Name: 15n cpmg relaxation dispersion for the investigation of protein conformational dynamics on the &#181;s-ms timescale
Uploaded: 2021-04-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about 15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the Ã‚Âµs-ms Timescale at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af midler fra NIGMS R35GM133488 og fra Roy J. Carver Charitable Trust til V.V.

1. Forberedelse af NMR-prøven
<ol><li>Udtrykke og rense en 2H,15N-labled prøve af protein af interesse. BEMÆRK: Mens en 15N-mærket proteinprøve kan anvendes til erhvervelse af CPMG RD-eksperimentet, øger perdeuteration (hvor det er muligt) kvaliteten af de opnåede data dramatisk. Protokoller for produktion af perdeutererede proteiner findes i litteraturen13.</li>
	<li>Bufferbytter den rensede proteinprøve til en afgasset NMR-buffer.</li>
	<li>NMR-prøv...

<ol>
	<li>Anthis, N. J., Clore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+transient+dark+states+by+NMR+spectroscopy.">Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (1), 35-116 (2015).</li><li>Lisi, G. P., Loria, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+NMR+spectroscopy+for+the+study+of+enzyme+allostery.">Solution NMR spectroscopy for the study of enzyme allostery.</a> Chemical Reviews. 116 (11), 6323-6369 (2016).</li><li>Mittermaier, A., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+provide+new+insights+in+NMR+studies+of+protein+dynamics.">New tools provide new insights in NMR studies of protein dynamics.</a> Science. 312 (5771), 224-228 (2006).</li><li>Venditti, V., Clore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+selection+and+substrate+binding+regulate+the+monomer/dimer+equilibrium+of+the+C-terminal+domain+of+Escherichia+coli+enzyme+I.">Conformational selection and substrate binding regulate the monomer/dimer equilibrium of the C-terminal domain of Escherichia coli enzyme I.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 26989-26998 (2012).</li><li>Venditti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+interdomain+rearrangement+triggered+by+suppression+of+micro-+to+millisecond+dynamics+in+bacterial+Enzyme+I.">Large interdomain rearrangement triggered by suppression of micro- to millisecond dynamics in bacterial Enzyme I.</a> Nature Communications. 6, 5960 (2015).</li><li>Yip, G. N., Zuiderweg, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+cycle+scheme+that+significantly+suppresses+offset-dependent+artifacts+in+the+R2-CPMG+15N+relaxation+experiment.">A phase cycle scheme that significantly suppresses offset-dependent artifacts in the R2-CPMG 15N relaxation experiment.</a> Journal of Magnetic Resonance. 171 (1), 25-36 (2004).</li><li>Mulder, F. A., Skrynnikov, N. R., Hon, B., Dahlquist, F. W., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+slow+(micros-ms)+time+scale+dynamics+in+protein+side+chains+by+(15)N+relaxation+dispersion+NMR+spectroscopy:+application+to+Asn+and+Gln+residues+in+a+cavity+mutant+of+T4+lysozyme.">Measurement of slow (micros-ms) time scale dynamics in protein side chains by (15)N relaxation dispersion NMR spectroscopy: application to Asn and Gln residues in a cavity mutant of T4 lysozyme.</a> Journal of the American Chemical Society. 123 (5), 967-975 (2001).</li><li>Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+TROSY+CPMG+sequence+for+characterizing+chemical+exchange+in+large+proteins.">A TROSY CPMG sequence for characterizing chemical exchange in large proteins.</a> Journal of Biomolecular NMR. 15 (2), 151-155 (1999).</li><li>Dotas, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+thermophilic/mesophilic+enzymes+reveal+a+role+for+conformational+disorder+in+regulation+of+bacterial+Enzyme+I.">Hybrid thermophilic/mesophilic enzymes reveal a role for conformational disorder in regulation of bacterial Enzyme I.</a> Journal of Molecular Biology. 432 (16), 4481-4498 (2020).</li><li>Purslow, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+site+breathing+of+human+Alkbh5+revealed+by+solution+NMR+and+accelerated+molecular+dynamics.">Active site breathing of human Alkbh5 revealed by solution NMR and accelerated molecular dynamics.</a> Biophysical Journal. 115, 1895-1905 (2018).</li><li>Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+relaxation-compensated+Carr&#8722;Purcell&#8722;Meiboom&#8722;Gill+sequence+for+characterizing+chemical+exchange+by+NMR+Spectroscopy.">A relaxation-compensated Carr&#8722;Purcell&#8722;Meiboom&#8722;Gill sequence for characterizing chemical exchange by NMR Spectroscopy.</a> Journal of the American Chemical Society. 121 (10), 2331-2332 (1999).</li><li>Hansen, D. F., Vallurupalli, P., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+15N+relaxation+dispersion+experiment+for+the+measurement+of+millisecond+time-scale+dynamics+in+proteins.">An improved 15N relaxation dispersion experiment for the measurement of millisecond time-scale dynamics in proteins.</a> Journal of Physical Chemistry B. 112 (19), 5898-5904 (2008).</li><li>Tugarinov, V., Kanelis, V., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotope+labeling+strategies+for+the+study+of+high-molecular-weight+proteins+by+solution+NMR+spectroscopy.">Isotope labeling strategies for the study of high-molecular-weight proteins by solution NMR spectroscopy.</a> Nature Protocols. 1 (2), 749-754 (2006).</li><li>Niklasson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+analysis+of+NMR+data+using+advanced+line+shape+fitting.">Comprehensive analysis of NMR data using advanced line shape fitting.</a> Journal of Biomolecular NMR. 69, 93-99 (2017).</li><li>Palmer, A. G., Kroenke, C. D., Loria, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+magnetic+resonance+methods+for+quantifying+microsecond-to-millisecond+motions+in+biological+macromolecules.">Nuclear magnetic resonance methods for quantifying microsecond-to-millisecond motions in biological macromolecules.</a> Methods in Enzymology. 339, 204-238 (2001).</li><li>Tollinger, M., Skrynnikov, N. R., Mulder, F. A., Forman-Kay, J. D., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Slow+dynamics+in+folded+and+unfolded+states+of+an+SH3+domain.">Slow dynamics in folded and unfolded states of an SH3 domain.</a> Journal of the American Chemical Society. 123, 11341-11352 (2001).</li><li>Carver, J. P., Richards, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+two-site+solution+for+the+chemical+exchange+produced+dependence+of+T2+upon+the+Carr-Purcell+pulse+separation.">A general two-site solution for the chemical exchange produced dependence of T2 upon the Carr-Purcell pulse separation.</a> Journal of Magnetic Resonance. 6 (1), 89-105 (1972).</li><li>Egner, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+Contrast'+NMR+Reveals+Non-innocent+Role+of+Support+in+Pd/CeO2+Catalyzed+Phenol+Hydrogenation.">Surface Contrast' NMR Reveals Non-innocent Role of Support in Pd/CeO2 Catalyzed Phenol Hydrogenation.</a> ChemCatChem. 12 (6), 4160-4166 (2020).</li><li>Egner, T. K., Naik, P., Nelson, N. C., Slowing, I. I., Venditti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+Insight+into+Nanoparticle+Surface+Adsorption+by+Solution+NMR+Spectroscopy+in+an+Aqueous+Gel.">Mechanistic Insight into Nanoparticle Surface Adsorption by Solution NMR Spectroscopy in an Aqueous Gel.</a> Angewandte Chemie (International Edition in English). 56, 9802-9806 (2017).</li><li>Tugarinov, V., Libich, D. S., Meyer, V., Roche, J., Clore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+energetics+of+a+three-state+protein+folding+system+probed+by+high-pressure+relaxation+dispersion+NMR+spectroscopy.">The energetics of a three-state protein folding system probed by high-pressure relaxation dispersion NMR spectroscopy.</a> Angewandte Chemie (International Edition in English). 54, 11157-11161 (2015).</li><li>Korzhnev, D. M., Kloiber, K., Kanelis, V., Tugarinov, V., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+slow+dynamics+in+high+molecular+weight+proteins+by+methyl-TROSY+NMR+spectroscopy:+application+to+a+723-residue+enzyme.">Probing slow dynamics in high molecular weight proteins by methyl-TROSY NMR spectroscopy: application to a 723-residue enzyme.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3964-3973 (2004).</li><li>Mayzel, M., Ahlner, A., Lundstrom, P., Orekhov, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+backbone+(13)CO+and+(15)N+relaxation+dispersion+at+high+resolution.">Measurement of protein backbone (13)CO and (15)N relaxation dispersion at high resolution.</a> Journal of Biomolecular NMR. 69, 1-12 (2017).</li><li>Pritchard, R. B., Hansen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterising+side+chains+in+large+proteins+by+protonless+(13)C-detected+NMR+spectroscopy.">Characterising side chains in large proteins by protonless (13)C-detected NMR spectroscopy.</a> Nature Communications. 10, 1747 (2019).</li></ol>

Dette manuskript beskriver den protokol, der er implementeret i laboratoriet for erhvervelse og analyse af 15N RD-data om proteiner. Navnlig er de afgørende skridt til udarbejdelse af NMR-prøven, måling af NMR-data og analyse af RD-profilerne dækket. Nedenfor diskuteres nogle vigtige aspekter vedrørende erhvervelse og analyse af RD-eksperimenter. Men for en mere dybdegående beskrivelse af eksperimentet og dataanalysen anbefales omhyggelig undersøgelse af den oprindelige litteratur stærkt<sup class="xre...

Carr-Purcell Meiboom-Gill (CPMG) afslapningsspredningseksperimenter (RD) anvendes på en rutinemæssig base til at karakterisere kropsbygningsekvilibrering, der forekommer på μs-ms-tidsskalaen ved opløsning NMR-spektroskopi1,2,3,4,5. Sammenlignet med andre metoder til undersøgelse af kropsbygningsdynamik er CPMG-teknikker relativt lette at implementere på moderne NMR-spektrometre, kræver ikke specialiserede prøveforberedelsestrin (dvs. krystallisering, prøvefrysning eller -justering og / eller kovalent bøjning med en fluorescerende eller paramagnetisk tag) og giver en omfattende karakterisering af kropsbygningsækvivalenter, der returnerer strukturelle, kinetiske og termodynamiske oplysninger om udvekslingsprocesser. For at et CPMG-forsøg kan rapportere om en kropslig ligevægt, skal der gælde to betingelser: (i) de observerede NMR-spins skal have forskellige kemiske skift i de tilstande, der undergår kropsudveksling (mikrostater), og (ii) udvekslingen skal finde sted på en tidsskala fra ~ 50 μs til ~ 10 ms. Under disse omstændigheder er den observerede tværgående afslapningsrate ( <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq01v2.jpg"> ) summen af den iboende R2 (R2 målt i mangel af μs-ms <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq02v3.jpg"> dynamik) og udvekslingsbidraget til den tværgående afslapning (Rex). Rex-bidraget til R2obs kan gradvistslukkes ved at reducere afstanden mellem de 180° impulser, der udgør CPMG-blokken i pulssekvensen, og de resulterende RD-kurver kan modelleres ved hjælp af Bloch-McConnell-teorien for at opnå den kemiske skiftforskel mellem mikrostater, fraktioneret population af hver mikrostat og valutakurserne blandt mikrostater (figur 1)1,2,3.
Flere forskellige pulssekvenser og analyseprotokoller er blevet rapporteret i litteraturen for 15N CPMG eksperimenter. Heri er den protokol, der er implementeret i laboratoriet, beskrevet. Navnlig vil de afgørende skridt til udarbejdelse af NMR-stikprøven, oprettelse og erhvervelse af NMR-eksperimenterne samt behandling og analyse af NMR-dataene blive indført (figur 2). For at lette overførslen af protokollen til andre laboratorier leveres pulsprogrammet, behandlings- og analysescripts og et eksempeldatasæt som supplerende filer og kan downloades på (https://group.chem.iastate.edu/Venditti/downloads.html). Den medfølgende pulssekvens indeholder en fasecyklus i fire trin i CPMG-blokken til undertrykkelse af offsetafhængige artefakter6, og den er kodet til erhvervelse af flere interleaved-eksperimenter. Disse interleaved eksperimenter har en identisk afslapning periode, men forskellige antal refokusering pulser for at opnå forskellige CPMG felter7. Det er også vigtigt at bemærke, at det beskrevne pulsprogram måler 15N R2 i TROSY-komponenten i NMR-signalet8. Samlet set er protokollen med succes blevet anvendt til karakterisering af kropsbygningsudveksling i mellemstore og store proteiner4,5,9,10. For mindre systemer (<20 kDa) er det tilrådeligt at bruge en heteronuklear single quantum sammenhæng (HSQC)-baseret pulssekvens11,12.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cryoprobe</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>5mm TCI 800 H-C/N-D cryoprobe</td>
			<td>Improve sensitivity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium Oxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>756822-1</td>
			<td>&#62;99.8% pure, utilised in preparing NMR samples and deuterated cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand driven centrifuge</td>
			<td>United Scientific supply</td>
			<td>CENTFG1</td>
			<td>Used to remove any air bubbles or residual liquid stuck on the walls of NMR tube.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Field NMR spectrometer</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Bruker Avance II 600, Bruker Avance 800</td>
			<td>acquisition of the NMR data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html</td>
			<td>Modeling of the NMR data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR pasteur Pipette</td>
			<td>Corning Incorporation</td>
			<td>7095D-NMR</td>
			<td>Pyrex glass pastuer pipette to transfer liquid sample in NMR tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR tube</td>
			<td>Willmad Precision</td>
			<td>535-PP-7</td>
			<td>5mm thin wall 7&#39;&#39; cylinderical glass tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMRPipe</td>
			<td>Institute of Biosciences and Biotechnology research</td>
			<td>https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html</td>
			<td>NMR data processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPARKY</td>
			<td>University of California, San Francisco</td>
			<td>https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/</td>
			<td>Analysis of the NMR data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tospin 3.2 (or newer)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html</td>
			<td>acquisition software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

15n cpmg relaxation dispersion for the investigation of protein conformational dynamics on the &#181;s-ms timescale

Protein kropsbygning dynamik spiller grundlæggende roller i reguleringen af enzymatisk katalyse, ligand bindende, allostery, og signalering, som er vigtige biologiske processer. At forstå, hvordan balancen mellem struktur og dynamik styrer den biologiske funktion, er en ny grænse i moderne strukturbiologi og har antændt flere tekniske og metodologiske udviklinger. Blandt disse giver CPMG afslapningsspredningsopløsning NMR-metoder unikke, atomare opløsningsoplysninger om strukturen, kinetik og termodynamik af proteinformationel ligevægt, der forekommer på μs-ms-tidsskalaen. Her præsenterer undersøgelsen detaljerede protokoller for erhvervelse og analyse af et 15N afslapningsspredningseksperiment. Som et eksempel vises rørledningen til analyse af μs-ms-dynamikken i bakteriernes C-terminaldomæne Enzyme I.

Den her beskrevne protokol resulterer i erhvervelse af RD-profiler for hvert højdepunkt i 1H-15N TROSY-spektret (Figur 3A). Ud fra de erhvervede RD-profiler er det muligt at anslå udvekslingsbidraget til den 15N tværgående lempelse af hver rygrad midt i gruppen (Figur 3A,3B). Ved at plotte Rex på 3D-strukturen af det undersøgte protein er det muligt at identificere de strukturelle regioner, der e...

Watch this Scientific Journal Video about 15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the Ã‚Âµs-ms Timescale at JoVE.com

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the Ãƒâ€šÃ‚Âµs-ms Timescale

Her gives en detaljeret beskrivelse af den protokol, der implementeres i laboratoriet til erhvervelse og analyse af 15N afslapningsspredningsprofiler ved løsning NMR-spektroskopi.

15 år N CPMG Afslapning Spredning til undersøgelse af protein kropsbygning Dynamics på μs-ms Tidshorisont

Protein conformational dynamics play fundamental roles in regulation of enzymatic catalysis, ligand binding, allostery, and signaling, which are important ...

Denne protokol kan bruges til detektion og karakterisering af proteinformationsdynamik, som er afgørende for at forstå en lang række cellulære processer. Sammenlignet med andre metoder kræver denne metode ikke specialiserede prøveforberedelsestrin og giver omfattende karakterisering af kinetik, termodynamik og strukturelle aspekter af bekræftelsesligevægt. CPMG afslapning spredning kan anvendes mere bredt til karakterisering af konfirmationsdynamik i nukleinsyrer og andre biomolekyler, samt til karakterisering af ligand nanopartikel interaktioner.Vores protokol er rettet mod første gang CPMG-brugere. Så det er et godt udgangspunkt. Vi forventer dog, at brugerne kender de grundlæggende trin til at køre konventionelle NMR-eksperimenter.Hvis du vil konfigurere et NMR-eksperiment for første gang, skal du først hente og pakke disse supplerende filer ud. Kopier bits. vv og trosy_15N_CPMG.VV-filer i pulsprogrammappen til pulsprogrammappen. Åbn anskaffelsessoftwaren, og brug EDC-kommandoen til at kopiere et tidligere drevet brint nitrogen 15 HSQC-eksperiment til et nyt eksperiment. Brug kommandoen pulse-program til at indlæse trosy_15N_CPMG.vv pulse program fil i den nyoprettede eksperiment. Brug derefter instruktionerne fra slutningen af pulsprogramfilen til at konfigurere CPMG-eksperimentet. Hvis du vil oprette et rutinemæssigt NMR-eksperiment, skal du introducere prøven på magneten og udføre alle de grundlæggende NMR-anskaffelsestrin.Sæt P1 til varigheden af brint hårde 90 graders pulser og P7 til varigheden kvælstof 15 hårde 90 graders pulser. I anskaffelsesvinduet skal du indstille midten og spektralbredden for brint- og nitrogen 15-dimensionerne. Indstil afslapningsforsinkelsen til 0,7 T2, og brug VC-listekommandoen til at oprette en liste over heltalsnumre, der svarer til N.After, der bekræfter, at hver post på listen svarer til et andet CPMG-felt i henhold til CPMG-arkiveret, er lig med gange 4N divideret med D30, kontroller, at det første tal på listen er nul.Angiv L8 til antallet af poster på VC-listen, L3 til antallet af reelle point for den indirekte dimension og 1TD til L8 gange L3 gange to. Hvis du vil optimere vandundertrykkelsen, skal du indstille modtagergevinsten til én og skrive EDC pull for at åbne pulsprogramfilen. Fjern semikolonet før goto 999 på linje 91, og gem filen.Brug GS-kommandoen til at justere SPDB0-parametrene for at minimere intensiteten af FID-signalet. Når signalintensiteten er blevet ændret, skal du genindføre et semikolon ved linje 91 i pulsprogramfilen og gemme filen. Hvis du vil optimere SPDB11, skal du indstille modtagergevinsten til én, og typen EDC-træk for at åbne pulsprogramfilen.Fjern semikolonet før goto 999 på linje 168, og gem filen. Brug GS-kommandoen til at justere SPDB11-parametrene for at minimere intensiteten af FID-signalet. Når signalintensiteten er blevet ændret, skal du genindføre semikolonet ved linje 168 og gemme filen.Hvis du vil optimere SPDB2, skal du indstille modtagergevinsten til én og indtaste EDC-træk for at åbne pulsprogramfilen. Fjern semikolonet før goto 999 på linje 179, og gem filen. Brug GS-kommandoen til at justere SPDB2-parametrene for at minimere intensiteten af FID-signalet.Når signalintensiteten er blevet ændret, skal du genindføre semikolonet ved linje 179 i pulsprogramfilen og gemme filen. Hvis du vil optimere PLDB2, skal du indstille modtagergevinsten til én og indtaste EDC-træk for at åbne pulsprogramfilen. Fjern semikolonet før goto 999 på linje 184, og gem filen.Brug GS-kommandoen til at justere PLDB2-parametrene for at minimere intensiteten af FID-signalet. Når signalintensiteten er blevet ændret, skal du genindføre semikolonet ved linje 184 i pulsprogramfilen og gemme filen. Kør RGA-kommandoen for at optimere modtagerens forstærkning.Kør derefter ZG-kommandoen for at starte eksperimentet. I dette tal kan resultaterne af de afslapningsspredningsprofiler, der er erhvervet for hver top i hydrogen nitrogen 15 Trosy-spektret, observeres. Fra de erhvervede afslapningsspredningsprofiler er det muligt at estimere udvekslingsbidraget til nitrogen 15 tværgående afslapning af hver rygrads-AMI-gruppe.Ved at plotte den tværgående afslapning på 3D-strukturen af det undersøgte protein er det muligt at identificere de strukturelle regioner, der gennemgår bekræftelsesudveksling på mikrosekund millisekund tidshorisonten. Modellering af afslapning spredning kurver ved hjælp af Carver-Richards ligninger returnerer termodynamiske og kinetiske parametre på udvekslingsprocessen, såsom fraktioneret populationer af de stater i ligevægt og valutakursen blandt disse stater. Temperaturafhængigheden af disse termodynamiske og kinetiske parametre kan derefter modelleres ved hjælp af henholdsvis van't Hoff- og I-ring-ligningerne for at få detaljerede oplysninger om energiske bekræftelsesudvekslinger.Det er afgørende at optimere alle anskaffelsesparametrene, især P7. Det er også vigtigt at producere meget rene og homogene prøver for at undgå falske dispersioner. De kinetiske, termodynamiske og kemiske chipparametre, der opnås ved hjælp af denne protokol, kan bruges til at udlede energiske og strukturelle oplysninger om de arter, der gennemgår bekræftelsesudvekslingen. Karakterisering af proteinbekræftelsesdynamikken opnået ved CPMG-metoder giver afgørende oplysninger om forståelse af signalering og enzymatisk aktivitet samt nye perspektiver for lægemiddeldesign.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the &#181;s-ms Timescale

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Brug Stillads Liposomer at Rekonstituer Lipid-proksimal protein-protein interaktioner<em&gt; In vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrosprayioniserings Brint-deuterium Exchange-massespektrometri til at studere proteiners struktur og Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

En simpel metode til High Throughput kemisk Screening i Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Definere Hsp33's Redox-regulerede anstandsdame aktivitet og kortlægning konformationelle ændringer på Hsp33 ved hjælp af brint-deuterium Exchange massespektrometri

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Antistatiske Microgravimetry at studere bindende dynamikken i Phospholipid bindende Protein Annexin A2 til fast-understøttet Lipid dobbeltlag ved hjælp af et Quartz Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Bruger i Vitro fluorescens resonans energioverførsel at studere dynamikken i proteinkomplekser på en millisekund tidsskala

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom-wide kvantificering af mærkning homogenitet på enkelt-molekyle niveau

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Visualisere Surface T-Cell Receptor Dynamics Fire-Dimensionelt Ved hjælp af gitter light-sheet mikroskopi

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

Undersøge dynamikken i cellulære vedhæftning og spredning af Epiteliale celler på Fibronectin under oxidativ stress

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the ...

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1&#961; Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1ÃƒÂÃ‚Â Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Praktiske aspekter af prøveforberedelse og opsætning af 1H R1ρ Afslapningsspredningseksperimenter af RNA

RNA is a highly flexible biomolecule, wherein changes in structures play crucial roles in the functions that RNA molecules execute as cellular messengers ...