقية للبروتين أدوارا أساسية في تنظيم الحفز الأنزيمي ، وربط الليغند ، والتستوستيرون ، والإشارات ، وهي عمليات بيولوجية مهمة. إن فهم كيفية تحكم التوازن بين البنية والديناميكيات للوظيفة البيولوجية هو حدود جديدة في البيولوجيا الهيكلية الحديثة وأشعل العديد من التطورات التقنية والمنهجية. من بين هذه, CPMG الاسترخاء حل التشتت أساليب NMR توفير فريدة من نوعها, معلومات الدقة الذرية على هيكل, الحركية, والديناميكا الحرارية من البروتين تشكيلية التوازنات التي تحدث على مقياس زمني μs-ms. هنا ، تقدم الدراسة بروتوكولات مفصلة للحصول على وتحليل تجربة تشتت الاسترخاء 15N. على سبيل المثال ، يظهر خط أنابيب لتحليل ديناميات μs-ms في المجال C-terminal من البكتيريا Enzyme I.

البروتوكول الموصوف هنا يؤدي إلى الحصول على ملامح RD لكل ذروة في الطيف 1H-15N TROSY(الشكل 3A). من ملامح RD المكتسبة، فمن الممكن لتقدير مساهمة الصرف إلى الاسترخاء العرضي N 15من كل مجموعة أميد العمود الفقري(الشكل 3A،3B). من خلال رسمR السابقين</s...

Watch this Scientific Journal Video about 15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the Ã‚Âµs-ms Timescale at JoVE.com

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the Ãƒâ€šÃ‚Âµs-ms Timescale

هنا، يتم توفير وصف مفصل للبروتوكول المنفذ في المختبر للحصول على وتحليل 15N ملامح التشتت الاسترخاء عن طريق التحليل الطيفي NMR الحل.

15 N CPMG التشتت الاسترخاء للتحقيق في ديناميات تشكيل البروتين على مقياس زمني μs-ms

Protein conformational dynamics play fundamental roles in regulation of enzymatic catalysis, ligand binding, allostery, and signaling, which are important ...

يمكن استخدام هذا البروتوكول للكشف عن الديناميكيات التوافقية للبروتين وتوصيفها، وهي ضرورية لفهم مجموعة كبيرة ومتنوعة من العمليات الخلوية. بالمقارنة مع الطرق الأخرى ، لا تتطلب هذه الطريقة خطوات إعداد عينات متخصصة وتوفر توصيفا شاملا للحراك والديناميكا الحرارية والجوانب الهيكلية للتوازن التأكيدي. CPMG التشتت الاسترخاء يمكن تطبيقها على نطاق أوسع لتوصيف ديناميات تأكيدية في الأحماض النووية والجزيئات الحيوية الأخرى، وكذلك لتوصيف التفاعلات الجسيمات النانوية ليغاند.يستهدف بروتوكولنا مستخدمي CPMG لأول مرة. لذلك فهي نقطة انطلاق جيدة. ومع ذلك، نتوقع من المستخدمين معرفة الخطوات الأساسية لتشغيل تجارب NMR التقليدية.لإعداد تجربة NMR لأول مرة، قم بتنزيل هذه الملفات التكميلية وفك ضغطها أولا. نسخ البتات. vv و trosy_15N_CPMG.vv الملفات في مجلد برنامج نبض لدليل برنامج نبض. افتح برنامج الاستحواذ واستخدم أمر EDC لنسخ تجربة النيتروجين الهيدروجيني 15 HSQC التي تم تشغيلها سابقا إلى تجربة جديدة. استخدم الأمر برنامج النبض لتحميل trosy_15N_CPMG.ملف برنامج نبض vv في التجربة التي تم إنشاؤها حديثا. ثم استخدم الإرشادات من نهاية ملف برنامج النبض لإعداد تجربة CPMG. لإعداد تجربة NMR روتينية، أدخل العينة إلى المغناطيس وتنفيذ جميع خطوات اكتساب NMR الأساسية.تعيين P1 لمدة الهيدروجين الثابت 90 درجة البقول وP7 لمدة النيتروجين 15 الثابت 90 درجة البقول. في نافذة الاستحواذ، قم بتعيين عرض الوسط والعرض الطيفي لأبعاد الهيدروجين والنيتروجين 15. تعيين تأخير الاسترخاء إلى T2 0.7 واستخدام الأمر قائمة VC لإنشاء قائمة أرقام عدد صحيح المقابلة N.After التأكد من أن كل إدخال في القائمة يتوافق مع حقل CPMG مختلفة وفقا لCPMG قدم يساوي 4N مقسوما على D30، تحقق من أن الرقم الأول في القائمة هو صفر.تعيين L8 إلى عدد الإدخالات في قائمة VC، L3 إلى عدد من النقاط الحقيقية للبعد غير المباشر، و 1TD إلى L8 مرات L3 مرتين. لتحسين قمع المياه، تعيين كسب المتلقي إلى واحد واكتب سحب EDC لفتح ملف برنامج نبض. على السطر 91 إزالة الفاصلة المنقوطة السابقة goto 999 وحفظ الملف.باستخدام الأمر GS، قم بضبط معلمات SPDB0 لتقليل كثافة إشارة FID. عند تعديل كثافة الإشارة، أعد إدخال منقوطة عند السطر 91 من ملف برنامج النبض واحفظ الملف. لتحسين SPDB11، تعيين كسب المتلقي إلى واحد وسحب EDC نوع لفتح ملف برنامج نبض.على السطر 168 إزالة الفاصلة المنقوطة السابقة goto 999 وحفظ الملف. باستخدام الأمر GS، قم بضبط معلمات SPDB11 لتقليل كثافة إشارة FID. عند تعديل كثافة الإشارة، أعد إدخال الفاصلة المنقوطة عند السطر 168 واحفظ الملف.لتحسين SPDB2، تعيين كسب المتلقي إلى واحد وأدخل سحب EDC لفتح ملف برنامج نبض. على السطر 179 إزالة الفاصلة المنقوطة السابقة goto 999 وحفظ الملف. باستخدام الأمر GS، قم بضبط معلمات SPDB2 لتقليل كثافة إشارة FID.عند تعديل كثافة الإشارة، إعادة إدخال منقوطة في السطر 179 من ملف برنامج النبض وحفظ الملف. لتحسين PLDB2، تعيين كسب المتلقي إلى واحد وأدخل سحب EDC لفتح ملف برنامج نبض. على السطر 184 إزالة الفاصلة المنقوطة السابقة goto 999 وحفظ الملف.باستخدام الأمر GS، قم بضبط معلمات PLDB2 لتقليل كثافة إشارة FID. عند تعديل كثافة الإشارة، أعد إدخال الفاصلة المنقوطة في السطر 184 من ملف برنامج النبض واحفظ الملف. تشغيل الأمر RGA لتحسين كسب المتلقي.ثم قم بتشغيل الأمر ZG لبدء التجربة. في هذا الرقم، يمكن ملاحظة نتائج ملامح تشتت الاسترخاء المكتسبة لكل ذروة في طيف النيتروجين الهيدروجيني 15 Trosy. من ملامح تشتت الاسترخاء المكتسبة ، من الممكن تقدير مساهمة التبادل في الاسترخاء العرضي النيتروجين 15 لكل مجموعة AMI العمود الفقري.من خلال التخطيط للاسترخاء العرضي على البنية ثلاثية الأبعاد للبروتين قيد التحقيق ، من الممكن تحديد المناطق الهيكلية التي تخضع لتبادل تأكيدي على مقياس الوقت مللي ثانية ميكروثانية. إرجاع النمذجة من منحنيات التشتت الاسترخاء باستخدام المعادلات كارفر ريتشاردز المعلمات الحرارية والحركية على عملية التبادل، مثل السكان كسور من الدول في التوازن ومعدل التبادل بين هذه الدول. ويمكن بعد ذلك أن يكون الاعتماد على درجة الحرارة من هذه المعلمات الحرارية والحركية على غرار باستخدام المعادلات فانت هوف وحلقة I، على التوالي، للحصول على معلومات مفصلة عن حيوية تبادل تأكيدي.ومن الأهمية بمكان تحسين جميع معايير الاستحواذ بعناية، ولا سيما P7. ومن المهم أيضا إنتاج عينات نقية ومتجانسة للغاية لتجنب التشتت الزائف. ويمكن استخدام معلمات الرقائق الحركية والديناميكية الحرارية والكيميائية التي تم الحصول عليها باستخدام هذا البروتوكول لاستخلاص معلومات نشطة وهيكلية عن الأنواع التي تخضع للتبادل التأكيدي. توصيف ديناميات تأكيد البروتين التي تم الحصول عليها من قبل أساليب CPMG يوفر معلومات حاسمة نحو فهم الإشارات والنشاط الأنزيمي، فضلا عن وجهات نظر جديدة لتصميم المخدرات.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the &#181;s-ms Timescale

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

باستخدام سقالة الليبوزومات لإعادة تفاعلات البروتين البروتين، الدهون القريب<em&gt; في المختبر</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

وقت حل التأين electrospray الهيدروجين، الديوتيريوم تبادل الطيف الكتلي لدراسة بنية البروتين وديناميكية

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

طريقة بسيطة لفحص المواد الكيميائية عالية الإنتاجية في ايليجانس كاينورهابديتيس

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

تعريف النشاط وصي ينظم الأكسدة والاختزال في Hsp33 وتعيين التغييرات كونفورماشونال في Hsp33 باستخدام الهيدروجين الديوتريوم التبادل الكتلي

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

ميكروجرافيميتري المسرف لدراسة ديناميات ملزمة فسفوليبيد ملزمة البروتين أنيكسين A2 إلى بليرس الدهن الصلب-يؤيد استخدام جهاز رنان مرو

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

استخدام الأنابيب الفلورية الرنين نقل الطاقة لدراسة ديناميات البروتين المجمعات في مقياس زمني ميلي ثانية

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

تحديد كمية البروتين على نطاق المنظومة وسم التجانس على مستوى جزيء واحد

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

تصور سطح T-خلية مستقبلات ديناميات رباعية الأبعاد باستخدام شعرية الضوء ورقة المجهر

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

دراسة ديناميات التصاق الخلوي وانتشار الخلايا الظهاريه علي الفيبرونكتين اثناء الاكسده

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the ...

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1&#961; Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1ÃƒÂÃ‚Â Relaxation Dispersion Experiments of RNA

الجوانب العملية لإعداد عينة والإعداد من 1H R1ρ تجارب التشتت الاسترخاء من الجيش الملكي النيبالي

RNA is a highly flexible biomolecule, wherein changes in structures play crucial roles in the functions that RNA molecules execute as cellular messengers ...